配对免疫球蛋白样受体B调节髓源性抑制细胞的抑制功能和命运

骨髓MDSC和脾脏MDSC的不同表型利尔布3^−/−荷瘤小鼠

为了确定PIR-B是否参与MDSC介导的Treg细胞激活，我们利用野生型（WT）和利尔布3^−/−Lewis肺癌（LLC）荷瘤小鼠。从WT和里尔3^−/−评价荷瘤小鼠的抑瘤作用。来自WT骨髓的MDSC和利尔布3^−/−荷瘤小鼠对卵清蛋白（OVA）肽的反应都将OTII T细胞增殖抑制到相似的程度(P（P）= 0.18) (图2A)，而，脾脏利尔布3^−/−与WT脾脏MDSC相比，MDSC的抑制活性降低(P（P）< 0.05). 同样，骨髓源性MDSC诱导Treg细胞在利尔布3^−/−和WT MDSC（21.5±0.6 vs.21.1±2.1），而比较时观察到Treg细胞诱导减少利尔布3^−/−WT脾MDSC，（6.0±0.5 vs.10.7±0.6，P<0.001）(图2B).

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图2

利尔布3^−/−脾脏MDSC而非骨髓源性MDSC表现出M1表型

A）使用来自携带肿瘤的WT和利尔布3^−/−骨髓（左）和脾脏（右）。用OT-II肽刺激的幼稚OT-II转基因小鼠脾细胞共培养。每分钟扩散计数：CPM×1000，Bars和SD，来自三个重复的微孔。N=7，第页= 0.8788B）WT和里尔3^−/−来自骨髓和脾脏的MDSC与OT-II脾细胞以1:4的比例共培养5天，然后用CD4、CD25和Foxp3抗体染色。CD4⁺细胞群被选通以显示Treg细胞百分比。所提供的数据来自七个可重复实验中的一个。C）利尔布3^−/−脾脏MDSC表现为M1表型。WT的脾MDSC或利尔布3^−/−培养荷瘤小鼠在没有任何刺激的培养基中24小时。测定培养上清液中精氨酸酶活性、IL-10、NO和TNFα的产生。D）纯化的脾脏MDSC进行清道夫受体B（CD36）、甘露糖受体（CD206）、IL-4R、Tie2、PDL1、CD80、CD86、MHCⅡ类和CC7染色。在Gr-1中评估表达⁺CD115型⁺细胞群体。灰色线：同型对照，蓝色线：野生型MDSC，红色线：利尔布3^−/−MDSC。数据来自三个可重复实验中的一个。E）利用GAPDH内部对照（*，P（P）< 0.05; ***, P<0.001）。

基于这些结果，我们假设MDSC的功能和分化可能受到PIR-B的调节，特别是当MDSC从骨髓迁移到外周淋巴器官和肿瘤微环境时。我们还比较了来自WT和利尔布3^−/−老鼠。在WT荷瘤小鼠中，脾脏MDSC表现出较高的ARG1活性(P（P）<0.001）和IL-10(P（P）<0.01）分泌，但iNOS活性较低(P（P）<0.001）和TNF-α分泌(P（P）<0.001），表明MDSC在WT小鼠中优先分化为M2样表型，在WT鼠中优先分化成M1样表型利尔布3^−/−老鼠(图2C).里尔3^−/−脾脏MDSC表达的M2标记物CD36、CD206、Tie2和CCR2数量低于WT MDSC，但M1标记物CCR7数量高于WT MDSCs(图2D，E). 我们还测量了干扰素-γ受体（IFN-γR）和白细胞介素-4受体（IL4-R）的表达，其信号分别促进M1和M2极化。IL-4R表达较低，而IFN-γR在利尔布3^−/−MDSC公司(图2D). 尽管在WT和WT之间没有观察到IL-10R表达的差异利尔布3^−/−MDSC公司(图2D)，IL-10表达显著降低利尔布3^−/−MDSC可以解释M1定向表型(图2C). 然而，骨髓源性MDSC没有观察到这种差异(图S1A). 从肿瘤中分离出的MDSC利尔布3^−/−小鼠也失去了诱导Treg细胞和抑制T细胞增殖的能力体内在OTII转基因小鼠中(图S1B).

这些结果表明利尔布3^−/−MDSC在荷瘤小鼠退出骨髓后，倾向于M1，而非M2表型。为了确定骨髓生长和分化因子，如巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），是否可以决定巨噬细胞极化在体外，等级-1⁺CD115型⁺从小鼠骨髓和脾脏纯化的单核细胞利尔布3^−/−或WT幼鼠在M-CSF或GM-CSF存在下培养。在存在M-CSF的情况下，骨髓和脾脏利尔布3^−/−与WT单核细胞相比，单核细胞优先进行M1样分化，iNOS和TNF-α的表达量显著增加，精氨酸酶和IL-10的生成减少(图S1C). 有了GM-CSF，利尔布3^−/−骨髓单核细胞产生的iNOS和TNF-α显著增多，而精氨酸酶和IL-10的产生没有差异(图S1D). 这些结果表明幼稚小鼠优先获得M1样表型利尔布3^−/−单核细胞。此外，M-CSF可能在WT巨噬细胞向M1和M2表型的极化中发挥作用，而GM-CSF可能只促进M1定向表型。

肿瘤生长迟缓和M1表型MDSC利尔布3^−/−荷瘤小鼠

自体内的抑制功能利尔布3^−/−MDSC弱于WT，我们检测了PIR-B缺陷是否对肿瘤生长有任何影响。肿瘤生长速度在利尔布3^−/−小鼠与WT小鼠的长期比较(图3A). 为了确定这种作用是否与在利尔布3^−/−MDSC，我们直接从这些肿瘤中分离出MDSC。肿瘤滤过利尔布3^−/−MDSC表达的iNOS数量显著增加(P（P）<0.05），肿瘤坏死因子-α(P（P）<0.01），IL-12(P（P）<0.01）和IL-1-β(P（P）<0.01），ARG1的数量显著降低(P（P）<0.01）和IL-10(P（P）<0.01）与WT MDSC相比，通过定量实时聚合酶链反应（PCR）进行评估(图3B). 我们还检测了几种M2表面标记的表达，如CD36、CD206、Tie2和IL-4R(Guruvayoorappan，2008年;Kodumudi等人。;Mantovani等人，2009年;Mantovani等人，2002年;Sica等人，2008年)流式细胞术检测。利尔布3^−/−肿瘤浸润性MDSC表达的CD36、CD206、Tie2和IL-4R低于WT MDSC(图3C). LLC肿瘤组织的免疫荧光染色证实了这些结果(图3D). CCR7被用作M1巨噬细胞的标记物，CD206被用作M2标记物，并用CD11b联合染色来鉴定MDSC。CD206在WT小鼠肿瘤组织中高表达，而CCR7在WT鼠肿瘤组织中占优势利尔布3^−/−老鼠。这两个标记与CD11b共同定位⁺髓系细胞，表明WT荷瘤小鼠的MDSC具有M2表型，而来自利尔布3^−/−小鼠与M1巨噬细胞更相似。通过评估巨噬细胞标志物F4/80、iNOS（M1）和精氨酸酶1（M2）的表达，进一步证实了这些观察结果。

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图3

利尔布3^−/−肿瘤环境抑制肿瘤生长并产生M1极化MDSC

A）LLC肿瘤植入WT皮下或利尔布3^−/−小鼠（n=6）和肿瘤大小每6天测量一次，持续30天。*，P（P）< 0.05; **, P<0.01。B）对Gr-1进行实时定量PCR⁺CD115型⁺与TIL隔离的MDSC。根据β-actin计算相对拷贝数。黑色列：WT TIL MDSC，白色列：利尔布3^−/−TIL MDSC。提供的数据来自四个可重复实验之一，**，P<0.01。C）来自WT的TIL或利尔布3^−/−对肿瘤组织进行Gr-1、CD115、CD36、CD206、Tie2和IL-4R染色。通过直方图比较这些蛋白的表达。灰线：同型对照，蓝线：WT MDSC，红线：里尔3^−/−MDSC。所示数据来自四个可重复实验之一。D类)WT或利尔布3^−/−老鼠。CD11b、CD206、CCR7分别与DAPI共定位或合并，每组检测4个标本。E）单核细胞MDSC介导的肿瘤细胞毒性。肿瘤杀伤活性以肿瘤细胞死亡百分比来衡量。所示数据来自四个可重复实验中的一个。F）MDSC过继性细胞移植对皮下LLC肿瘤生长的影响。通过比较MDSC转移组和MDSC过继转移组进行学生t检验(*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01).G）MDSC过继转移对肺转移的影响。上面板：治疗小鼠的长期存活率。下面板：肺部重量。小鼠的存活率利尔布3^−/−MDSC显著高于注射有WT MDSC的小鼠的MDSC（对数秩检验，P（P）= 0.0036). 第25天，处死具有代表性的小鼠并测量肺重量。小鼠肺部接受利尔布3^−/−MDSC的重量明显低于接受PBS或WT MDSC的小鼠(**P（P）< 0.01).

已排序利尔布3^−/−直接从肿瘤浸润白细胞（TIL）分离的MDSC对亲代肿瘤细胞的直接杀伤活性也高于从WT小鼠分离的MDSCs(图3E). 这表明利尔布3^−/−肿瘤中的MDSC表现出M1样表型，表达大量促炎细胞因子，并具有直接的细胞溶解功能，表明它们可能具有肿瘤杀伤活性。

自从M1巨噬细胞被证明具有杀瘤活性以来(Sinha等人，2005年b)，我们评估了利尔布3^−/−等级-1⁺CD115型⁺皮下和肺转移瘤模型中的单核细胞MDSC。收养转移后，里尔3^−/−等级-1⁺CD115型⁺单核MDSC显著抑制皮下肿瘤的生长(图3F,P（P）=0.014（第35天），延长生存率(图3G上面板，P（P）=0.0036），并抑制受体小鼠的肺转移(图3G、下部面板、，P（P）< 0.001). 有趣的是，WT单核细胞MDSC和利尔布3^−/−赖氨酸6G⁺与未接受过继细胞移植的对照小鼠相比，粒细胞MDSC对肿瘤生长或肺转移有显著影响。

接下来，我们试图阐明肿瘤生长迟缓和抗肿瘤反应增强的机制利尔布3^−/−荷瘤小鼠。MaFIA（巨噬细胞Fas诱导的凋亡）小鼠，其内源性CD115⁺单核MDSC标记有绿色荧光蛋白，可以通过使用交联试剂AP20187耗尽(Pan等人。)，被选中。将CD45.1 OT-II T细胞过继性转移到患有预先存在的OVA-LLC肿瘤的MaFIA小鼠中，然后去除CD115⁺细胞，有或没有使用CD115重建⁺来源于WT或利尔布3^−/−荷瘤小鼠。过继移植10天后，对肿瘤浸润白细胞（TIL）和脾细胞进行CD45.1染色⁺CD4细胞⁺CD25型⁺Foxp3基因⁺抗原特异性Treg细胞。在CD115中⁺耗尽组，Treg细胞数量显著减少(图4A-C,P（P）<0.0001）和肿瘤重量(图4C,P（P）<0.0001），并显著增加抗原特异性T细胞的增殖(图4D，<0.0001）。在WT MDSC采用转移组中，MDSC的存在弥补了CD115的消耗⁺导致Treg细胞数量增加、肿瘤重量增加和抗原特异性T细胞反应抑制的细胞，类似于模拟耗竭对照组。有趣的是利尔布3^−/−MDSC过继转移组TIL人群中Treg细胞明显较少(图4A、B;TIL中P<0.001）和脾脏（P=0.022，数据未显示），降低肿瘤重量(图4C;P<0.001）和强抗原特异性T细胞增殖(图4D;P<0.001），与接受WT MDSC的小鼠进行比较。结果与CD115缺失的MaFIA小鼠相似，这些小鼠没有用MDSC重建，表明MDSC来自利尔布3^−/−小鼠在肿瘤微环境中不能抑制抗肿瘤免疫。由于M2巨噬细胞促进肿瘤血管生成，我们评估了接受WT或利尔布3^−/−MDSC免疫荧光染色。与来自WT-MDSC转移组的组织相比，来自WT-MDC转移组的肿瘤组织显示出更显著的血管，如CD31染色增强所示利尔布3^−/−MDSC传输组(图4E).

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图4

PIR-B对MDSC介导的Treg细胞扩增、免疫抑制和肿瘤促进至关重要

携带OVA-LLC的MaFIA小鼠（CD45.2）未经治疗或CD115耗尽⁺细胞，然后过继转移CD45.1 OT-II T细胞并用WT或利尔布3^−/−MDSC。A）肿瘤（OVA）特异性CD4⁺CD25型⁺Foxp3系列⁺肿瘤和脾脏中的Treg细胞。分离TIL并用CD45.1、CD4、CD25和Foxp3抗体或同型对照进行染色，然后用流式细胞仪进行分析。CD45.1上的等高线图被选通⁺CD4细胞⁺人口。提出了三个可重复实验中的一个（每组6–7个）。B）肿瘤（OVA）特异性Treg细胞在肿瘤中的百分比（第四栏与第三栏）C）肿瘤重量。从荷瘤小鼠中切除肿瘤并称重（第四栏与第三栏）。数据来自三个可重复实验（n=6）。D）受体MaFIA小鼠肿瘤特异性T细胞增殖反应（OT-II）。CD45.1型⁺从受体小鼠的脾脏中重新分离OT-II T细胞，并用OVA肽（1μg/mL）在照射过的原始脾细胞存在下刺激3天。用脉冲处理细胞[^三H] -培养最后8小时的胸苷（第四列与第三列**P（P）= 0.003).E）通过免疫荧光CD31（红色）染色和DAPI（蓝色）背景评估注射WT或里尔3^–/–MDSC。

PIR-B缺乏对STAT和Toll样受体信号转导的影响

利尔布3^−/−小鼠表现出高反应性B细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和肥大细胞，这可归因于未能招募酪氨酸磷酸酶SHP-1，SHP-1向janus激酶（JAK）-STAT通路传递构成性抑制信号(布兰切特等人，2009年;David等人，1995年;Dong等人，2001年). 在利尔布3^−/−MDSC中STAT1的磷酸化上调，而STAT3的磷酸化经IL-10刺激后显著降低。在存在STAT1激活细胞因子（如IFN-γ）或STAT3激活细胞素（如IL-10）的情况下，这种作用更为深远(图5A、B). 在炎症条件下也观察到这些差异。我们还检测了toll样受体4（TLR4）通路，该通路在M1巨噬细胞分化中起作用(Mantovani等人，2004年;Martinez等人，2008年).利尔布3^−/−脾脏来源的MDSCs在脂多糖（LPS）刺激下表现出细胞外信号调节激酶（ERKs）、p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和NF-κB的磷酸化增加，通过STAT6磷酸化测量，对IL-13介导的刺激的反应最小(图5C). 因此，在缺乏功能性PIR-B的情况下，TLR4和IFN-γ炎症反应上调。增强的TLR4和IFN-γ信号抑制STAT3激活并推动利尔布3^−/−MDSC朝向M1极化。

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图5

PIR-B通过Jak/STAT和TLR途径调节MDSC中M1和M2极化

A和C)使用IFN-γ（50 ng/ml）、IL-10（50 ng/ml）、IL-13（50 ng/ml）或LPS（100 ng/ml。B）纯化的MDSC用IFN-γ（50 ng/ml）或IL-10（50 ng/ml）处理10分钟，然后进行p-STAT1和p-STAT-3的细胞内磷酸化染色。细线：同型对照，灰色线：WT MDSC，黑色线：利尔布3^−/−MDSC。计算MFI（第二列与第一列，*p=0.030，第四列与第三列，**p=0.005），所示数据来自五个可重复实验之一。

Treg细胞分离和羧基荧光素二乙酸酯、琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记

通过CD4分离Treg细胞⁺CD25型⁺调节性T细胞隔离试剂盒（德国Miltenyi Biotec）。简言之，通过阴性选择从脾脏富集CD4+T细胞，然后对CD25-PE抗体进行染色并与抗-PE微球结合。CD4细胞⁺CD25型⁺通过阳性选择纯化细胞。Treg细胞在37°C下用CFSE（PBS中2μM）标记10分钟，然后用完全培养基洗涤3次。CFSE标记的纯化CD4⁺CD25型⁺Treg细胞与MDSC以4:1的比例在OVA肽（0.5μg/ml）和IL-2（100 U/ml）的存在下培养4天。通过流式细胞术评估增殖（CFSE稀释）。

肽和抗体

OVA肽（ISQAVHAAHAEINEAGR）购自AnaSpec（加利福尼亚州弗里蒙特）。小鼠抗Gr-1别藻蓝蛋白（APC）或异硫氰酸荧光素（FITC）、小鼠抗CD4 FITC、小鼠抗CD 115藻红蛋白（PE）或APC、小鼠抗F4/80-FITC、小鼠抗CD11b-APC或FITC、鼠抗CD25-APC、鼠抗Foxp3-PE、鼠抗CD 36 Alexa Fluor 647、鼠抗Tie2-生物素、鼠抗-CD11c FITC或PE-Cy7、，和等型匹配的单克隆抗体购自eBioscience（加州圣地亚哥），PE结合抗PIR、抗磷酸STAT3（pY705）和抗磷酸STAT1（pY701）购自BD Biosciens（加州圣何塞），抗CD206-生物素购自AbD Serotec（北卡罗来纳州罗利）。

MDSC和肿瘤浸润性T细胞的分离

处死小鼠，采集脾脏、胫骨和股骨。在红细胞（RBC）溶解后，按照之前描述的Percoll（GE Healthcare，Piscataway，NJ）密度梯度对骨髓细胞和脾细胞进行分离(Huang等人，2006年). 40–50%的细胞带标记为分数1，50–60%标记为分数2，60–70%标记为分数3。通过抗CD115-PE和抗PE微球（Miltenyi Biotec，Auburn，CA）从组分2中阳性筛选出MDSC，其中包括主要的Ly6C高和一些Ly6C低群体图S4如前所述，从肿瘤组织中分离出TIL(Ozao-Choy等人，2009年)并如上所述进行选择。在随后的实验中使用之前，细胞被分选到>90%纯度。

MDSC抑制试验

如前所述，在多肽介导的TCR转基因T细胞增殖中评估MDSC的抑制活性(Huang等人，2006年). 简言之，脾细胞（1×10⁵)OT-II小鼠在OVA肽（1μg/mL）和辐照（2000rad）MDSCs的系列稀释液存在下，在96孔微孔板中培养。用脉冲处理细胞[^三H] -胸腺嘧啶在3天培养的最后8小时内。

MDSC激活Treg细胞

脾细胞（4×10⁶)将OT-II小鼠在OVA肽（1μg/mL）存在下培养，并照射MDSC（2000 rad）（1×10⁶)在12孔微孔板中。5天后，收获细胞并用荧光铬缀合的抗CD4、抗CD25和抗Foxp3或同种型对照染色，然后进行流式细胞术。

ELISA公司

按照制造商的说明，使用小鼠IL-10和TNFαELISA试剂盒（eBioscience）测量培养上清液中的细胞因子浓度。使用Griess试剂系统（加利福尼亚州圣路易斯奥比斯波市Promega）测量NO生成，使用Quantichrom™精氨酸酶分析试剂盒（加利福尼亚州海沃德市BioAssay Systems）测量精氨酸活性。

细胞毒T淋巴细胞（CTL）检测

分类CD115⁺使用MACS珠纯化（Miltenyi Biotec）从肿瘤中分离MDSC，并与LLC肿瘤细胞（靶细胞）在20:1和10:1共同培养4小时。收集上清液以测量乳酸脱氢酶释放（CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒，Promega）。特定杀伤（%）计算为实验LDH释放/最大LDH释放。

过继转移实验

在OVA-LLC MaFIA肿瘤模型中，MaFIA小鼠(Burnett等人，2004年)将OVA-LLC肿瘤细胞植入肝内。当肿瘤达到7×7至9×9 mm时²，CD115⁺通过注射AP20187耗尽细胞，AP20187在CD115启动子的转录控制下交联转基因自杀蛋白并诱导胱天蛋白酶8依赖性细胞凋亡（10mg/kg体重；ARIAD Pharmaceuticals，Cambridge，MA）。在同一天，将WT或利尔布3^−/−MDSC（5×10⁶每只小鼠）在MDSC转移后两天静脉注射纯化CD45.1⁺OT-II T细胞（5×10⁶每只小鼠）经尾静脉注射，两天后再注射第二剂量MDSC。最后一次注射MDSC五天后，处死小鼠。测量肿瘤重量。通过流式细胞术评估肿瘤中肿瘤特异性（OT-II）Treg细胞的存在。纯化脾肿瘤特异性（OT-II）CD45.1的增殖反应⁺根据标准对存在OVA肽和辐照过的幼稚脾细胞的T细胞进行评估^三H胸苷掺入试验。

评估利尔布3^−/−MDSCs，LLC肿瘤细胞（1×10⁵)分别经皮下或尾静脉注射到野生型C57BL6小鼠体内，建立皮下和肺转移瘤模型。在肿瘤细胞注射后第5、10和15天，5×10⁶单核MDSC（Gr-1⁺CD115型⁺)或粒细胞MDSC（Ly6G⁺)来自野生型或利尔布3^−/−荷瘤小鼠经尾静脉注射过继转移。随访肿瘤大小。在肺转移模型中。处死小鼠，然后气管内注射15%印度墨水（美国MasterTech）。采集肺组织，在水中清洗5分钟，然后在Feket溶液中固定（70%乙醇，3.7%甲醛，0.75 M冰醋酸）。通过肺组织重量评估肺转移。

逆转录PCR和定量实时PCR

靶细胞在Trizol试剂（Invitrogen）中均质，并提取总RNA。使用DNAse I（Invitrogen）消化DNA，并使用SuperScript™III第一链合成SuperMix进行qRT-PCR（Invit罗gen）逆转录。使用实时定量PCR测定mRNA的相对数量（SYBR®Green PCR Master Mix，Applied Biosystems，Foster City，CA），以β-actin作为内部对照。引物购自Integrated DNA Technologies（IA Coralville）。

肿瘤组织免疫染色

野生型和非野生型LLC肿瘤组织的免疫染色利尔布3^−/−使用生物素化抗CD206（Abd-Serotec，NC）、抗CD11b（eBioscience，CA）、抗CCR7、抗F4/80（Santa Cruz biotechs，CA），抗iNOS和抗精氨酸酶1（BD Bioscienses，CA）进行小鼠试验，然后使用Cy3-共轭链霉亲和素，Cy2偶联的驴抗大鼠和Cy5偶联的驴抗山羊（Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA）。内皮细胞染色采用大鼠抗鼠CD31，随后采用Cy3-偶联驴抗鼠IgG（Jackson ImmunoResearch）。使用Leica DM RA2荧光显微镜（Leica Microsystems，Wetzlar，德国），在100×0.033和40×/0.85的HC PLAN APO透镜和Klear Mount介质（GBI，Mukilteo，WA）下观察载玻片。使用哈马松ORCAER数码相机（明尼苏达州明尼阿波利斯）C4742-80-12AG型采集图像，并使用Openlab 5.02版（马萨诸塞州沃尔瑟姆Improvision）进行处理。

蛋白质印迹分析

样品在十二烷基硫酸钠（SDS）–10%聚丙烯酰胺凝胶中运行，并转移至硝化纤维素膜。膜在Superblock阻断缓冲液（伊利诺伊州罗克福德的Thermo Scientific）中被阻断，并与适当的抗体孵育，然后是与辣根过氧化物酶结合的二级抗体。使用ECL系统（Thermo Scientific）显示免疫反应带。

我们感谢Clifford A.Lowell博士和Toshiyuki Takai博士提供PIR-B敲除小鼠，感谢Marcia Meseck女士对本手稿的友好编辑，感谢Hong-Ming Hu博士提供OVA-LLC细胞系。这项工作的部分支持来自国家癌症研究所、黑人家庭干细胞基金会和辉瑞研究基金会对S.H.Chen的资助，以及苏珊·G·科门乳腺癌基金会对潘平英的资助