生物化学杂志。2011年4月1日；286(13): 10939–10949.
eIF2的磷酸化促进抑制性ORF上游的核糖体旁路以增强CHOP公司翻译*
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拉克希米红宫
来自印第安纳州印第安纳波利斯市印第安纳大学医学院生物化学和分子生物学系46202
托马斯·贝尔德
来自印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学医学院生物化学和分子生物学系，印第安纳州46202
罗纳德·韦克
来自印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学医学院生物化学和分子生物学系，印第安纳州46202
来自印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学医学院生物化学和分子生物学系，印第安纳州46202
1通信地址：印第安纳波利斯印第安纳大学医学院生物化学和分子生物学系，635 Barnhill Dr.，Indiana University School，Indianapolis，IN 46202，电话：317-274-0549；传真：317-274-4686；电子邮件：ude.iupui@kewr. 2010年12月23日收到；2011年1月31日修订
摘要
为了应对不同的环境胁迫，真核生物起始因子-2（eIF2）的磷酸化迅速减少蛋白质合成，从而降低能量消耗并促进基因表达的重新编程，以修复应激损伤。作为基因表达变化的核心，eIF2磷酸化还增强了ATF4的翻译，ATF4是受综合应激反应（ISR）影响的基因的转录激活物。ISR增加了对缓解压力或触发凋亡至关重要的基因的表达。一个ISR靶基因编码转录调节因子CHOP，CHOP的积累对应激诱导的凋亡至关重要。在这项研究中，我们发现eIF2磷酸化诱导优先翻译CHOP公司通过一种涉及位于5′-前导的单个上游ORF（uORF）的机制CHOP公司mRNA。在没有应激和低eIF2磷酸化的情况下，uORF的翻译是阻止下游翻译的屏障CHOP公司编码区域。应激期间eIF2磷酸化的增强促进了uORF的核糖体旁路，因为它的起始位点环境较差，相反，它允许扫描核糖体翻译CHOP公司这种新的翻译控制机制解释了CHOP公司细胞的命运与磷酸化eIF2水平和应激损伤密切相关。
关键词：内质网应激、蛋白质合成、翻译、翻译控制、翻译调控
介绍
全球和基因特异性翻译的快速变化是对许多不同环境压力的反应。例如，由于内质网（ER）中错误折叠的蛋白质的积累，翻译受到抑制，2这可以防止分泌途径的进一步过载，并为基因表达的重组提供时间，重点是缓解压力。这种翻译控制的中心机制涉及蛋白激酶PERK/PEK对eIF2（eIF2～P）的磷酸化。eIF2是与启动子Met-tRNA结合的翻译起始因子我遇见和GTP并参与起始密码子的选择(1,——三). Ser-51处eIF2α亚基的磷酸化反应于内质网应激，阻断eIF2-GDP与eIF2-GTP的交换，从而减少整体翻译起始和随后的蛋白质合成。除PERK外，其他三种eIF2激酶对其他应激条件也有反应，包括营养缺乏诱导的GCN2、红细胞血红素缺乏激活的HRI和在抗病毒防御途径中起作用的PKR。
伴随着这种对全局翻译起始的抑制，eIF2～P选择性地增强了自动变速箱4mRNA，编码与代谢、抗氧化损伤保护和凋亡调节有关的应激相关基因的基本拉链转录激活物(三,——5). ATF4是一个整合来自PERK和其他eIF2激酶信号的共同下游靶点的想法导致了eIF2～P/ATF4途径统称为整合应激反应（ISR）(4). 优先翻译自动变速箱4eIF2～P期间的mRNA通过涉及两个上游ORF（uORF）的机制发生(6,——8). 5′-近端uORF1是一种积极的作用元件，它使核糖体能够重新启动下游ORF的翻译自动变速箱4成绩单(8). 当eIF2-GTP在非应激细胞中很容易获得时，完成uORF1翻译的核糖体继续向下游扫描，并在下一个编码区uORF2重新启动，uORF2是一种阻断自动变速箱4表达式。在应激条件下，eIF2～P和eIF2-GTP水平降低增加了扫描核糖体重新启动翻译所需的时间。延迟再启动允许核糖体扫描抑制性uORF2，而不是翻译自动变速箱4编码区(8). ATF4水平升高会诱导额外的基本拉链转录调控因子，如CHOP/GADD153和ATF3，它们共同指导对细胞修复或细胞凋亡重要的基因表达程序(4,5,9,10). eIF2～P反应的延迟翻译再启动机制也对GCN4的控制至关重要，GCN4是受酵母中一般氨基酸控制的基因转录激活物酿酒酵母(11,——13).
当eIF2～P抑制一般蛋白质合成时，ATF4靶向ISR转录物是如何翻译的？这个问题的一个答案是ATF4增加了GADD34的表达，这有助于通过靶向1型Ser/Thre蛋白磷酸酶对eIF2～P进行去磷酸化来反馈控制eIF2激酶反应(10,14,——17). 由此产生的eIF2～P降低允许在应激相关转录组重新编程后恢复蛋白质合成。然而，许多ISR基因产物的高表达与强健的eIF2～P一致，它们的表达对应激反应途径的实现至关重要。例如，在内质网或营养应激期间CHOP蛋白水平较高，而翻译起始仍然受到抑制(9,18). 此外，CHOP表达被认为是转录激活GADD34公司(17). 这表明CHOP公司当eIF2～P水平较高时，和其他ISR靶基因受到优先翻译(19,20). 支持这个想法，CHOP公司mRNA与氨基酸饥饿时的多聚体相关(19). CHOP蛋白合成的范围和持续时间被认为是改变ISR的关键，ISR从一种减轻细胞损伤的适应性途径转变为一种不适应性途径，从而触发细胞凋亡(三,21,22).
这项研究表明CHOP公司mRNA在应激过程中受到优先翻译，并描述了一种新的机制来响应eIF2～P的优先翻译。这个CHOP公司翻译控制机制涉及一个单独的uORF，该uORF阻止5′-先导的翻译CHOP公司mRNA。然而，在应激诱导eIF2～P的情况下，扫描核糖体通过一个过程绕过抑制性uORF，这一过程表明在Kozak一致序列较差的起始密码子处翻译效率降低。这项研究表明，eIF2～P可以调节涉及uORF的多种优先翻译机制，这些机制直接影响应激条件下细胞存活的关键ISR基因。
实验程序
质粒构建
编码5′-先导的HindIII-NcoI DNA片段CHOP公司信使核糖核酸，以及CHOP公司编码区，插入质粒pGL3衍生物中HindIII和NcoI限制位点之间。产生的结果TK-CHOP-Luc公司质粒包含5′-先导序列CHOP公司融合到组成型TK启动子下游的荧光素酶报告子。该结构中使用的引物序列如下：正义5′-GCTCAAGCTTTTATCTTAGCCTACACGTATT-3′和反义5′-TCATGAGTGCCATGACTGCACGTGG-3′。CHOP uORF的ATG1和ATG2密码子分别或结合突变为AGGP（P）TK公司-CHOP-Luc公司质粒，并按照制造商的说明使用定点突变试剂盒（Stratagene）生成该突变和随后的突变。为了扩展uORF以与荧光素酶编码区重叠帧外TK-CHOP-Luc公司突变为GGA。uORF中的密码子24（AGA）P（P）TK公司-CHOP-Luc公司将其突变为TGA以产生荧光素酶报告子，该报告子带有uORF的缩短版本，uORF编码氨基酸残基1–23。对所有质粒进行测序，以确保只有所需的变化。
上游的顺序更改CHOP公司uORF涉及在uORF上游引入PstI限制位点10个核苷酸P（P）TK公司-CHOP-Luc公司质粒。先前描述的干环结构5′-CTGCACCACACGGCCCCAAGCTGGCGCCGGTGGCTGCAG-3′，Δ克然后将−41 kcal/mol的值插入改性的P（P）TK公司-CHOP-Luc公司质粒。或者，通过将120-核苷酸序列插入PstI位点来扩展5′-先导。这个序列没有任何起始密码子和终止密码子，也没有预测到强烈的二级结构。来自uORF1的起始密码子上下文自动变速箱4与Kozak共识相同的被替换为CHOP uORF中的前四个密码子，包括ATG1和ATG2P（P）TK公司-CHOP-Luc公司质粒，生成P（P）TK公司-自动液位计自动变速箱油4-CHOP-Luc公司该替换涉及更换TATATC自动液位计TTGAAG公司自动液位计中的序列CHOP公司uORF与GCCACC自动液位计G.这些取代是通过序列和连接无关的克隆方法进行的(23).
这个CHOP公司核苷酸1至133的mRNA序列，包含CHOP公司uORF与萤火虫荧光素酶编码区一起插入pGL3的修改版本中。产生的质粒P（P）TK公司-uORF-Luc公司表达来自TK启动子的uORF-Luc融合蛋白。中的删除P（P）TK公司-uORF-Luc公司通过帧内删除CHOP公司uORF密码子14–34（Δ14–34）、14–23（Δ14-23）和23–34（△24-34）。Δ24–34版本的P（P）TK公司-uORF勒克也使用的uORF1自动变速箱4替换了CHOP公司融合蛋白的uORF部分。
细胞培养和双荧光素酶测定
MEF细胞来源于不锈钢（野生型eIF2α）和A/A公司（突变eIF2α-S51A）小鼠先前已被描述(24,25). MEF细胞在添加10%FBS的Dulbecco改良Eagle’s培养基（Cellgro）中培养，1 m米非必需氨基酸、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素，37°C。通过添加0.1或1μ米如图所示，将thapsigargin注入培养基中，然后培养12小时。质粒转染使用不锈钢和A/A公司MEF细胞生长到40%与FuGENE 6转染试剂融合（罗氏应用科学）。使用野生型或突变型的TK-CHOP-Luc公司或TK uORF勒克质粒和a雷尼利亚用作内部对照的荧光素酶质粒（Promega）。转染24小时后，用0.1μ米thapsigargin治疗12小时或无内质网应激。在较短的时间内，从4到6小时的应激，也显示CHOP-Luc表达显著升高，以响应内质网应激，支持上述结论。按照Promega说明书的说明进行双荧光素酶分析。数值是萤火虫比例的衡量标准与Renilla的比较荧光素酶单位（相对光单位）表示三个独立转染的平均值。雷尼利亚荧光素酶值在双重报告分析中没有显著变化。结果以三个独立实验得出的平均值±S.D.表示。与双荧光素酶分析平行，用qRT-PCR方法测量每个转染条件下萤火虫荧光素素酶mRNA的数量。
蛋白裂解物的制备及免疫印迹分析
在指示的应激条件或无应激条件下培养的MEF细胞用冷磷酸盐缓冲盐水（pH 7.4）冲洗两次，然后用含有50 m的溶液进行裂解米三氯化氢（pH 7.9），150 m米氯化钠、1%非奈特P-40、0.1%十二烷基硫酸钠、100 m米氟化钠，17.5米米β-磷酸甘油，10%甘油补充蛋白酶抑制剂（100μ米苯甲基磺酰氟，0.15μ米抑肽酶，1μ米leupeptin和1μ米胃蛋白酶抑制素）。将裂解液进行超声处理30 s，并通过离心进行预处理。根据制造商的说明，使用Bio-Read蛋白质定量试剂盒测定蛋白质含量。
用SDS-PAGE分离等量的蛋白质，然后将蛋白质转移到硝化纤维过滤器。分子量标记用于免疫印迹分析中蛋白质的大小测定。然后将转移的过滤器培养在含有20 m的TBS-T溶液中米三氯化氢（pH 7.9），150 m米NaCl和0.2%吐温20添加4%脱脂奶，然后用含有所示蛋白质特异性一级抗体的TBS-T溶液孵育。针对重组蛋白制备ATF4抗体(18). CHOP（sc-7351）抗体从Santa Cruz Biotechnology获得，β-肌动蛋白单克隆抗体（A5441）从Sigma购买。专门识别Ser-51磷酸化eIF2α的多克隆抗体购自BioSource（44-728G）。Scot Kimball博士（宾夕法尼亚州立大学好时医学院）提供了识别磷酸化或非磷酸化形式eIF2α的单克隆抗体。使用从Promega（G7451）获得的抗体，对转染有指示质粒的MEF细胞的细胞裂解液进行萤火虫荧光素酶蛋白的印迹。
将过滤器与所示抗体孵育后，过滤器在TBS-T中清洗三次，然后与辣根过氧化物酶标记的二级抗体和化学发光底物孵育。免疫印迹中的蛋白质通过将滤光片暴露在x射线胶片上或使用LI-COR Odyssey系统成像来可视化。图中显示的图像代表了三个独立的实验。
CHOP mRNA的转录起始位点
对应于5′末端的cDNACHOP公司mRNA表达于不锈钢用0.1μ处理MEF细胞米根据制造商的说明，通过使用RNA连接酶介导的RACE试剂盒（RLM-RACE试剂箱，Ambion）扩增thapsigargin或无应激。反义引物对应内源性CHOP公司用于测定的信使核糖核酸包括外引物5′-GGACGCGTGCAAGAGTAG-3′和内引物5′-TTCATGAGTGCCATGACTGCACGTGG-3′。用于放大的外部底漆CHOP-Luc公司mRNA 5′末端为5′-CGAATTCGAACGCAGAT-3′，与上述相同的内引物结合。然后在1.2%琼脂糖凝胶上使用电泳分析扩增产物。去除突出的DNA带，凝胶纯化并测序。转录起始位点被确定为连接到mRNA转录物5′的适配器序列的第一个3′核苷酸。
RNA分离和qRT-PCR
用指示的质粒转染MEF细胞，在指定的应激条件下处理并收获，并根据说明书使用TRIzol试剂（Invitrogen）制备总细胞RNA。用无RNase DNA酶（Promega）消化污染DNA。根据制造商的说明，使用Superscript III逆转录酶（Invitrogen）进行单链cDNA合成。使用Light Cycler 480 PCR系统（Roche Applied Science）和来自Applied Biosystems的SYBR Green PCR混合物进行相对mRNA水平的定量。萤火虫荧光素酶mRNA的量用雷尼利亚荧光素酶作为内部控制。使用的寡核苷酸引物如下：萤火虫荧光素酶5′-CTCACATGACTACATCAGC-3′和5′-TCCACACCTCGC-3′；雷尼利亚荧光素酶5′-GGAATTAAATGCTTACTACGTGC-3′和5′-CTTTGAAAAATGAAGACCTTAC-3′。内源性CHOP公司和自动变速箱4使用以下寡核苷酸引物测量mRNA水平：CHOP公司5′-CCTGCTTGGCTGACAGAGG-3′和5′-CTGCTCTCTCTTCCTTCATGC-3′；自动变速箱45′-GCCGGTTTAAGTTGTGCT-3′和5′-CTGGATTCGGAATGTGCT-3′。使用参考β-肌动蛋白对靶基因的定量进行标准化。所用引物为5′-GTATGGAATCCTGGCATC-3′和5′-AAGCACTTGGTGCACGAT-3′。使用Light Cycler 480软件（版本1.2.9.11）进行量化并生成内容提供商值。数值表示三个独立实验，标准偏差如所示。
CHOP mRNA的多糖体分析及翻译调控
如上所述培养MEF细胞，并用1μ米治疗6小时或无应激。收获前10分钟，用50μg/ml环己酰亚胺处理细胞。用含有50μg/ml环己酰亚胺的冷磷酸盐缓冲盐水（pH 7.4）溶液清洗细胞，并在20 m的溶液中制备细胞裂解物米三氯化氢（pH 7.5），5 m米氯化镁2，100米米NaCl和添加50μg/ml环己酰亚胺的0.4%Nonide P-40。将细胞裂解物通过23号针头，并在冰上孵育10分钟。通过短暂离心（在4°C下10000 rpm，10分钟）预滤细胞裂解物，然后将其分层到含有20 m的10-50%蔗糖梯度溶液上米三氯化氢（pH 7.5），5 m米氯化镁2，100米米氯化钠和50μg/ml环己酰亚胺。然后将蔗糖梯度置于Beckman SW-41Ti转子中，在4°C下以40000 rpm离心2 h。一部分未分离的细胞裂解物用于测定CHOP公司,自动变速箱4和β-肌动蛋白。使用Biocomp梯度站对梯度进行分级，并使用在线UV监测器记录254nm处RNA的吸光度。合成聚（A）的当量+将从Promega购买的荧光素酶RNA（10 ng/ml）添加到每个收集的部分。使用TRIzol LS试剂（Invitrogen）从每个组分中分离RNA，并根据制造商的说明使用Superscript III逆转录酶（Invit罗gen）合成单链cDNA。制备的cDNA用于测量CHOP公司,自动变速箱4，并编码β-肌动蛋白。qRT-PCR数据用RNA分离前添加的荧光素酶mRNA进行标准化。所示数据是三个独立实验的结果，标准偏差如所示。或者，培养至40%融合的MEF细胞转染野生型TK-CHOP-Luc公司使用FuGENE 6（Roche Applied Science）转染试剂，单独或组合使用ΔATG1和ΔATG2的质粒或突变变体。转染24小时后，用0.1μ米thapsigargin达6小时或无应激。然后对制备的细胞裂解物进行蔗糖梯度分析，并如上所述进行分馏。将等量的细菌控制RNA（Affymetrix）添加到每个蔗糖组分中，作为RNA分离和qRT-PCR分析的内部控制。如前所述，从每个组分中分离的RNA用于制备单链cDNA合成。每一组分中萤火虫荧光素酶的量被量化并标准化为推力在RNA混合物中添加细菌控制的mRNA。寡核苷酸引物用于推力mRNA测定如下：正向5′-AGGATGACGCAAATG-3′和反向5′-TGATCGCAATGGATA-3′。
结果
CHOP转录和翻译需要eIF2～P
为了响应ER压力，eIF2～P触发了自动变速箱4mRNA与抑制的全局翻译启动同时发生。这可以通过用一种有效的内质网应激剂thapsigargin治疗MEF细胞来说明(5). 在暴露于thapsigargin后1小时内，野生型MEF细胞表现出增强的eIF2～P，同时ATF4蛋白表达增加(A类). 相反，MEF细胞含有eIF2α磷酸化位点Ser-51的Ala(A/A公司)没有eIF2～P和最低水平的ATF4蛋白。除了平移控制，自动变速箱4据报道受转录调控自动变速箱4内质网应激6小时后的mRNA(B类) (26). 这一增长自动变速箱4内质网应激反应中的mRNA水平在A/A公司细胞。
eIF2α磷酸化增加CHOP公司表达对内质网应激的反应。 A类，野生型MEF细胞(重量)和表达非磷酸化eIF2α-S51A的突变细胞(A/A公司)如图所示，用内质网应激剂thapsigargin处理6小时，或无应激处理（0小时）。制备裂解物，并使用特异识别每个蛋白的抗体通过免疫印迹分析测定磷酸化eIF2α、总eIF2 a、ATF4、CHOP和β-肌动蛋白的水平。B类，从野生型和A/A公司用thapsigargin处理MEF细胞6小时（应激）或无应激，以及自动变速箱4和CHOP公司用qRT-PCR测定mRNA。
ATF4是ISR基因的转录激活物，例如CHOP公司mRNA。通过一种需要eIF2～P的机制，CHOP蛋白和mRNA水平在内质网应激反应中急剧增加(,A类和B类). 尽管eIF2～P水平较高，但CHOP蛋白表达增加，我们推断CHOP公司即使在全局翻译起始受到严重限制的情况下，mRNA也可能受到青睐。为了验证这一想法，我们使用蔗糖梯度离心法进行了多聚体分析。Thapsigargin治疗MEF细胞后，多糖体水平显著降低，同时游离核糖体和单糖体水平升高，这与抑制翻译起始相一致(). 翻译起始的减少取决于eIF2～P，因为当A/A公司用thapsigargin处理细胞(补充图1).
两者自动变速箱4和CHOP公司在内质网应激期间，mRNA优先与大的多聚体相关。将野生型MEF细胞暴露于内质网应激剂thapsigargin中6 h（应激）或不应激处理。然后在10–50%蔗糖梯度下通过离心分析细胞裂解物，并在254nm处通过吸光度测量轮廓。这个顶部面板突出显示40 S和60 S核糖体亚单位、80 S单体和多体。从蔗糖梯度收集的组分中制备总RNA自动变速箱4,CHOP公司和肌动蛋白编码转录物存在于内质网应激产生的七个组分中的每一个(强调)或未处理的细胞(没有压力)通过qRT-PCR测定。值表示为直方图对于每个分数。每次测量都要进行三个独立的实验，每个实验都要标明S.D。这个顶部面板是三个独立实验的代表。
在无应力条件下自动变速箱4成绩单，以占总数的百分比衡量自动变速箱4mRNA在蔗糖梯度的单体和小多体组分中最为丰富。在这种情况下，只有28%的自动变速箱4mRNAs与由与四个或更多核糖体相关的转录物组成的大型多聚体相关。相比之下，在ER压力下自动变速箱4大多聚体部分的转录物（67%与大多聚物相关），与早期报告一致自动变速箱4mRNA优先在eIF2～P上翻译(6,——8).CHOP公司mRNA在多聚体剖面中的分布模式与自动变速箱4成绩单(). 在没有压力的情况下，CHOP公司mRNA在单体和小多体中最为丰富，而内质网应激导致该转录物与大多体的关联性增加（在非应激状态下25%与大多体相关联，而在内质网胁迫下为52%）。作为对照，我们还测量了蔗糖梯度组分中的肌动蛋白mRNA，发现该转录物对内质网应激基本不敏感。
CHOP mRNA 5′-先导的uORF促进CHOP翻译控制
接下来，我们讨论了CHOP公司信使核糖核酸指导翻译控制对内质网应激的反应。的转录起始点CHOP公司通过5′-RACE和DNA测序测定MEF细胞在有或无应激状态下的转录物(A类). 的转录CHOP公司发生在与胁迫条件无关的同一位点，导致5′-先导序列162个核苷酸的长度。这个CHOP公司先导序列编码单个uORF，代表脊椎动物中高度保守的34-残留多肽(B类) (27). 在保守残基中值得注意的是位于位置1和4的Met残基（由指定为ATG1和ATG2的密码子编码），在uORF的羧基末端提供了两个可能的起始密码子和碱性氨基酸残基。
5′-先导序列的作用CHOP公司翻译控制中的转录本使用P（P）TK公司-CHOP-Luc公司报告者，其中包含编码小鼠的cDNA片段CHOP公司5′-先导片段融合到最小萤火虫荧光素酶下游TK公司发起人。CHOP-Luc公司内质网应激使野生型MEF细胞的表达增加3倍(C类). 相反，荧光素酶活性在A/A公司缺乏eIF2～P的细胞，其对内质网应激的反应没有明显变化。a的转录起始点P（P）TK公司-CHOP-Luc公司报告人与内源性CHOP公司(A类)，并且在CHOP-Luc公司mRNA水平在测试条件下，与CHOP公司针对eIF2～P的信使核糖核酸定向翻译表达(C类).
早期研究表明uORF的翻译可以抑制下游的翻译CHOP公司编码区(27). 确定eIF2～P和压力导致优先翻译的潜在机制CHOP公司，我们在5′-先导部分构建了一系列突变P（P）TK公司-CHOP-Luc公司并分析了它们对内质网应激反应中表达的影响。首先，我们讨论了CHOP公司mRNA翻译通过cap依赖的核糖体扫描进行，或者通过内部翻译起始过程，如内部核糖体进入位点（IRES）介导的起始来促进(28,29). 干环结构（Δ克将−41 kcal/mol）的值插入uORF 5′(A类). 最小CHOP勒克在MEF细胞中观察到表达，与应激条件无关(). 这一结果支持了以下观点：CHOP公司翻译涉及从核糖体的5′末端对核糖体进行过程扫描CHOP公司成绩单。
uORF抑制CHOP公司翻译。图示的野生型和突变型P（P）TK公司-CHOP-Luc公司将报告者转染到野生型MEF细胞中，并对其进行双荧光素酶分析(强调)或者没有压力。的突变版本CHOP-Luc公司报告器包括在uORF上游插入干环结构，以及X（X）表示单独或组合替代AGG的uORF的ATG1和ATG2。此外CHOP-Luc公司用qRT-PCR测定mRNA。每个测量值都进行了三个独立的实验，相对值用直方图表示，并与指示的S.D。
接下来，我们将uORF的ATG1和ATG2分别或联合突变为AGGP（P）TK公司-CHOP勒克记者。ATG1突变导致升高CHOP-Luc公司与野生型报告基因相比，在应激和非应激条件下的表达(). 在无应力条件下增加最大CHOP-Luc公司与野生型报告基因相比，ΔATG1突变体的表达，而在内质网应激期间，ΔATG1突变体的表达增加了约2倍(). 总之，这些结果表明，在内质网应激过程中，诱导作用减弱，表达ΔATG1突变体的MEF细胞增强约2倍，野生型细胞增强约4倍。ATG2缺失导致CHOP-Luc公司与野生型对应物相比，在无应力和应力条件下的表达分别增加了7倍和4倍。此外，当ATG1和ATG2都发生突变时，荧光素酶活性最高(). 的级别CHOP勒克不同ATG突变体排列和胁迫排列之间的mRNA具有可比性(). 这些结果支持这样的观点，即ATG1和ATG2都能够作为uORF的起始密码子，其中ATG2占主导地位。建议uORF抑制CHOP公司翻译，这种抑制功能可以通过压力和eIF2～P来克服。进一步支持此模型，野生型CHOP勒克mRNA被发现优先与用他psigargin处理的MEF细胞中的大多聚体相关，并且在没有应激的情况下，该转录物在二聚体部分中最丰富(). 相比之下P（P）TK公司-CHOP-Luc公司在无胁迫条件下，缺乏ATG1和ATG2的报道者在蔗糖梯度的多糖体组分6中最常见。在内质网应激期间，突变体CHOP-Luc公司在大的多糖体组分中转录物不太丰富，在蔗糖梯度的几个组分中广泛分布().
CHOP-Luc mRNA在内质网应激反应中优先与大多聚体相关。野生型MEF细胞转染了野生型的P（P）TK公司-CHOP-Luc公司报告者或ATG1和ATG2（ΔATG1 andΔATG2）均发生突变的版本。转染细胞暴露于thapsigargin(强调)6小时或无应力处理。然后通过蔗糖梯度离心分析细胞裂解物，并通过254nm处的吸光度监测组分(顶部面板)具有指示的40 S和60 S核糖体亚单位、80 S单体和多体。总RNA由组分制备CHOP-Luc公司从内质网应激中获得的七个组分中的每一个组分中存在的mRNA(强调)或未处理的细胞(没有压力)通过qRT-PCR测定。进行了三个独立的实验，并说明了每个分数的测量值以及S.D.值。
通过抑制uORF的核糖体漏扫介导CHOP翻译控制
我们考虑了两种模型，通过这两种模型应激和eIF2～P可以克服uORF在CHOP公司平移控制。第一种是“再活化”模型，它表明在低eIF2～P期间抑制性uORF翻译后，核糖体从CHOP公司mRNA，因此CHOP公司表情被压抑。在压力和eIF2～P作用下，翻译uORF的核糖体将恢复扫描并在CHOP公司编码区域。或者，在“旁路”模型中，核糖体在无应激条件下在uORF启动翻译(44). 在后一种模型中，uORF的翻译将排除下游的表达CHOP公司编码区域。为了应对压力和eIF2～P增加，扫描核糖体将绕过或扫描抑制性uORF，而在下游启动翻译CHOP公司编码区域。为了区分这两个模型，我们突变了CHOP公司uORF转换为一个义密码子（TGA转换为GGA），导致扩展的uORF与下游报告子的编码区在帧外重叠19个核苷酸(A类和). 荧光素酶活性P（P）TK公司-CHOP-Luc公司随着uORF的延长，其对内质网应激的反应与野生型报告者的测定结果相似。该结果强烈支持旁路模型，因为扩展的uORF预计不会干扰诱导的CHOP公司翻译。相比之下，在再初始化模型中，终止扩展uORF翻译的核糖体将是CHOP公司编码区，需要长时间3′至5′扫描才能表达CHOP，这是一个不太可能发生的事件(29,——33).
启动uORF翻译的强启动密码子上下文阻止抑制元件对内质网应激的旁路反应。野生型和指示的突变版本P（P）TK公司-CHOP-Luc公司将报告者转染到野生型MEF细胞中，并对其进行双荧光素酶分析(强调)或者没有压力。突变版本包括uORF编码终止密码子的替换（TGA到GGA），导致uORF的扩展，使其在帧外与吕克编码区域。此外，在没有ATG1的情况下，uORF的ATG2被一个强大的Kozak上下文所取代。或者，在uORF上游插入一个没有起始密码子和强预测二级结构的120-核苷酸片段。The relative amounts ofCHOP-Luc公司mRNA也通过qRT-PCR测定。每个分析都进行了三个独立的实验，相对值用S.D.表示。
接下来，我们讨论了uORF对eIF2～P反应的核糖体旁路的基础。我们考虑了核糖体旁路的两个想法如下：uORF中编码的ATG1和ATG2的起始环境较差CHOP公司mRNA到ATG1CHOP公司uORF，这两者都可能减少eIF2～P过程中uORF的翻译。起始密码子上下文是翻译起始效率的重要贡献者(34,——36). 的uORFCHOP公司在ATG1（TATATC自动液位计T） 和主ATG2（TTGAAG自动液位计A） 与Kozak共识序列相比，gcc（A/G）cc自动液位计G、 其中共识中−3和+4的大写字母对翻译启动最为关键。翻译起始语境自动变速箱4uORF1符合这一共识（GCCACC自动液位计G） ，此序列被替换为CHOP公司uORF，在没有ATG1的情况下替代主要的ATG2P（P）TK公司-CHOP-Luc公司记者(). Kozak的强烈共识被取代，导致股价大幅下跌CHOP-Luc公司在内质网应激下表达，与野生型报告基因相比减少了约2倍。的级别CHOP-Luc公司科扎克共识及其野生型对应物之间的mRNA具有可比性(A类). 这些结果表明，uORF中不太理想的起始位点环境导致了泄漏扫描机制，通过该机制，在应激条件下和高水平eIF2～P时绕过了抑制性uORF。
确定uORF之前的缩短引线长度对应力诱导是否重要CHOP公司翻译，异源120-核苷酸序列(8)没有任何起始密码子和终止密码子，也没有预测到的强二级结构，被插入uORF的上游P（P）TK公司-CHOP-Luc公司记者(A类). 插入该序列并没有改变CHOP-Luc公司表达，荧光素酶活性在内质网应激下增加4倍，与野生型报告者相似(). 在CHOP-Luc公司120-核苷酸插入时mRNA水平。这些结果表明，抑制性uORF在应激反应中的旁路并不依赖于相对较短的CHOP公司mRNA位于uORF的5′端和起始密码子之间。
uORF的羧基末端部分抑制下游CHOP ORF翻译
接下来我们研究了uORF抑制下游翻译的机制CHOP公司编码区域。在旁路模型中uORF抑制功能的基础可能是uORF翻译核糖体终止后会从CHOP公司mRNA；或者，uORF的平移可能导致平移延伸或终止中的阻塞，从而阻止下游的平移CHOP公司ORF公司。被截留的核糖体不仅可以阻止新生多肽的合成，而且还可以阻止从5′末端进行后续扫描CHOP公司mRNA。为了解决uORF在翻译中的抑制特性，我们构建了uORF和TK启动子表达的萤火虫荧光素酶之间的帧内融合。我们转染了结果P（P）TK公司-uORF-Luc公司将质粒导入野生型MEF细胞，通过免疫印迹分析（WT）发现荧光素酶活性最低，融合蛋白水平较低,A类和B类). 融合基因uORF部分的缺失分析，包括uORF密码子14-34（Δ14-34）和24-34（△24-34）的框内缺失，导致荧光素酶活性和可测融合蛋白的免疫印迹显著增加。相比之下，通过萤光素酶活性和融合蛋白的免疫印迹测量判断，uORF密码子14-23（Δ14-23）的去除显示出低uORF-Luc表达(,A类和B类). 的级别uORF-Luc公司表达融合蛋白的MEF细胞与全长uORF和缺失突变体的mRNA相似(A类). 这些结果支持uORF的3′-部分，包括密码子24到34，可以阻止翻译的观点。
uORF的羧基末端部分抑制CHOP公司翻译。 A、 P（P）TK公司-uORF-Luc公司编码uORF和萤火虫荧光素酶之间帧内融合的质粒被转染到野生型MEF细胞中，并对每个细胞进行双报告分析。这个P（P）TK公司-uORF-Luc公司如图所示，质粒包含全长uORF或包含密码子24-34、14-34或14-23缺失的版本。同时CHOP-Luc公司mRNA也通过qRT-PCR测定。对每个报告构造进行了三个独立的实验，并用S.D.表示了每个构造的相对值。B类使用识别萤火虫荧光素酶的抗体进行免疫印迹分析，确定包含全长uORF或指示缺失突变体的uORF-Luc融合蛋白的水平。还测量了肌动蛋白水平，以使裂解产物正常化。作为对照，用不含载体或只表达萤火虫荧光素酶的载体的MEF细胞制备的裂解物进行免疫印迹分析。C类，说明了P（P）TK公司-CHOP勒克将报告者转染到野生型MEF细胞中，在内质网应激或无应激期间进行双荧光素酶分析。突变版本包括将uORF的密码子24（AGA）突变为TGA，以生成uORF缩短版本的荧光素酶报告子。此外，如图所示，uORF的缩写版本与强大的Kozak上下文相结合。的相对水平CHOP-Luc公司mRNA也通过qRT-PCR测定。分别进行了三个独立的实验，并表示了相对值和S.D。
uORF在P（P）TK公司-CHOP-Luc公司通过在残基24引入终止密码子（AGA到TGA）(A类和C类). 的表达式CHOP-Luc公司与野生型报告者相比，在应激和非应激条件下显著增加(C类). 这些结果表明，uORF羧基末端部分的翻译会导致翻译延伸或终止受阻，这可以有效防止下游的后续起始CHOP公司编码区域。建议去除uORF的抑制部分，以允许大量的核糖体翻译uORF，从而沿着CHOP公司mRNA，并在下游ORF编码区重新启动。
我们之前建议用Kozak共识替代uORF中的ATG1和ATG2，以防止抑制性uORF对内质网应激的旁路反应(). 考虑到这一点，我们进一步推断，如果去除uORF的抑制部分，这将至少部分克服在P（P）TK公司-CHOP-Luc公司记者。这确实是高水平的CHOP-Luc公司在非应激条件下，MEF细胞中的表达与在表达野生型报告基因的ER-应激MEF细胞上测得的表达相似(C类). 注意，在内质网应激期间，荧光素酶活性由P（P）TK公司-CHOP-Luc公司包含Kozak共识和Δ24-34缺失组合的报告者与仅含羧基末端缺失的报告者不匹配。这表明，在这种压力环境下，下游的重新启动CHOP公司编码区是有限的，对eIF2～P的反应绕过抑制性uORF是优先翻译CHOP公司mRNA。
讨论
在这项研究中，我们探讨了eIF2～P可以重新校准蛋白质合成机制的潜在机制，以便单独评估mRNA，导致其翻译效率发生规定的变化。The 5'-leader of TheCHOP公司mRNA具有单个uORF，这是一个重要的屏障CHOP公司无应力条件下的平移(). 然而，作为对内质网应激的反应，诱导的eIF2～P有助于绕过抑制uORF，允许扫描核糖体在CHOP公司编码区(). 这种转换旁路机制的基础是CHOP公司uORF公司。uORF有两个编码的AUG，在脊椎动物的1和4位都是保守的(). AUG1或AUG2都可以作为起始密码子，尽管AUG2是主要的，正如发现uORF中第二个AUG的丢失导致了CHOP-Luc公司记者在没有压力的情况下，即uORF抑制功能的最大抑制(). eIF2～P引导AUG1和AUG2旁路的能力的核心是其翻译起始的非最佳序列背景，这一特征在哺乳动物的每个直系同源基因中都是保守的CHOP公司如所示B类在没有AUG1的情况下，将Kozak共识序列替换为AUG2，显著降低了ER应激和eIF2～P克服uORF抑制特性的能力().
eIF2α的磷酸化促进抑制性uORF的核糖体旁路，增强CHOP公司编码区域。在没有压力的情况下，eIF2～P较低，eIF2-GTP水平较高。建议核糖体结合5′端CHOP公司mRNA和扫描核糖体翻译uORF，导致翻译延长或终止受阻，以及低翻译CHOP公司编码区域。在应激期间，存在强健的eIF2～P，可以减少eIF2-GTP到eIF2-GDP的交换，这是为了减少由于启动密码子上下文不佳而在uORF处的翻译启动。因此，扫描核糖体绕过抑制性uORF，转而翻译CHOP公司编码区，具有一个具有强烈Kozak共识的起始密码子。
该模型的第二个核心特征是建议uORF的翻译来阻止翻译延长或终止(). 这一观点得到了以下观察结果的支持：uORF-Luc公司融合基因翻译不良，融合蛋白或荧光素酶活性表达最低(,A类和B类). 对这个翻译块至关重要的是uORF残基24-34，因为删除uORF的这一片段可以翻译融合蛋白。当uORF的这一区域被移除时P（P）TK公司-CHOP-Luc公司记者，荧光素酶活性在应激和非应激条件下均显著升高(C类). 即使Δ24–34与包含被替换到uORF中的Kozak起始上下文的起始密码子结合，也可以观察到这一点。在这种情况下，eIF2α～P不会促进uORF的旁路，但这种抑制片段的丢失受到影响，这可能导致下游发生一些翻译再启动CHOP公司编码区域。
Jousse也支持多肽序列对uORF抑制功能的重要性等。(27)第一次报道uORF可以抑制CHOP公司表达式。虽然在早期的研究中没有讨论这种抑制的缓解机制，但发现通过将uORF缩短为三个长度的残基或引入改变编码多肽序列而不是长度的移码，uORF的抑制特性被显著克服。这些结果支持uORF多肽羧基末端部分的翻译对uORF的抑制功能至关重要的模型。尽管RNA序列或结构就其本身而言似乎不会成为下游翻译的障碍CHOP公司编码区，这些RNA元素可能是一个促成因素。uORF可以阻止mRNA下游编码区的核糖体再启动，并可能干扰从5′端开始的后续核糖体扫描CHOP公司mRNA。
CHOP和ATF4翻译控制的基本方式不同
的机制CHOP公司平移控制与所描述的不同自动变速箱4在几个基本方面。虽然两者都有CHOP公司和自动变速箱4调控包括将uORF编入其mRNA的5′-先导，uORF的结构和功能不同。自动变速箱4及其酵母对应物GCN4型需要两个或多个uORF(1,8,11). 5′-近端uORF作为一种正调控元件，促进下游ORF的核糖体扫描和翻译再启动。由诱导的eIF2～P引导的eIF2-GTP水平决定了这种再启动事件的速度。在无应激期间，当eIF2至P减少且eIF2-GTP丰富时，核糖体再启动在相邻的抑制性uORF处迅速发生，从而阻断转录因子的表达。在以下情况下自动变速箱4，单个抑制uORF就足够了，而GCN4号机组mRNA包含三个短的抑制uORF，任何一个uORF的翻译都被认为足以从转录物中释放核糖体。当eIF2～P在压力期间增强时，导致的eIF2-GTP水平降低会延迟翻译再启动。因此，重新启动核糖体可以扫描更直接的下游抑制性uORF，而不是在自动变速箱4编码序列。
虽然CHOP公司监管模式与自动变速箱4翻译控制——eIF2～P可以绕过抑制性uORF的想法，它在没有促进翻译再启动的积极作用uORF帮助下实现这一点。相反CHOP公司已经设计了一个单一的uORF，其翻译启动上下文较差，可以绕过它来响应eIF2～P(). 通过这种方式，eIF2～P诱导的翻译控制不再被视为需要两个或多个uORF，而是在特定的上下文中使用一个uORF就足够了。
应激诱导的eIF2～P似乎没有显著降低43S起始前复合物（由40S核糖体亚单位和包括eIF2-GTP-Met-tRNA在内的翻译起始因子组成我遇见)至5′端CHOP公司mRNA。这是与共享的功能自动变速箱4和GCN4号机组平移控制模型。支持这一观点的是CHOP-Luc公司无论在何种压力条件下，ATG1和ATG2均显著升高(). 此外，CHOP-Luc公司在内质网应激期间，缺乏两个起始密码子的mRNA在蔗糖梯度组分中广泛分布(). 相反，eIF2～P被建议通过启动密码子上下文较差的uORF增强扫描核糖体的旁路。我们尚不了解我们的uORF模型中eIF2～P旁路的生化基础CHOP公司平移控制。eIF2-GTP水平降低可能导致对CHOP公司uORF公司。这种旁路的其他因素可能是eIF2～P本身，或eIF2￣P对其他关键翻译因子表达的调节，或随后促进旁路的调节器CHOP公司uORF在应力条件下。值得注意的是，翻译因子eIF1、eIF2α和18S rRNA的特定片段对于识别起始密码子上下文非常重要(29,37). 据报道，高水平的eIF1可以提高基因起始密码子选择的严格性(38). 然而，我们的初步研究表明，内质网应激期间eIF2～P不会显著改变MEF细胞中eIF1的水平，而在thapsigargin治疗的早期阶段仅略有降低（数据未显示）。
eIF2～P抑制选择性mRNA的一般翻译和优先翻译，例如自动变速箱4和CHOP公司eIF2～P对总翻译的抑制可以不同程度地降低mRNA全基因组的翻译，一些基因转录受到严重抑制，尽管其他基因转录物对eIF2￣P更具耐药性。翻译抑制的梯度模型表明，翻译机制可以在转录物全基因组之间划分，以确定抑制的程度。抑制的程度可能涉及每个基因转录物的5′-先导的无数特征，也可能涉及3′-非翻译区域。考虑到eIF2～P可以增强具有起始密码子的基因编码区的旁路，起始密码子上下文低于最佳起始密码子，这一特征可能是翻译受到严重抑制的mRNA之间的一个区别特征。相比之下，启动的最佳Kozak环境可能有助于增强eIF2～P期间基因转录物的翻译抗性。
CHOP翻译控制在应激反应中的作用
的表达式CHOP公司是ISR和调节细胞生存以应对环境压力的核心。尽管ISR可以发挥重要的适应性功能，但慢性应激条件和关键靶基因的表达不减，例如CHOP公司，可能导致发病(10,22,39). 这样，ISR就变得不适应环境，它指导关键的适应性功能，可以改善环境应激期间发生的细胞损伤。高水平的CHOP可以指导许多基因的转录，这些基因可以促进caspase激活和凋亡(三,17,22,40,——42). 除了转录和翻译调控之外，CHOP公司mRNA和蛋白质会快速转换，半衰期在2到4小时之间(21). 因此，CHOP蛋白水平与当前应激损伤水平和eIF2～P密切相关。转录和翻译调控的结合允许在内质网应激期间CHOP快速增加，并随着应激的缓解和eIF2～P水平的降低，CHOP公司翻译水平急剧下降CHOP公司mRNA和蛋白质容易腐烂。该模型强调CHOP水平与eIF2～P的量密切相关，eIF2￣P的量根据细胞应激程度迅速调整。当压力从急性转变为慢性时，这些调节机制将引导CHOP蛋白及其靶基因产物持续升高，从而触发凋亡途径。
多种应激途径被认为有助于在特定环境应激期间实现CHOP转录活性水平。陈等。(20)建议，连同eIF2～P，CHOP公司翻译可以通过磷酸化eIF4E及其与eIF4G的关联进行调节。在早期的报告中，低浓度茴香霉素的治疗增加了CHOP公司mRNA水平和增强CHOP公司通过一种机制进行的翻译可能涉及p38 MAPK/Mnk1和雷帕霉素途径的哺乳动物靶点的激活。这种替代信号方案也可能有助于CHOP公司通过涉及uORF的过程进行翻译CHOP公司mRNA，提示受应激调节的多个信号通路可能在CHOP公司翻译。p38蛋白激酶磷酸化CHOP蛋白也被认为可以调节其转录活性，因此这种MAPK可能通过多种机制参与CHOP功能的调节(43). 未来，重要的是确定这些附加应力路径是否通过拟议的旁路机制与eIF2～P一起发挥作用，或是否需要涉及uORF或5′-先导的其他特征的替代平移控制过程CHOP公司mRNA。
致谢
我们感谢Souvik Dey和Brian Teske的有益讨论。
2使用的缩写如下：
- 急诊室
- 内质网
- 情报、监视与侦察
- 综合应力响应
- uORF公司
- 上游ORF
- qRT（定量放射治疗）
- 定量RT
- 比赛
- cDNA末端的快速扩增
- MEF公司
- 小鼠胚胎成纤维细胞
- TK公司
- 胸苷激酶。
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