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美国生理学杂志心脏循环生理学。2011年3月；300（3）：H718–H724。
2010年12月10日在线发布。 数字对象标识：10.1152/ajpheart.00393.2010
预防性维修识别码：下午3064310
PMID：21148769

抗高血压治疗增加血管紧张素Ⅱ融合型高血压大鼠小动脉四氢生物蝶呤水平和NO/cGMP信号

Kyu-Tae Kang公司,1 詹妮弗·沙利文,1 弗兰克·T·斯普拉德利,1 利维乌斯V.d'Uscio,2 兹沃尼米尔·卡图西奇,2和詹妮弗·波洛克通讯作者1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

我们之前报道过高血压大鼠肠系膜小动脉增加了NOS衍生的H2O（运行）2减少NO/cGMP信号。我们假设抗高血压治疗通过四氢生物蝶呤（BH）降低血压4)-恢复小动脉中NO/cGMP信号和内皮NOS（NOS3；eNOS）磷酸化的依赖性机制。为了验证这一假设，对血压正常大鼠（NORM）、血管紧张素Ⅱ融合大鼠（ANG）、接受三联疗法（利血平、氢氯噻嗪和肼屈嗪）的ANG大鼠或口服BH的ANG鼠的肠系膜小动脉进行了研究4对治疗方法进行了研究。三联疗法和口服BH4治疗减弱了ANG大鼠收缩压的升高，并恢复了小动脉中的NO/cGMP信号。三联疗法显著增加血管BH4水平和BH4-至BH2与患有BH的ANG大鼠的比率相似4补充。此外，三联疗法（但不是口服BH4治疗）显著增加了小动脉中GTP环水解酶I（GTPCH I）的活性，但没有改变其表达。与NORM相比，ANG小动脉中Ser1177处的NOS3磷酸化降低，而ANG和NORM中Ser633和Thr495处的NOP3磷酸化相似。通过三联疗法或口服BH可恢复Ser1177的NOS3-磷酸化4ANG大鼠。总之，降压治疗通过增加BH来调节小动脉中的NO/cGMP信号4Ser1177的NOS3磷酸化水平。

关键词：高血压、一氧化氮合酶、肠系膜小动脉、三联疗法

一氧化氮（no）/环鸟苷单磷酸（cGMP）信号调节多种血管功能。NO生成和/或生物利用度降低导致许多心血管疾病（包括高血压）的血管功能障碍。一氧化氮合酶（NOS）介导的血管舒张功能丧失与从高血压动物模型研究的导管动脉中NO生物利用度降低和NO/cGMP信号降低相关(23,27). 相比之下，我们(20,34)先前的报道表明，高血压大鼠的小动脉通过激活NOS衍生的H来维持NOS介导的血管舒张2O（运行）2然而，小动脉中的NO/cGMP信号仍然减少。尽管我们和其他人之前已经证明，在高血压动物模型（如血管紧张素II融合型高血压大鼠（ANG；Ref。38)，DOCA-盐诱导高血压大鼠(38)，自发性高血压大鼠（SHR；参考。29)和动脉粥样硬化载脂蛋白E（apo E）缺乏小鼠(24). 这些数据表明，除了NOS蛋白表达减少之外，还有一种机制导致小动脉中NO/cGMP信号传导减少。本研究的目的是阐明在高血压条件下驱动小动脉中NO/cGMP信号减少的分子机制。

四氢生物蝶呤（BH4)是调节NOS活性的重要辅因子。伯克希尔哈撒韦4通过两条不同的途径合成：从头合成途径和补救途径。在内皮细胞中，BH4三磷酸鸟苷环水解酶I（GTPCH I）是BH从头合成中的一种速率限制酶，其活性可调节BH的水平4(5). BH减少4通过降低GTPCH I活性和/或增加BH来达到水平4氧化为7,8-二氢生物蝶呤（BH2). 伯克希尔哈撒韦2也可能在BH竞争与NOS的绑定4从而促进NOS解耦和NO生成损失(22,41). 几项研究表明，BH降低4和相应增加的BH水平2存在于糖尿病大鼠的主动脉中(37)和高血压小鼠(23). Laursen等人(24)已经证明动脉粥样硬化载脂蛋白E缺乏小鼠主动脉中过氧亚硝酸盐的增加会氧化血管BH4至BH2从而解耦NOS活性，导致内皮依赖性舒张功能受损。相反，内皮特异性GTPCH I过度表达可减弱血压升高并保护BH4盐敏感性高血压模型中NOS3磷酸化水平和血管舒张(9). 众所周知，小动脉有多种内皮依赖性血管舒张途径；因此，与导管血管相比，高血压条件下一氧化氮合酶的激活和内皮功能障碍很可能受到不同的调节(12,18,20,26). 很少有研究关注伯克希尔哈撒韦4-小动脉中NO/cGMP信号的依赖性变化。

NOS3多位点的磷酸化是NOS3活性的另一个关键决定因素。牛主动脉内皮细胞中NOS3在Ser1177和Ser633的磷酸化和在Thr495的去磷酸化刺激NOS3活性，从而增加NO/cGMP信号(28). 在高血压模型（如双肾单夹高血压大鼠）的导管动脉中观察到NOS3（主要是Ser1177）磷酸化的改变(16)和DOCA盐性高血压大鼠(34). 然而，关于高血压条件下小动脉NOS3磷酸化变化的信息很少。

我们有兴趣解读血压变化与小动脉NOS3调节之间的动态关系。具体来说，人们对血压本身是否影响BH缺乏了解4/伯克希尔哈撒韦2小动脉中NOS3的水平和磷酸化。我们假设抗高血压治疗通过BH降低血压4-恢复小动脉NO/cGMP信号和NOS3磷酸化的依赖机制。我们用BH治疗ANG大鼠4分别通过特异性或非特异性机制补充或三联疗法（利血平、氢氯噻嗪和肼嗪）来降低血压。生物蝶呤总量，BH4，伯克希尔哈撒韦2在分离的肠系膜小动脉中评估GTPCH I活性和表达，并测量血管NOS信号，包括：cGMP积累、NOS3蛋白单体-二聚体比率和NOS3磷酸化。

方法

动物模型。

雄性Sprague-Dawley大鼠（200–250 g；Charles River Laboratories，Wilmington，MA）被分为四组：血压正常大鼠（NORM）、ANG、ANG联合三联疗法（ANG+TT），如下所示（单位：mg·kg）−1·天−1：30肼屈嗪、10氢氯噻嗪和0.5利血平）和ANG，并补充BH4（100毫克·千克−1·天−1; 瑞士Schircks实验室：ANG+BH4). 剂量和给药途径先前被证明是有效的(19,21,23,40). 为了建立血管紧张素Ⅱ-融合性高血压，在异氟烷麻醉下将含有血管紧张素II的渗透微型泵植入大鼠皮下（IsoFlo；Abbott Laboratories，North Chicago，IL）。ANG II以70 ng/min的速度慢性输注2周。伯克希尔哈撒韦4在开始ANG II输注前3天开始治疗，并在整个2-k ANG II治疗期间持续治疗。伯克希尔哈撒韦4每日灌胃给药（100 mg·kg−1·天−1)在ANG II输注前3天和整个2周期间。在ANG II输注之前和整个2周期间，在饮用水中提供TT 3天。每三天更换一次TT溶液，并根据每只大鼠的饮水量进行修改。如前所述，在ANG II输注7天和14天后，通过尾剪断式脉搏描记术测量收缩压(33). 每只大鼠的收缩压由四到六个独立读数的平均值确定。2周后，用戊巴比妥钠（戊巴比妥；50 mg/kg ip；雅培）麻醉大鼠，并如前所述分离肠系膜小动脉(38)并概述如下。所有实验均按照美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南并由乔治亚医学院动物护理和使用委员会批准和监督。

组织BH的测量4和BH2。

在冷生理盐水溶液[PSS（pH=7.4）中小心地将肠系膜血管床从肠壁上切下，将脂肪和静脉从动脉中拉出；单位为mmol/l:130 NaCl，4.7 KCl，1.18 KH2人事军官4，1.17硫酸镁4·7小时2O、 14.9氯化钠三、5.5葡萄糖、0.26 EDTA和1.6 CaCl2]. 将分离的肠系膜小动脉在4°C的提取缓冲液中均匀化[如下所示，单位为mmol/l:50 Tris（pH 7.4），1个二硫苏糖醇和1个EDTA]，并在10000℃下离心克（4°C下8分钟）。在酸（转化BH和BH）中进行差异氧化后，测定生物蝶呤水平4和7.8-BH2转化为生物蝶呤）和碱（仅转化7,8-BH2如前所述，通过反相高效液相色谱（Beckman Coulter，Fullerton，CA）和荧光检测器（Jasco）进行生物蝶呤）条件(7). 数据通过32卡拉特色谱软件（Beckman Coulter）收集和分析，并根据组织蛋白水平进行标准化。伯克希尔哈撒韦4根据酸碱氧化后生物蝶呤水平的差异计算含量。

细胞内GTPCH I活性的测量。

使用Sephadex G25M柱（Amersham，Piscataway，NJ）过滤如生物蝶呤测定中制备的组织上清液匀浆，以去除内源性新蝶呤，BH4，和苯丙氨酸。采用反相高效液相色谱法（Beckman Coulter）通过测定新喋呤来测定GTPCH I的酶活性，新喋汀是由氧化和磷酸盐处理后的三磷酸二氢新喋嗪衍生而来(7).

细胞内cGMP含量的测量。

分离、清洁肠系膜小动脉，将其分为两部分，并在37°C的含氧PSS中孵育15分钟，PSS中含有IBMX（300μmol/l）。用非选择性NOS抑制剂孵育其他动脉段N个G公司-硝基-我-精氨酸甲酯(我-名称；100μmol/l）培养15分钟。培养后立即在液氮中对动脉段进行snap冷冻，并在冰冷的10%TCA中均质（宾夕法尼亚州匹兹堡LabChem）。用乙醚提取TCA匀浆，用放射免疫分析法定量cGMP水平，并将其归一化为前面描述的蛋白质含量毫克(34). 使用BSA作为标准，通过标准Bradford分析（加州Hercules的Bio-Rad实验室）测定蛋白质浓度。

免疫印迹法。

动脉节段在液氮中快速冷冻，并在含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒（印第安纳波利斯罗氏应用科学公司）和磷酸酶抑制剂鸡尾液（伊利诺伊州波克福德皮尔斯）的冷均质缓冲液（20.0 mmol/l Tris·HCl，pH 7.4，137.0 mmol/l NaCl，10%甘油和1%NP40）中均质。蛋白质浓度通过标准Bradford分析测定，并按照前面所述进行Western blotting和低温SDS-PAGE(6,35,42). 简单地说，将蛋白质转移到PVDF或硝化纤维素膜后，将其封闭在封闭缓冲液中（美国纳卡莱，加利福尼亚州圣地亚哥）。使用抗GTPCH I的一级抗体（德国慕尼黑Ascenion）对膜进行检测，作为负荷控制，用单克隆抗β-肌动蛋白（Sigma）对印迹进行再杂交。对于其他人，使用NOS3（BD转导实验室，加利福尼亚州圣何塞）、磷酸化NOS3-Ser1177（细胞信号传导，丹弗斯，MA）、磷酸化NOS3-Ser633（Upstate，Lake Placid，NY）、磷酸化NOS3-Thr495（Upstate，Lake Placid，NY）、Akt（细胞信号传导），磷酸化Akt-Ser473（细胞信号）和β-肌动蛋白（西格玛，密苏里州圣路易斯）。使用奥德赛红外成像仪检测到特定波段。IRDye800（Rockland，Gilbertsville，PA）和AlexaFluor 680（Molecular Probes，Eugene，OR）被用作二级抗体，用于检测两种不同的一级抗体。分析NOS3、磷酸化NOS3，Akt激酶、磷酸化Akt酶和β-肌动蛋白的密度测定。通过归一化β-肌动蛋白水平计算NOS3和Akt的相对密度单位，而磷酸化蛋白归一化为相应的非磷酸化总蛋白。使用奥德赛红外成像仪检测低温SDS-PAGE NOS3二聚体和单体条带。

材料。

ANG II从菲尼克斯制药公司（加利福尼亚州贝尔蒙特）购买。微型泵从Alzet（加利福尼亚州库比蒂诺）购买。所有其他化学品均从Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯）购买。

数据分析。

值表示为平均值±SE，并由学生的吨-对配对比较或方差分析进行测试，然后对多次比较进行Bonferroni校正（Prism，La Jolla，CA）。值为P（P）≤0.05被认为具有统计学意义。

结果

收缩压。

输注1周后，ANG患者的收缩压显著高于NORM患者，并且在接下来的几周内，这种压差一直保持不变(n个= 19–21;图1). TT或BH治疗4在ANG组中，在第1周并在第2周。

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血压正常大鼠的收缩压（NORM）；n个=19），ANG大鼠(n个=19），ANG大鼠采用三联疗法（ANG+TT；n个=21）和用四氢生物蝶呤（ANG+BH）治疗的ANG大鼠4;n个=21）在ANG II输注1周和2周之前和之后*各时期与正常值的显著差异(P（P）≤ 0.05).†每个时期与ANG的显著差异(P（P）≤ 0.05).

伯克希尔哈撒韦4，伯克希尔哈撒韦2含量和BH4-至BH2肠系膜小动脉的比率。

如所示图2(n个=10），BH4ANG组的小动脉水平与NORM组无差异。然而，TT或BH联合治疗4BH显著增加4水平(图2A类). BH治疗4BH进一步增加4水平(图2A类). 伯克希尔哈撒韦2ANG组的水平呈上升趋势(P（P）与NORM组相比=0.07；图2B类). 这反过来大大降低了BH的百分比4生物蝶呤总量的(图2C） 和BH4-至BH2比率(图2D类)与NORM.TT或BH相比，ANG的小动脉中4补充不影响BH2ANG中的水平(图2B类). 然而，BH百分比4总生物蝶呤和BH4-至BH2用TT或BH恢复比率4处理(图2,C类和D类分别为；P（P）<0.05，与未治疗的ANG组相比）。

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伯克希尔哈撒韦4水平(A类)，伯克希尔哈撒韦2水平(B类)，伯克希尔哈撒韦4总生物蝶呤百分比(C类)和BH4-至BH2比率(D类)在肠系膜小动脉中(n个=10）来自NORM、ANG、ANG+TT和ANG+BH4.*与NORM的显著差异(P（P）≤ 0.05). †与ANG的显著差异(P（P）≤ 0.05). #与ANG+TT相比存在显著差异(P（P）≤ 0.05).

肠系膜小动脉中GTPCH I酶活性和蛋白表达。

评估BH增加的机制4测定ANG中TT水平、GTPCH I酶活性和蛋白表达。ANG组GTPCH I活性与NORM组相比没有变化(n个= 6–7;图3A类). TT显著增加了GTPCH I活性，但BH没有增加4补充(n个= 6–7;图3A类). 各组间GTPCH I蛋白表达相似(n个= 3;图3B类).

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A类肠系膜小动脉中的GTP环水解酶I（GTPCH I）酶活性(n个=6–7）来自NORM、ANG、ANG+TT和ANG+BH4.*与NORM的显著差异(P（P）≤ 0.05). †与ANG的显著差异(P（P）≤ 0.05). #与ANG+TT相比存在显著差异(P（P）≤ 0.05).B类肠系膜小动脉中归一化为β-肌动蛋白的GTPCH I蛋白表达的代表性Western blot和相对密度测定分析(n个=3）来自NORM、ANG、ANG+TT和ANG+BH4。

肠系膜小动脉中的cGMP。

通过测量有无cGMP含量来评估肠系膜小动脉中的NO/cGMP信号我-名称(n个= 6;图4). 与NORM组相比，ANG小动脉中cGMP的蓄积量显著减少(图4A类). 两种降压治疗均恢复了cGMP水平(图4A类). 预孵育我-NAME消除了cGMP在NORM和ANG中的积累（数据未显示），证实cGMP水平依赖于NOS介导的信号传导，与我们之前的出版物一致(20).

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A类：cGMP在肠系膜小动脉中的积聚(n个=6）来自NORM、ANG、ANG+TT和ANG+BH4.*与NORM的显著差异(P（P）≤ 0.05). †与ANG的显著差异(P（P）≤ 0.05).B类：低温SDS-PAGE的代表性Western blot分析评估肠系膜小动脉内皮型NOS（NOS3）二聚体和单体(n个=4）来自NORM和ANG。

NOS3单体与二聚体的比率。

NOS3的天然状态为二聚体(42). NOS3单体增加，即单体与二聚体比率增加，已被用作导管动脉中NOS3解偶联的标志(44). 低温SDS-PAGE分析显示NOS3主要以天然二聚体形式在NORM和ANG的小动脉中表达(图4B类).

总的和磷酸化的NOS3和Akt激酶。

由于NOS3介导的NO/cGMP信号是通过磷酸化和去磷酸化动态调节的(28)磷酸化状态可能调节NOS3活性和解偶联(25)，我们分析了肠系膜小动脉中NOS3在Ser1177、Ser633和Thr495的磷酸化(图5;n个= 5–13). NOS3总蛋白表达在各组之间具有可比性(n个= 5–13;图5A类). ANG大鼠小动脉中NOS3在Ser1177的磷酸化显著低于NORM大鼠。此外，当两种治疗都降低血压时，Ser1177位点的NOS3磷酸化被恢复(图5B类). 在ANG和NORM大鼠中，NOS3在Ser633和Thr495的磷酸化类似(n个= 10–11;图6A类和B类).

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归一化为β-actin的总NOS3的代表性Western blot和相对密度分析(A类)和Ser1177的NOS3磷酸化归一化为总NOS3(B类)来自NORM的肠系膜小动脉(n个=12），ANG(n个=13），ANG+TT(n个=5）和ANG+BH4(n个= 5). *与NORM的显著差异(P（P）≤ 0.05). †与ANG的显著差异(P（P）≤ 0.05).

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Ser633 NOS磷酸化的代表性Western blot和相对密度分析(A类;n个=11）或Thr495(B类;n个=10-11）。相对密度单位标准化为总NOS3。

NOS3的Ser1177磷酸化受Akt激酶激活的调节(13,28,36)而ANG II增加肾厚升支Ser473的Akt磷酸化(15). 因此，我们分析了NORM和ANG大鼠肠系膜小动脉中Ser473的总Akt和磷酸化Akt(n个= 7;图7). 我们发现ANG大鼠的小动脉总Akt比NORM大(图7A类). 然而，磷酸化Akt与总Akt的比率没有显著差异(图7B类).

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归一化为β-肌动蛋白的总Akt的代表性Western blot和相对密度分析(A类)Ser473的Akt磷酸化归一化为总Akt(B类)肠系膜小动脉(n个=7）来自NORM和ANG。*与NORM的显著差异(P（P）≤0.05）。

讨论

本研究主要研究BH的血压依赖性调节4-至BH2肠系膜小动脉中的水平、GTPCH I活性、NO/cGMP信号和NOS3磷酸化。我们发现抗高血压治疗、三联疗法或口服BH4血管BH增加4水平和BH4-至BH2比率，恢复NO/cGMP信号，恢复NOS3在Ser1177的磷酸化。此外，三联疗法（但不是口服BH4治疗）显著增加小动脉中的GTPCH I活性，而GTPCHⅠ表达没有变化。此外，我们发现，尽管血压发生变化，但肠系膜小动脉中NOS3单体化、Ser633和Thr495处NOS3磷酸化以及Ser473处Akt磷酸化并未发生改变。这些数据表明BH的增加4NO/cGMP信号的增加降低了血压。

血管BH4-至BH2比率和血压调节。

伯克希尔哈撒韦4是NO生物合成的必要辅因子，BH4缺陷已被证明是NOS解耦的主要机制(1,2,22). 除了减少绝对BH4水平，完全减少的BH之间的比率降低4和氧化BH2也可能导致NOS3脱钩(5,41). 血管BH降低4-至BH2在载脂蛋白E缺乏小鼠的研究中观察到该比率(8)和糖尿病患者(数据库/数据库)老鼠(32)，而绝对BH4在载脂蛋白E缺乏的小鼠中，其水平要么升高(7)，糖尿病患者无变化(分贝/分贝)老鼠(32)和ANG II输注的高血压大鼠(21)或在胰岛素抵抗大鼠中降低(37)，自发性高血压大鼠(17)，载脂蛋白E缺乏小鼠(24)，和DOCA盐小鼠(9). 伯克希尔哈撒韦2不是NOS辅因子，但可以通过在BH与NOS3竞争性结合，有效降低NO的生物利用度4结合位点导致NO生成减少和NOS解偶联增强(5,41). Vasquez-Vivar等人(41)证明当BH和NOS3同时存在时，NOS3活性可能同时存在4和BH2使用体外系统。目前的研究进一步证明了三联疗法和口服BH4增加BH4-至BH2小动脉比率。此前，我们报道NOS同时产生NO和H2O（运行）2血管紧张素Ⅱ型融合性高血压大鼠的小动脉(20). 当前研究中的数据支持以下假设：4至BH2是ANGⅡ诱导高血压小动脉NOS解偶联的关键决定因素。

口腔BH4治疗显著增加了BH的组织水平4，但BH2未遵循水平，导致BH增加4-至BH2小动脉比率。伯克希尔哈撒韦4已知具有抗氧化作用，而不依赖于其作为NOS辅因子的作用(22). 然而，我们的数据表明，口服BH的抗氧化活性4治疗不影响BH4氧化成BH2在小动脉中。然而，组织O显著减少2−先前在口服BH的DOCA-盐性高血压小鼠主动脉组织中发现了这种生成4治疗(23). 有趣的是，三联疗法显著增加了BH4水平，反过来BH4-至BH2与口腔BH相似的小动脉比率4治疗。血压本身似乎在调节小动脉GTPCH I活性方面没有作用，因为这在血压正常和高血压大鼠中是相似的。三联疗法增加了GTPCH I酶活性，但没有伴随蛋白表达的变化，这表明治疗模式激活了GTPCH-I。目前，对利血平、氢氯噻嗪和/或肼屈嗪是否直接影响GTPCHⅠ活性缺乏了解。需要进一步实验来确定三联疗法介导的GTPCH I激活的机制。

小动脉中的NO/cGMP信号与血压调节。

我们的实验室和其他(20,34)已证明各种高血压动物模型动脉中的NO/cGMP信号减少。本研究证实了我们之前的观察结果，即高血压大鼠肠系膜小动脉减少了cGMP的蓄积。三联疗法和口服BH4治疗1周和2周后，这两种药物均将血压降低至与ANGⅡ依赖型高血压模型相似的水平。预计，伯克希尔哈撒韦4补充增加了血管NO/cGMP信号。有趣的是，通过三联疗法降低血压也增加了血管NO/cGMP信号。几份报告(40)表明三联疗法不会影响肾素-血管紧张素-醛固酮系统，很可能在机制中排除这种可能性。以前曾报道过高血压双肾单夹模型中NO/cGMP信号的血压依赖性变化(43)与我们的研究一致。此外，Du等人(9)显示NOS3解偶联在DOCA盐性高血压小鼠中减弱，GTPCH I的内皮特异性过度表达增加了BH4合成与血管BH4-至BH2血压下降时的比率。这些数据支持血管NO/cGMP信号通过BH变化的假说4-至BH2比率调节血压。

体外研究表明，NOS3的天然二聚体状态产生NO，而单体表达与NOS3解偶联有关(11)在许多研究中，单体与二聚体比率的增加被用于导管动脉作为NOS3解偶联的标志(44). 我们发现，在正常血压和血管紧张素Ⅱ诱导的高血压大鼠的小动脉中，天然NOS3以二聚体的形式表达。因此，由于我们之前已经发布NOS生成H2O（运行）2在高血压大鼠肠系膜小动脉中，NOS3的单体与二聚体比率似乎与NOS3在小动脉中的酶解偶联无关。同样，Du等人(9)发现NOS介导的O增加2−在DOCA盐性高血压小鼠的肠系膜小动脉中NOS3的单体化没有增加。这些数据表明，小动脉中的NOS3单体与血压或NOS3解偶联无关。

小动脉中NOS3磷酸化与血压调节。

在本研究中，我们证明了ANG引起的小动脉中Ser1177处NOS3磷酸化减少。这些数据表明，高血压大鼠小动脉中NO/cGMP信号减少可能部分归因于Ser1177的磷酸化功能失调。大量研究(16,34)已证明高血压动物模型血管系统中Ser1177处NOS3磷酸化降低。然而，通过降低血压来动态改变小动脉中NOS3磷酸化的研究很少。我们证明通过三联疗法和口服BH可以恢复Ser1177的NOS3磷酸化4表明Ser1177磷酸化位点是血压依赖性的。Ser1177磷酸化位点与培养内皮细胞中剪切应力介导的NOS3激活有关(4); 因此，我们假设降低血压会导致体内Ser1177磷酸化途径的功能性重新偶联。在对内皮细胞的研究中，丝氨酸/苏氨酸激酶Akt已被鉴定为一种有助于Ser1177位点磷酸化的主要激酶(13). Akt活性也受内皮细胞中Ser473翻译后磷酸化的调节(14). 在我们的结果中，与正常血压对照组相比，高血压大鼠肠系膜小动脉中Ser473磷酸化的Akt有增加的趋势(P（P）=0.07），可能是由于ANG II而非血压(15). 高血压条件下血管系统Akt磷酸化调节的报告显示出不一致的结果：DOCA降低(31)和肥胖的Zucker老鼠(30)，中未更改N个G公司-硝基-我-精氨酸处理大鼠(31)和DOCA(34)或在双肾、单夹中增加(16)和ANG II输注(三). 这种差异可能是由于高血压水平以及所检查的血管组织类型所致。还应注意，内皮完整血管组织中的Akt测量值可能无法反映内皮依赖性变化，可能是平滑肌源性Akt变化的结果。我们的结果表明，在ANG II输注下Akt激活与小动脉中Ser1177的NOS3磷酸化异常无关。NOS3-结合的Akt可能比总Akt更精确地调节NOS3活性(10,39). 因此，需要进一步研究以确定高血压动物模型血管组织中Akt和NOS3的磷酸化状态。

我们之前报道过NOS活性产生NO和H2O（运行）2在高血压大鼠的小动脉中，表明存在耦合和非耦合NOS。高血压大鼠和血压正常大鼠的小动脉中，Ser633和Thr495的NOS3磷酸化类似。因此，这些数据使我们假设Ser633和Thr495的磷酸化负责维持小动脉中的基础NO生成和NO/cGMP信号。有必要进行进一步调查，以充分阐明这种可能的机制。

总之，本研究证明BH的从头生物合成4通过GTPCH I或补充BH4导致NO/cGMP信号和NOS3在Ser1177的磷酸化增加，从而降低血压。进一步评估降压治疗和激活GTPCH I的分子机制可能会导致激活和恢复NO/cGMP信号的新疗法。

赠款

本研究得到了国家心脏、肺和血液研究所拨款HL-60653和HL-69999（给J.S.Pollock）和HL-53524（给Z.Katusic）以及美国心脏协会（给J.S.Polock：既定研究员0440073N；L.d'Uscio：科学家发展奖0730133N）的支持。

披露

作者未声明任何利益冲突，无论是财务还是其他方面。

致谢

我们感谢希瑟·沃克·史密斯的出色技术协助。我们还要感谢David Pollock博士提供的专家编辑建议。

康康的现住址：马萨诸塞州波士顿市龙伍德大道300号波士顿儿童医院卡普家庭研究大楼（#12.004A）血管生物学项目，邮编02115。

参考文献

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文章来自美国生理学杂志-心脏和循环生理学由以下人员提供美国生理学会