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生物化学杂志。2011年4月1日；286(13): 11391–11400.
2011年1月28日在线发布。 数字对象标识：10.1074/jbc。M10.214569号
预防性维修识别码：项目经理3064195
PMID：21278366

小型泛素样修饰物（SUMO）结合抑制中腿多梳群阻遏性梳的转录沉默*

马修·史密斯,‡ 丹尼尔·马林,§ 杰弗里·西蒙,§和阿尔伯特·J·库里‡,1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

这个果蝇属中腿性梳蛋白（Scm）是多梳组（PcG）的成员，多梳组是一组转录阻遏物，在发育过程中保持同源基因沉默。最近的研究发现，PcG蛋白既是小泛素样修饰物（SUMO）蛋白修饰的靶点，又是SUMO结合途径的催化成分。我们发现SUMO结合酶Ubc9与Scm结合，这种需要Scm C末端无菌α基序（SAM）结构域的相互作用对Scm的高效sumoylation至关重要。Scm与同源异型基因的主要多囊反应元件（PRE）相关Ultrabithorax公司(超双胸)，高效的PRE招募需要完整的Scm SAM域。全球缩水甘油酯的减少增加了Scm与PRE的结合。这可能是Scm-sumoylation的直接影响，因为Scm中SUMO受体位点的突变会增强其向PRE的募集，而SUMO到Scm-N末端的翻译融合会干扰这种募集。在后胸，超双胸这种表达促进了缰绳的形成并抑制了翅膀的发育。当SUMO水平降低时，我们观察到超双胸部分绞翅转化表型。这些观察结果表明，SUMO通过阻止其向超双胸主要PRE。

关键词：染色质免疫沉淀（ChIP），果蝇，翻译后修饰，Sumoylation，转录抑制因子

介绍

同源基因在后生动物的整个发育过程中以空间限制的模式表达，它规定了片段的身份。在果蝇属胚胎，同源异型基因表达的早期模式依赖于由分割基因编码的转录激活子和阻遏子的瞬时作用。随后，Polycomb小组（PcG）2和三胸群（TrxG）蛋白通过多轮细胞分裂维持每个细胞谱系中分段蛋白建立的转录状态(1). PcG蛋白在细胞谱系中保持被抑制状态，其中同源基因最初被分割因子抑制，而TrxG蛋白则保持细胞谱系的活性状态，其中，同源基因最初由分割因子激活。

至少有三个单独的PcG蛋白复合物，称为Pleiohometic抑制复合物（PhoRC）、Polycomb抑制复合物1（PRC1）和Polycomp抑制复合物2（PRC2），协同工作以维持被抑制状态。PhoRC由DNA结合因子Pleiohometic（Pho）和含有四个MBT结构域的单甲基和二甲基H3K9和H4K20结合因子Scm相关基因（Sfmbt）组成(2). PhoRC被认为招募PRC2，这是一种包含PcG蛋白的复合物，包括zeste增强子（E（z））、zeste抑制子12（Su（z）12）和额外六角体（Esc），用于染色质。PRC2是组蛋白甲基转移酶，负责组蛋白H3的赖氨酸27甲基化(三,4). 由此产生的三甲基形式的H3K27被认为是PRC1核心成分Polycomb（Pc）色域的对接位点。Pc和PRC1的其他三个核心成分，后性梳（Psc）、多同源异型（Ph）和额外性梳（Sce，也称为环）与多个TATA盒结合蛋白（TBP）相关因子（TAF）共纯化，表明PRC1和调节转录的启动子复合体之间存在直接相互作用(5). PRC1家族复合物的特征功能包括组蛋白H2A的泛素化(6)多核小体的致密化(7). 每个复合体的单个组件对正常功能至关重要体内因为任何PcG基因的缺失都会导致同源异型基因的异位表达。PcG蛋白复合物通过招募特定DNA序列（称为多梳反应元件（PRE））定向到靶基因。虽然PRE的招募是为了防止目标启动子的表达，但抑制的确切机制尚不清楚。

小泛素样修饰物（SUMO）是一种泛素家族蛋白，与大量靶蛋白中的赖氨酸侧链共价偶联。众所周知，SUMO与许多底物的结合可以调节多种重要的细胞功能，包括亚细胞靶向、蛋白质稳定性和转录因子活性(8). 已经观察到PcG蛋白功能和SUMO结合途径之间的多重连接。Polycomb的人类同源物hPc2（也称为Cbx4）可以通过促进C末端结合蛋白（CtBP）和同源域相互作用蛋白激酶2（HIPK2）的SUMO-酰化来发挥E3型SUMO连接酶的功能。CtBP、HIPK2和SUMO结合酶Ubc9在称为多梳体的离散核内病灶中与hPc2共定位(9). 最近的研究表明，小鼠Pc2的SUMO修饰增加了其对H3K27me3核小体的亲和力，导致启动子关联增强和Hox基因抑制(10). 在蛋白质组学筛选中，Pho被确定为SUMO结合靶点果蝇属由SUMO修改或与SUMO交互的目标(11). 磷同系物阴阳1（YY1）的Sumoylation似乎调节其激活或抑制转录的能力(12). Sumoylation of the秀丽隐杆线虫PcG蛋白SOP-2调节其定位于PcG核小体，并被要求防止同源异型基因的异位表达(13). SOP-2与果蝇属PcG蛋白Ph和Sex Comb on Midleg（Scm）凭借一个共享的无菌α基序（SAM）蛋白-蛋白质相互作用域。虽然Ph是PRC1的核心亚单位(7,14)，Scm仅与PRC1外围关联(15)但尽管如此，对PcG介导的沉默也至关重要(16).

尽管Scm可以通过与Ph的交互作用与PRC1关联(15)最近的一项研究表明，Scm对染色质的靶向可能独立于三种已鉴定的PcG复合物(17). Scm包含两个MBT重复序列，在致命的肿瘤抑制因子中也发现(三)，恶性脑肿瘤（l（3）mbt）(18)和PhoRC组件Sfmbt(2). Scm-MBT重复序列优先与单甲基化赖氨酸残基结合，这是抑制同源基因所需的活性(19). 尽管Scm不直接结合DNA，但除了C末端SAM蛋白-蛋白质相互作用域外，它在N末端还包含两个非传统锌指结构域。Scm SAM域允许自我交互并调节Scm与Ph的结合(20,21). Scm SAM域的重要性由以下内容证明Scm公司破坏或改变结构域并表现为基因空区的突变(15,18,22). 此外，仅分离的Scm-SAM结构域的组织特异性过度表达可诱导同源异型转化表型，表明对PcG介导的抑制具有显性负效应(15).

在本研究中，我们确定Scm作为SUMO改性的底物。染色质免疫沉淀（ChIP）实验用于跟踪Scm与bxd公司PRE位于Hox基因上游超双胸，在哪里参与超双胸沉默。在减少Scm磺酰化的条件下，可以观察到PRE中Scm的招募增加。Scm PRE关联中的SUMO路径依赖性变化与超双胸表达和同源变换。这些发现表明，SUMO结合途径是Scm和PcG介导的阻遏的重要调节器。

实验程序

胚胎提取物和抗-FLAG免疫亲和力富集

果蝇属从正常基因组启动子表达FLAG-Scm的转基因系中收获胚胎(15)，并按照描述制备核提取物(23). 为了进行亲和富集，50–100 mg等分核蛋白被添加20至0.1%吐温，新鲜DTT至0.5 m米和新鲜蛋白酶抑制剂如下：0.5 m米PMSF、1.0μg/ml抑肽酶、1.0μg/ml亮氨酸肽、1.0μg/kl凝乳抑素、1.0μ/ml胃蛋白酶抑素A、1.0μmg/ml抗血小板、50μg/ml 1-氯-3-对甲苯酰氨基-7-氨基-2-庚酮。使用1.0μl珠子浆/1.0 mg核提取物，在4°C下用抗FLAG M2-海藻糖珠子（Sigma）将蛋白等分样品培养过夜，并进行旋转。然后通过短暂的低速离心将珠粒制成颗粒，并在1.0 ml缓冲液C（20 m）中清洗米Hepes，pH值7.6，1.5 m米氯化镁2，0.2米米乙二胺四乙酸（EDTA），0.5米米DTT，25%甘油加蛋白酶抑制剂（如上）加0.5米NaCl在室温下保持15分钟。在缓冲液C中进行两次额外清洗后，再加上0.15米NaCl，FLAG-Scm在100μl缓冲液C加0.15中洗脱米含有0.4 mg/ml FLAG肽（DYKDDDDK）的氯化钠，在室温下旋转30分钟N个-乙基马来酰亚胺（NEM）包括20 m米NEM贯穿核提取和反FLAG亲和力富集。

稳定转染和RNAi

果蝇属S2细胞在24°C的施耐德昆虫培养基（Sigma）中培养，补充10%热灭活胎牛血清（JRH Biosciences）。使用Effectene（Qiagen）对生长在6孔板中的细胞进行转染。为了产生稳定转化的FLAG-Scm细胞系，将pMT-FLAG-Scm载体与pCoHygro（Invitrogen）在S2细胞中共转染，并选择转化细胞使用含有300μg/ml潮霉素（Invit罗gen）的培养基，如前所述(24). pMT-FLAG-Scm构造是由金崇宇慷慨提供的礼物。GFP、SUMO和Ulp1双链RNA（dsRNA）是使用MEGAscript RNAi试剂盒（Ambion）使用含有侧翼T7启动子的PCR衍生模板生成的(11,25). 如前所述进行RNA干扰(26).

Scm Sumoylation分析

通过使用含有KpnI位点的PCR引物从pBS-FLAG-Scm中扩增Scm cDNA并连接到pPAC-FLAG的KpnI位置，构建了pPAC-FLAG-Scm（WT）质粒(27). 使用pBS-pro-FLAG-Scm作为模板创建210、574和624位的Scm赖氨酸-精氨酸点突变，并根据制造商的方案使用QuikChange试剂盒（Stratagene）进行突变。对每个产生的pBS-pro-FLAG-Scm突变体进行PCR-扩增并克隆到pPAC-FLAG的KpnI位点，生成pPAC-FLAG-Scm单突变体K210R、K574R、K624R或三突变体（K210R/K574R/K624R）。通过PCR-扩增编码氨基酸1-797的Scm cDNA序列，并将所得片段克隆到pPAC-FLAG的KpnI位点，构建了pPAC-FLAG-Scm（ΔSAM）结构。为了评估Scm的sumoylation，将1μg pPAC-FLAG-Scm瞬时转染到529SU细胞（一种用铜诱导的HA-Ubc9和FLAG-SUMO稳定转化的细胞系）中，或增加pPAC-FLAG-Ulp1（1、5、25、100或500 ng）的量。细胞未经处理或用500μ米CuSO公司4转染后24小时，并在诱导后48小时收获用于抗-Scm蛋白质印迹。

为了进一步评估Scm的sumoylation，用Ulp1或SUMO dsRNA（5μg/孔）处理FLAG-Scm稳定系，48小时后用500μg/井处理细胞米CuSO公司4在48小时诱导后，样品在SDS加载缓冲液中直接煮沸并通过SDS-PAGE和抗FLAG免疫印迹分析，或在溶解缓冲液（50 m）中重新悬浮米三盐酸，pH 7.4，150 m米氯化钠，1米米EDTA和1%Triton X-100），使用抗FLAG M2微球（Sigma）进行免疫沉淀，并通过抗SUMO Western blot进行分析。为了评估缺乏SAM结构域或潜在SUMO受体赖氨酸突变为精氨酸的Scm的sumoylation状态，用编码FLAG-Scm WT、ΔSAM或K210R/K574R/K624R的组成活性表达载体瞬时转染S2细胞或用5μg Ulp1 dsRNA处理24 h。转染后48小时收获表达FLAG-Scm的细胞，在样品缓冲液中煮沸裂解，并通过抗FLAG-Western印迹进行分析。体外sumoylation测定使用35如前所述，进行S标记的Scm和纯化的SUMO途径成分(24).

体外蛋白质相互作用分析

体外-翻译的35S标记荧光素酶、Scm（WT）和Scm（ΔSAM）使用Tn个T T7快速耦合系统（Promega）。pGem-Scm（WT）和pGem-Scm（ΔSAM）模板是通过PCR-使用含有KpnI位点的引物扩增全长Scm-ORF或编码氨基酸1-797的Scm ORF，并将其插入pGem-3Zf（Promega）的KpnI位点而创建的。GST标记表达载体pGEX-Ubc9(27)，pGEX4T1表达于大肠杆菌BL21，并根据制造商的说明用谷胱甘肽-淀粉珠纯化（Amersham Biosciences）。GST下拉分析如前所述进行(28). 将约5μg的谷胱甘肽珠固定化GST融合蛋白与35S标记蛋白。在广泛洗涤结合后，在SDS样品缓冲液中洗脱放射性标记蛋白，进行SDS-PAGE，并通过放射自显影术进行分析。

染色质免疫沉淀和RT-PCR

从苍蝇S2细胞制备甲醛交联染色质，并按所述进行免疫沉淀(29) (30)使用5–10μl抗Pc抗血清(30)，哲学博士(23)，或Scm(22)根据ChIP。使用兔免疫前血清和蛋白A-琼脂糖珠并行进行阴性对照免疫沉淀（“模拟”）。放大超双胸PRE片段和控件卢比1140按所述进行末端PCR片段(29,30).

评估磺酰化对招募Scm至bxd公司用1μg/孔的pPAC-FLAG-Scm（WT）、pPAC-FLAG-Scm（ΔSAM）、pBAC-FLAG-Scm（K210R/K574R/K624R）、pSPAC-FLAG-SUMO-Scm（WT，或pPAC-FRAG-SUMO-Scm（ΔSAM）转染PRE、S2细胞，48小时后收获用于抗FLAG ChIP和抗FLAG Western blot，以验证等效表达水平。FLAG-SUMO-Scm融合构建物是通过将PCR生成的编码Scm（WT或ΔSAM）的片段插入pPAC-FLAG-SUMO（ΔGG）的NotI位点而创建的。pPAC-FLAG-SUMO（ΔGG）载体是通过将编码SUMO前86个残基的PCR产物和NRLN连接子插入pPAC-FLAG的KpnI位点而创建的。对于RNAi-ChIP实验，用5μg/孔的GFP、Ulp1或SUMO dsRNA和500μ米CuSO公司44天后添加。诱导24小时后，收集细胞进行抗FLAG ChIP、抗SUMO Western blot和抗FLAG Western blot。如前所述执行抗-FLAG ChIP(31).

使用DNA Engine Opticon 2系统（MJ Research）对FastStart SYBR Green混合物（罗氏应用科学公司）进行定量实时PCR。ChIP实验一式两份，数据用代表平均值（±S.D.）的每个条形图表示（见图3和​和4）。4). 确定SUMO或Ulp1耗竭对超双胸表达，S2细胞用5μg GFP、SUMO或Ulp1 dsRNA处理5天。根据制造商的说明，使用TRIzol试剂提取总RNA（Invitrogen）。在使用RQ1 RNase-free DNase（Promega）降解残余基因组DNA后，重新提取RNA，使用Omniscript RT试剂盒（Qiagen）进行逆转录，并使用实时PCR和特定于超双胸或肌动蛋白5C(第5C号法案). 数据以-倍的变化表示超双胸mRNA丰度标准化为第5C号法案相对于GFP dsRNA处理的对照样品的内部对照。

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Scm的Sumoylation阻碍了其与bxd公司之前。 A类、Scm和PRC1核心组件Ph和Pc与超双胸S2细胞的主要PRE。顶部，启动子和主要PRE的示意图超双胸如前所述，显示PCR-扩增区域（b3至b7）的基因(29,30).底部，S2细胞ChIP结果使用抗Pc、Ph或Scm抗体，并扩增来自卢比1140（Rp）位点，如图所示。B类，需要Scm SAM域才能有效招募Scm到bxd公司之前。S2细胞未经处理或暂时转染pPAC-FLAG-Scm(重量)或pPAC-FLAG-Scm（Δ山姆)，样品进行抗FLAG Western blot，并使用FLAG抗体（*=第页< 0.01).C类，共轭缺陷型Scm更有效地被招募到超双胸主要PRE。S2细胞未经处理或暂时转染pPAC-FLAG-Scm（WT）或pPAC-FLAG-Scm（K210R/K574R/K624R）(KR3型))，样本通过抗FLAG Western blot进行分析，并使用抗FLAG抗体（**=第页< 0.05).D类，SUMO-Scm融合用于PRE的效率较低D类对未经处理的S2细胞或转染了编码FLAG-tagged Scm（WT或ΔSAM）或融合到Scm N端的FLAG-SUMO表达载体的细胞（WT orΔSAM）（*=第页< 0.01, ** =第页< 0.05, *** =第页< 0.10). 通过抗FLAG蛋白质印迹来评估融合蛋白的表达。

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全球扰动的sumoylation改变了Scm与bxd公司之前。 A类和B类SUMO和Ulp1 RNAi均显著改变了sumoylated蛋白的光谱，包括Scm的结合状态。用GFP、SUMO或Ulp1 dsRNA处理FLAG-Scm表达细胞，然后进行抗FLAG和抗SUMO Western blot。C类，全球范围内磺酰化水平的降低增加了Scm与PRE之间的联系D类。细胞被视为A类.通过抗FLAG ChIP分析（扩增子如图3A类图表）（**=第页< 0.05, *** =第页< 0.10).

苍蝇杂交和角质层分析

除非另有说明，否则苍蝇在25°C的标准培养基上饲养。使用蔡司Axioskop显微镜对表皮结构进行成像。要生成随机的SUMO-dsRNA-expressing克隆，hs-脂肪酶;vgQ-LacZ公司;肌动蛋白>CD2（CD2）>镀锌4雌性与UAS-SUMORNAi公司/青色,实际GFP(11)雄性、一龄和二龄幼虫后代在35℃下热休克40分钟。通过将A9（Gal4）雌性与UAS-SUMORNAi公司/青色,实际GFP男性。对成年笼头进行解剖，将其放在乳酸/霍耶培养基1:1混合液中的玻璃载玻片上，然后在50°C下孵育过夜以清除笼头。胚胎发生过程中SUMO或Ulp1 RNA的消耗是通过将Arm-Gal4雌性与UAS-SUMORNAi公司/青色,实际GFP，或UAS-Ulp1RNAi（NIG-Fly）雄性。将脱胆碱和脱碲化的胚胎安装在乳酸/霍耶培养基中，并使用暗场光学成像胚胎角质层(24).

结果

Scm是果蝇胚胎和S2细胞中的SUMO结合靶点

在之前的一项研究中秀丽线虫PcG蛋白SOP-2被证明是sumoylated(13). 鉴于果蝇属Scm蠕虫SOP-2，以及观察到PcG组的多个成分果蝇属而人类是SUMO结合靶点，我们测试了Scm也可能成为SUMO修饰靶点的可能性。在有或无SUMO蛋白酶抑制剂NEM的情况下，从表达FLAG标记的Scm的蝇系中制备胚胎提取物Scm公司启动子和调控区域。在以前的研究中，这种FLAG-Scm结构被发现可以完全拯救Scm公司突变表型(15). 在通过对未经处理的胚胎提取物进行抗FLAG免疫亲和富集制备的样品中，抗Scm Western blot显示了一条表观分子量为～100 kDa的单一条带(图1A类). 这一发现与Scm预测的94kDa分子量和之前通过Western blot检测到的Scm一致(22). 在NEM存在下制备的提取物含有一种额外的、迁移速度较慢的Scm形式，比NEM大约20 kDa(图1A类). 这种20-kDa位移与观察到的由SUMO单独修饰的蛋白质的SDS-PAGE迁移变化一致(27). 抗SUMO蛋白印迹检测到更高的分子量条带，表明这是Scm-SUMO结合物(图1A类,右侧面板).

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Scm是SUMO共轭靶果蝇属胚胎和S2细胞。 A类检测胚胎提取物中的Scm-SUMO结合物。在存在或不存在SUMO蛋白酶抑制剂NEM的情况下制备表达FLAG-Scm的胚胎提取物，并进行抗FLAG免疫亲和富集。用SDS-PAGE对样品进行分级，并用抗Scm或抗SUMO抗体进行免疫印迹分析。IP（IP），免疫沉淀。B类，Scm是Ulp1介导的去甲酰化作用的靶点。529SU细胞（S2细胞在铜诱导启动子下通过编码HA标记的Ubc9和FLAG标记的SUMO的表达结构稳定转化）未经处理或用CuSO处理4如图所示，瞬时转染FLAG-Scm表达结构并增加FLAG-Ulp1载体的数量。用抗Scm Western blot分析裂解产物。C类和D类，通过Ulp1或SUMO RNAi干扰Scm的sumoylation。FLAG-Scm在未经处理的S2细胞或通过RNAi去除Ulp1或SUMO的细胞中表达，并且通过抗FLAG Western blot分析裂解产物(C类)或用FLAG抗体免疫沉淀并用抗SUMO蛋白印迹分析(D类).E类,在体外Scm的sumoyalization。体外-翻译的35S标记的Scm单独在缓冲液中培养，或与纯化的重组HA-SAE1、FLAG-SAE2、GST-Ubc9和成熟SUMO一起培养(SUMO混合)样品通过SDS-PAGE和放射自显影进行分析。F类，Scm赖氨酸210、574和624可作为SUMO附着位点。用编码FLAG-Scm（WT）的表达载体或三重赖氨酸-精氨酸突变体（位置210、574和624（K210R/K574R/K624R）瞬时转染S2细胞(KR3型)))在Ulp1 dsRNA存在或不存在的情况下。通过抗FLAG蛋白质印迹评估每个Scm突变体的sumoyalization状态。

Sumoylation是一个可逆过程，存在多种SUMO蛋白酶，可以催化解偶联(32).果蝇属Ulp1是一种SUMO蛋白酶，已被证明可以促进SUMO从一系列靶点（包括Dorsal和谷氨酰-脯氨酸-tRNA合成酶（EPRS））中去除(25). 为了测试Scm是否是Ulp1介导的去结合靶点，我们用编码FLAG-Scm的表达结构瞬时转染529SU细胞（稳定转染有铜诱导的FLAG-SUMO和HA-Ubc9的S2细胞），增加或不增加FLAG-Ulp1的数量(图1B类). 通过抗Scm Western blot评估的裂解产物显示了未修饰的FLAG-Scm的一条主要带，并检测到额外的高分子量带，这些带在过度表达Ubc9和SUMO的样品中更为丰富。单酰化Scm似乎是修饰Scm最丰富的形式。然而，长时间暴露显示出与双和三酰化Scm一致的谱带（数据未显示）。FLAG-Ulp1的过度表达导致这些上层带积累的剂量依赖性减少，表明Ulp1能够从Scm中解偶联SUMO。为了证实这一点，我们通过RNA干扰（RNAi）检测了Ulp1或SUMO缺失的S2细胞中的Scm-sumoylation。Ulp1 dsRNA的加入显著增加了FLAG-Scm-SUMO结合物的水平，而SUMO RNAi可以有效阻止其形成(图1C类). 抗FLAG免疫沉淀和抗SUMO Western blot显示，在～120 kDa处有一条离散带，可能是单酰化Scm和其他高分子量的sumoylated蛋白质(图1D类). 我们还展示了Scm sumoylation在体外结合分析包括35S标记Scm和纯化重组HA-SAE1、FLAG-SAE2、GST-Ubc9和SUMO(图1E类).

SUMO受体赖氨酸通常属于共识基序ΨKX（X）（E/D）（Ψ是任何疏水性氨基酸，以及X（X）是任何氨基酸）。我们使用了SUMOsp，一个基于web服务器的sumoylation站点预测程序(33)，以确定Scm中潜在的SUMO连接站点。共鉴定出三个高概率位点，每个位点与SUMO共有基序匹配，这些赖氨酸位于210（MKLE）、574（IKQE）和624（IKSE）位置。这些位点的单独突变并没有显著降低Scm的sumoylation（数据现已显示），因此我们创建了一个三重突变（K210R/K574R/K624R），其中所有三种赖氨酸都突变为精氨酸，以确定它们是否共同占培养细胞中形成的sumoylated Scm的全部或部分。在评估Ulp1 RNAi诱导的sumoylation后，我们发现三重突变显著减少了SUMO结合物的形成(图1F类). 通过免疫印迹法对表达野生型和K210R/K574R/K624R突变型FLAG-Scm的提取物的稀释系列进行比较（数据未显示），表明三重突变使磺酰化与非磺化FLAG-Scm的比率降低了65–70%。在Scm中剩余的53种赖氨酸中，SUMOsp提出了五个可以利用的低概率非感应SUMO附着位点，并解释了观察到的K210R/K574R/K624R突变体的残留sumoylation。

识别SUMO结合靶点通常是SUMO E2酶Ubc9的职责。对于SOP-2秀丽线虫相对于Scm，与Ubc9的相互作用由SOP-2 SAM结构域介导(13). 鉴于这一发现，我们测试了Ubc9交互是否需要Scm SAM域在体外使用GST下拉。体外-翻译，35用GST或GST-Ubc9培养S-标记荧光素酶（Luc）、野生型Scm（WT）或缺乏C-末端SAM结构域（ΔSAM）的Scm，并在广泛洗涤后，通过SDS-PAGE和放射自显影术分析样品。GST-Ubc9显示出与WT Scm的强大相互作用，但未能显著降低ScmΔSAM(图2A类). 这表明Ubc9通过其SAM结构域直接与Scm相互作用，或者Ubc9优先与寡聚形式的Scm相互影响。考虑到Ubc9无法与孤立的Scm SAM域交互，直接Ubc9-SAM域的交互似乎不太可能在体外（未显示数据）。已知共轭酶对靶点的识别对于靶点的高效SUMO修饰至关重要；因此，我们试图评估S2细胞中ScmΔSAM的sumoylation。使用RNAi将编码WT或ΔSAM Scm的FLAG-Scm表达构建物转染到S2细胞或Ulp1缺失的细胞中。抗FLAG免疫印迹显示，与全长Scm相比，ΔSAM形式的Scm的酰化效率低得多(图2B类)，认为Scm-Ubc9相互作用对Scm的有效sumoyalization至关重要体内.

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Scm SAM结构域对于与Ubc9的相互作用以及Scm在其三个已鉴定的受体赖氨酸上的酰化都是必不可少的。 A类，Ubc9与野生型Scm相互作用，但不是缺少SAM域的Scm。GST或GST-Ubc9表达于大肠杆菌并用谷胱甘肽-糖珠纯化。固定化蛋白与在体外-翻译的35S-标记荧光素酶(勒克)，全长Scm(重量)或Scm缺乏其C末端SAM域（Δ沙特阿拉伯M） ，并在大量清洗后，通过SDS-PAGE和放射自显影术对样品进行分析。B类，Scm-SAM结构域对于Scm的高效sumoylation至关重要。在存在或不存在Ulp1 dsRNA的情况下，用编码FLAG-Scm（WT）或FLAG-Scm（ΔSAM）的表达载体瞬时转染S2细胞。对裂解产物进行SDS-PAGE并通过抗FLAG免疫印迹进行评估。

果蝇S2细胞中抗Sumoylation的Scm更有效地被招募到Ubx主要PRE中

PcG蛋白与超双胸主要PRE，称为PRED类(图3A类)，以保持沉默超双胸(30). 最近的研究表明，Scm与苍蝇S2细胞和幼虫影像盘中的PRE相关(17,34)以及PRC1和PRC2亚单位。因此，我们使用ChIP测试Scm-sumoylation状态的改变是否影响其在PRE的染色质结合D。在接下来的ChIP实验中，产生了与所示区域相对应的PCR扩增子图3A类使用抗Pc、Ph、Scm和PRE的抗体对S2细胞进行ChIP分析D类相互作用最初通过半定量终点PCR进行评估。我们发现Scm与该PRE区域显著相关(图3A类)其分布反映了Ph和Pc的染色质结合。

为了扩大这些发现，我们通过对瞬时转染了所示FLAG-Scm表达结构的S2细胞进行抗FLAG-ChIP和定量实时PCR，分析了共轭缺陷Scm突变体和组成性SUMO-olized模拟SUMO-Scm融合(图3,B–D类). 与未转染的对照细胞相比，我们发现野生型FLAG-Scm在PRE高水平表达，并且FLAG-ScmΔSAM与超双胸PRE水平大大低于野生型Scm的观察值(图3B类). 这与之前的研究一致，研究表明Scm-SAM结构域是PcG介导的抑制所必需的(15,22). 直接测试钪酰化对其向超双胸主要PRE，我们对暂时表达共轭缺陷型FLAG-Scm的S2细胞进行抗FLAG-ChIP。虽然在210、574或624位含有单个赖氨酸到精氨酸突变的Scm形式能够以与WT-Scm类似的方式结合PRE（数据未显示），但缺乏所有三个公认SUMO连接位点（K210R/K574R/K624R）的FLAG-Scm更有效地被招募到超双胸主要PRE(图3C类).

为了模拟SUMO结合形式的Scm，我们将SUMO（残基1-86）融合到Scm的N末端，并通过ChIP评估PRE靶向性。虽然SUMO-Scm融合不太可能与真正的SUMO-Scm共轭物表现出相同的行为，但SUMO融合技术已被用于在许多情况下准确地重述共轭活性(10,35,36). 当FLAG-SUMO与全长Scm融合时，观察到PRE占用率显著降低（与FLAG-Scm WT相比）(图3D类). 与这一发现一致，通过SUMO与缺乏SAM结构域的Scm缺失突变体的融合，FLAG-ScmΔSAM所见的低水平PRE募集进一步降低。

Sumoyalization的全局变化改变了Scm对PRE的靶向D类

为了进一步研究SUMO和Scm之间的联系，我们评估了RNAi干扰sumoylation后Scm对PRE的招募。用抗GFP、SUMO或Ulp1的dsRNA处理铜诱导的FLAG-Scm稳定S2细胞系，并用抗FLAG-Western blot评估Scm的sumoylation状态(图4A类). 正如预期的那样，SUMO RNAi阻止Scm-SUMO结合物的形成，而耗尽Ulp1会增加Scm-sumoylation。已知这些RNAi条件会导致SUMO共轭物光谱的全球变化(25). 抗SUMO免疫印迹表明，用SUMO-dsRNA处理细胞可以有效地阻止结合物的形成，并且Ulp1 RNAi增加了一些sumoylated蛋白的出现(图4B类). 通过抗FLAG ChIP对这些样本进行分析，发现SUMO的缺失会增加Scm-PRE的关联，而Ulp1 RNAi可能会导致Scm向PRE的招募略有减少(图4C类). 这些发现表明，磺胺嘧啶的磺酰化降低了其招募到超双胸之前。

Sumoylation减少导致Ubx表达减少并可能诱导半翅转换表型

招募Scm加入PRED类预计是防止不当表达超双胸因为我们之前的结果表明，Scm的sumoylation调节其与超双胸主要PRE，我们选择评估超双胸SUMO共轭的整体扰动后的表达水平。用靶向GFP（对照）、SUMO或Ulp1的dsRNA转染S2细胞超双胸通过定量RT-PCR评估表达(图5A类). 与对照组相比，超双胸SUMO水平降低的细胞中的表达显著降低。相比之下，通过敲除Ulp1增强Scm的sumoylation会导致高于正常水平超双胸表达水平。超双胸对露台的发展至关重要。略微减少超双胸表达，例如超双胸杂合子，产生由一个或多个异位鬃毛和缰绳体积增加组成的不同轻度缰绳到翅膀转化表型。更强超双胸功能丧失的特征是出现异位的翅膀组织，并可能导致完全的绞腹到翅膀的转变。进一步评估SUMO在调节超双胸表达，我们在幼虫发育过程中生成SUMO RNAi克隆，以确定对成年笼头形态的潜在影响。与许多发育过程中的既定作用一致，克隆斑块中缺乏SUMO的成年人表现出一系列缺陷，包括翅膀缩小和腿部畸形（数据未显示）。还观察到Haltere的转变，从异位刷毛的出现到翅膀组织的显著生长(图5B类). 为了证实这一结果，我们使用Gal4驱动器（A9-Gal4）在吊带中表达SUMO-dsRNA。这些笼头有多处缺陷，与观察到的类似超双胸-零杂合子，包括异位鬃毛形成和增大的大小(图5C类).

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sumoylation的全球变化导致PcG靶基因的表达改变，并产生同源转化表型。 A类，培养中果蝇属细胞，sumoyalization抑制超双胸用GFP、SUMO或Ulp1 dsRNA处理.S2细胞，并且超双胸通过定量RT-PCR测定表达水平。这个第5C号法案转录本用于正常化超双胸通过与GFP对照组比较，确定表达水平和-倍变化。B类当SUMO RNAi克隆在发育过程中产生时，会出现绞翅转化表型。在幼虫发育过程中诱导产生SUMO-dsRNA的随机克隆，并解剖出翅膀组织大量生长的笼头进行显微镜分析。C类，当A9-Gal4驱动笼头中SUMO dsRNA的表达时，会产生温和的笼头到翅膀表型。A9-driven SUMO RNAi导致笼头比正常大，并且有一个或多个异位鬃毛。D类arm-Gal4驱动的Ulp1或SUMO敲除会产生胚胎分割缺陷。Ulp1或SUMO dsRNA通过arm-Gal4驱动器的作用在发育中的胚胎中表达，胚胎角质层显示类似的融合或缺失的牙本质带。

胚胎发生过程中表达的单个PcG基因缺失可产生角质层表型，其中所有牙本质带都转化为一个片段身份的拷贝。例如，当母体和合子Scm被移除时，所有的齿带都会转换为第八腹部节的齿带(16). 为了评估SUMO在胚胎发生过程中调节Scm功能的可能性，我们评估了表达arm-Gal4-driven SUMO或Ulp1-dsRNA的胚胎的角质层表型，SUMO和Ulp1缺失的胚胎显示出一系列缺陷，包括缺失和融合的腹部牙本质带(图5D类). 有趣的是，在每个RNAi背景中观察到的缺陷与强PcG突变体中常见的后分化角质层表型并不相似。相反，RNAi表型与先前在双杂合突变胚胎中观察到的相似酸碱度2和其他各种PcG等位基因（包括Scm公司) (37). 这些表型可能反映了PcG对分割基因的控制，这已被遗传和分子研究所揭示(16,37,–40). 观察到的角质层表型也与多个PcG蛋白受sumoylation调节或作为SUMO结合系统的效应器的想法一致。

讨论

Sumoylation阻止Scm招募到PRE和抑制PcG目标

在本研究中，我们证明果蝇属多梳组蛋白Scm是SUMO结合的靶点，我们的结果表明sumoylation是Scm功能的重要调节因子。特别是，我们观察到一种缺乏主要SUMO受体位点的Scm可以更有效地被招募到超双胸主要PRE比野生型Scm(图3C类). 对这一发现的最简单解释是，Scm的sumoylation阻断了其功能，因此消除SUMO受体赖氨酸会增强Scm介导的沉默。然而，突变结合位点或SUMO与这些位点的共价连接都可能导致Scm与Scm功能负调控因子的相互作用减少，正如协同控制基序中包含sumoylation位点的转录因子结合底物所建议的那样(24). 为了区分这两种可能性，我们评估了SUMO-Scm融合的PRE靶向性以及全球扰动的sumoylation的影响体内通过RNA干扰耗尽SUMO蛋白酶Ulp1或SUMO本身。SUMO-Scm融合体在PRE时积累的能力降低D类(图3D类). 抑制Scm的sumoylation会增加其PRE结合，而增加SUMO-Scm共轭物的形成会减少预结合Scm的量(图4C类). 这些RNAi诱导的Scm PRE关联的变化以预期的方式与Scm介导的超双胸在培养细胞中(图5A类). 此外，成人表型分析表明，减少sumoylation的条件可以产生与PcG沉默增加一致的同源异型转化(图5,B类和C类). 综上所述，这些结果表明，Scm的sumoylation抑制了Scm抑制其靶基因的能力。

三个已确定的Scm sumoylation位点中只有一个位于特征功能域内；赖氨酸210在两个甲基赖氨酸结合MBT重复序列中的第一个内。先前的研究表明，抑制甲基赖氨酸结合的MBT重复序列的突变也阻止了Scm有效抑制超双胸翼想象盘的表达(19). 我们推测，SUMO附着在赖氨酸残基上可能会干扰甲基赖氨酸结合活性，从而阻止Scm抑制其靶点。SUMO对Scm抑制作用的另一种可能解释是，大分子SUMO部分的附着可以阻止与其他PcG成分（包括PRC1）的重要功能相互作用。

Scm SAM域似乎在调节Scm功能中起着多重作用。研究表明，缺乏SAM结构域的人工系留形式的Scm失去了抑制报告基因的能力，这表明SAM结构区在转录沉默中的直接作用与PRE靶向无关(41). 在这里，我们发现Scm-SAM结构域参与结合SUMO结合酶Ubc9，并且是高效Scm-sumoylation所必需的(图2,A类和B类). 虽然我们的总体研究结果表明，防止Scm的sumoylation应该增强其与PRE的关联D类相反，我们发现一种缺乏SAM域的Scm表现出减少PRE结合(图3B类). 这一结果可能反映了SAM结构域除了对sumoylation的贡献之外的其他作用，例如促进Scm齐聚、与PRC1亚基Ph的相互作用或与PcG沉默中其他成分的相互作用(15,20,21).

SUMO和PcG/TrxG功能之间的多重连接

SUMO途径和PcG/TrxG蛋白之间的许多联系是显而易见的。Pc的人类同源物（hPc2或Cbx4）作为CtBP、HIPK2、CCCTC结合因子（CTCF）和胱硫醚β合成酶（CBS）的E3 SUMO连接酶发挥作用(9,42). 此外，PcG蛋白Pho和TrxG蛋白Osa都是最近在蛋白质组学筛选中鉴定出来的，以鉴定新的果蝇属SUMO共轭靶(11). 人体PRC2组件SUZ12和EZH2可以由SUMO修改(43). MEL-18是PRC1组分Psc的人类同源物，通过抑制HSF2和RanGAP1的sumoylation发挥抗E3 SUMO连接酶的作用(44).

也许最有趣的是，关于这里报道的结果，含有TrxG蛋白Tonalli（Tna）的SP-RING指状结构域是一种预测的SUMO连接酶，并且总纳突变导致多个同源异型转化表型，包括部分腹-翅转化，表明减少超双胸活动(45). 当使用RNAi在发育中的笼头中降低SUMO水平时，我们观察到类似的笼头到翅膀的转变(图5,B类和C类). 这两种结果可能在一定程度上是由于Scm磺酰化的损失，从而导致超双胸通过增加Scm介导的抑制表达。或者，降低SUMO水平可能会抑制SUMO与缰绳发育所需的其他特定靶点的结合，这可能是一种需要Tna作为E3型SUMO连接酶活性的sumoylation事件。

由于发现SOP-2秀丽线虫与Scm相似的PcG蛋白被酰化。在秀丽线虫，SUMO途径似乎增强了PcG功能。同样，SUMO特异性蛋白酶2（SENP2）的破坏和小鼠Pc2的sumoylation似乎通过促进PRC1向Hox基因启动子的募集来抑制基因表达(10). 因此，我们惊讶地发现果蝇属减少Scm与超双胸PRE和SUMO功能的降低与PcG靶区的过度扩张有关超双胸这可能反映了SUMO在PcG功能中的多重作用，其中一些可以拮抗，另一些可能增强PcG的功能。在秀丽线虫和小鼠，积极作用可能占主导地位，而在果蝇属拮抗作用明显更为重要。

总之，我们已经确定Scm是SUMO结合的靶点，并表明sumoylation是PcG介导阻遏的重要调节因子。我们确定Scm的sumoylation减少了其靶基因的抑制，至少部分是通过抑制与PRE的关联D类我们的分析支持这样一种观点，即Scm-SAM结构域除了可能充当Ubc9的对接平台外，还有助于Scm向PRE的募集，这允许Scm的有效sumoyalization。鉴于sumoyalization对Scm功能的明显抑制作用，我们推测改变Scm-SAM结构域对其结合伴侣的可及性可能在调节PRE募集和抑制中发挥作用。鉴于大量PcG/TrxG蛋白是SUMO修饰的靶点或效应器，在未来的研究中可能会观察到SUMO在调节同源基因表达方面的其他调节作用。

致谢

我们感谢Chongwoo Kim提供构建物，并感谢国家遗传研究所苍蝇库存中心提供本研究中使用的苍蝇线。

*这项工作得到了国立卫生研究院GM63596（给A.J.C.）和GM49850（给J.A.S.）的全部或部分支持。

2使用的缩写如下：

PcG公司
Polycomb组
个人
Polycomb公司
之前
多梳响应元件
TrxG公司
三胸组
Scm公司
大腿中部的性梳
SUMO公司
小泛素样修饰物
山姆
不育α基序
摄影师
胸膜同源的
PhoRC公司
全同源抑制复合物
MBT公司
恶性脑肿瘤
酸碱度
多形同胚的
CtBP公司
C末端结合蛋白
美国电气制造商协会
N个-乙基马来酰亚胺
小时
人类。

参考文献

1Ringrose L.，Paro R.（2007）开发 134, 223–232 [公共医学][谷歌学者]
2Klymenko T.、Papp B.、Fischle W.、Köcher T.、Schelder M.、Fritsch C.、Wild B.、Wilm M.、Müller J.（2006）基因发育。 20, 1110–1122[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
三。Czermin B.、Melfi R.、McCabe D.、Seitz V.、Imhof A.、Pirrotta V.（2002）单元格 111, 185–196 [公共医学][谷歌学者]
4Müller J.、Hart C.M.、Francis N.J.、Vargas M.L.、Sengupta A.、Wild B.、Miller E.L.、O’Connor M.B.、Kingston R.E.、Simon J.A.（2002）单元格 111, 197–208 [公共医学][谷歌学者]
5Saurin A.J.、Shao Z.、Erdjument-Bromage H.、Tempst P.、Kingston R.E.（2001）自然 412, 655–660 [公共医学][谷歌学者]
6曹荣、筑田、张勇（2005）分子电池 20, 845–854 [公共医学][谷歌学者]
7Francis N.J.、Kingston R.E.、Woodcock C.L.（2004年）科学类 306, 1574–1577 [公共医学][谷歌学者]
8约翰逊E.S.（2004）每年。生物化学评论。 73, 355–382 [公共医学][谷歌学者]
9Roscic A.、Möller A.、Calzado M.A.、Renner F.、Wimmer V.C.、Gresko E.、Lüdi K.S.、Schmitz M.L.（2006）分子电池 24, 77–89 [公共医学][谷歌学者]
10康熙、齐毅、左毅、王琦、邹毅、施瓦茨·R·J、郑杰、叶荣堂（2010）分子电池 38，191–201[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
11Nie M.、Xie Y.、Loo J.A.、Courey A.J.（2009年）公共科学图书馆一号 4，e5905。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
12邓总、万明、隋刚（2007）分子细胞。生物。 27, 3780–3792[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
13Zhang H.、Smolen G.A.、Palmer R.、Christoforou A.、van den Heuvel S.、Haber D.A.（2004）自然遗传学。 36, 507–511 [公共医学][谷歌学者]
14Shao Z.、Raible F.、Mollaaghababa R.、Guyon J.R.、Wu C.T.、Bender W.、Kingston R.E.（1999）单元格 98, 37–46 [公共医学][谷歌学者]
15Peterson A.J.、Mallin D.R.、Francis N.J.、Ketel C.S.、Stamm J.、Voeller R.K.、Kingston R.E.、Simon J.A.（2004）遗传学 167, 1225–1239[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
16Breen T.R.、Duncan I.M.（1986）开发生物。 118, 442–456 [公共医学][谷歌学者]
17Wang L.、Jahren N.、Miller E.L.、Ketel C.S.、Mallin D.R.、Simon J.A.（2010）分子细胞。生物。 30, 2584–2593[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
18Bornemann D.、Miller E.、Simon J.（1996）开发 122, 1621–1630 [公共医学][谷歌学者]
19Grimm C.、de Ayala Alonso A.G.、Rybin V.、Steuerwald U.、Ly-Hartig N.、Fischle W.、Müller J.、Mü的C.W.（2007）EMBO代表。 8, 1031–1037[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
20Peterson A.J.、Kyba M.、Bornemann D.、Morgan K.、Brock H.W.、Simon J.（1997）分子细胞。生物。 17, 6683–6692[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
21Kim C.A.、Sawaya M.R.、Cascio D.、Kim W.、Bowie J.U.（2005）生物学杂志。化学。 280, 27769–27775 [公共医学][谷歌学者]
22Bornemann D.、Miller E.、Simon J.（1998）遗传学 150, 675–686[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
23Ng J.、Hart C.M.、Morgan K.、Simon J.A.（2000年）分子细胞。生物。 20, 3069–3078[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
24Bhaskar V.、Smith M.、Courey A.J.（2002）分子细胞。生物。 22, 492–504[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
25Smith M.、Bhaskar V.、Fernandez J.、Courey A.J.（2004）生物学杂志。化学。 279，43805–43814[公共医学][谷歌学者]
26Clemens J.C.、Worby C.A.、Simonson-Leff N.、Muda M.、Maehama T.、Hemmings B.A.、Dixon J.E.（2000）程序。国家。阿卡德。科学。美国。 97, 6499–6503[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
27Bhaskar V.、Valentine S.A.、Courey A.J.（2000）生物学杂志。化学。 275, 4033–4040 [公共医学][谷歌学者]
28Dubnicoff T.、Valentine S.A.、Chen G.、Shi T.和Lengyel J.A.、Paroush Z.、Courey A.J.（1997）基因发育。 11, 2952–2957[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
29Cao R.、Wang L.、Wang H.、Xia L.、Erdjument Bromage H.、Tempst P.、Jones R.S.、Zhang Y.（2002）科学类 298，1039–1043[公共医学][谷歌学者]
30Wang L.、Brown J.L.、Cao R.、Zhang Y.、Kassis J.A.、Jones R.S.（2004）分子电池 14, 637–646 [公共医学][谷歌学者]
31Ratnaparkhi G.S.、Duong H.A.、Courey A.J.（2008）开发公司。免疫学。 32, 1290–1300[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
32Mukhopadhyay D.，Dasso M.（2007）生物化学趋势。科学。 32, 286–295 [公共医学][谷歌学者]
33薛毅、周峰、傅灿、徐毅、姚欣（2006）核酸研究。 34，W254–W257[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
34Grimm C.、Matos R.、Ly-Hartig N.、Steuerwald U.、Lindner D.、Rybin V.、Müller J.和Müler C.W.（2009）EMBO J。 28, 1965–1977[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
35Ross S.、Best J.L.、Zon L.I.、Gill G.（2002）分子电池 10, 831–842 [公共医学][谷歌学者]
36Nayak A.、Glöckner-Pagel J.、Vaeth M.、Schumann J.E.、Buttmann M.、Bopp T.、Schmitt E.、Serfling E.、Berberich-Siebelt F.（2009）生物学杂志。化学。 284, 10935–10946[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
37McKeon J.、Slade E.、Sinclair D.A.、Cheng N.、Couling M.、Brock H.W.（1994）分子遗传学。 244, 474–483 [公共医学][谷歌学者]
38Pelegri F.、Lehman R.（1994）遗传学 136, 1341–1353[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
39Nègre N.、Hennetin J.、Sun L.V.、Lavrov S.、Bellis M.、White K.P.、Cavalli G.（2006）《公共科学图书馆·生物》。 4，e170。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
40Oktaba K.、Gutiérrez L.、Gagneur J.、Girardot C.、Sengupta A.K.、Furlong E.、Müller J.（2008）开发单元 15, 877–889 [公共医学][谷歌学者]
41Roseman R.R.、Morgan K.、Mallin D.R.、Roberson R.、Parnell T.J.、Bornemann D.J.、Simon J.A.、Geyer P.K.（2001）遗传学 158, 291–307[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
42Kagey M.H.、Melhuish T.A.、Wotton D.（2003）单元格 113，127–137[公共医学][谷歌学者]
43Riising E.M.、Boggio R.、Chiocca S.、Helin K.、Pasini D.（2008）公共科学图书馆一号 三，e2704。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
44Zhang J.、Goodson M.L.、Hong Y.、Sarge K.D.（2008）生物学杂志。化学。 283, 7464–7469[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
45Gutiérrez L.、Zurita M.、Kennison J.A.、Vázquez M.（2003）开发 130, 343–354 [公共医学][谷歌学者]
文章来自生物化学杂志由以下人员提供美国生物化学和分子生物学学会