美国生理学杂志肾生理学。2011年3月；300（3）：F721–F733。
内皮细胞增殖和间充质转化受损导致急性肾损伤后血管稀疏
,
1 ,1 ,1 ,2 ,2 ,1 ,1 ,2 ,2和2 Jasmina Spahic公司
以下部门1细胞和综合生理学
尼科尔·克尼
2印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学印第安纳生物显微镜中心肾脏科医学
亨利·芒
2印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学印第安纳生物显微镜中心肾脏科医学
赛义德·昌齐·阿什蒂亚尼
以下部门1细胞和综合生理学
罗伯特·巴卡拉奥
2印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学印第安纳生物显微镜中心肾脏科医学
布鲁斯·莫里托利斯
2印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学印第安纳生物显微镜中心肾脏科医学
蒂莫西·萨顿
2印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学印第安纳生物显微镜中心肾脏科医学
以下部门1细胞和综合生理学
2印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学印第安纳生物显微镜中心肾脏科医学
通讯作者。 转载请求和其他通信地址：印第安纳大学医学院细胞和综合生理学系D.P.Basile，印第安纳州印第安纳波利斯市巴恩希尔医学院635号，MS 334博士，邮编：46202（电子邮件：ude.iupui@elisabpd). 2010年9月15日收到；2010年11月28日接受。
摘要
急性肾损伤导致肾微血管丢失，但内皮细胞的命运以及潜在的血管内皮生长因子（VEGF）介导的保护机制尚不清楚。通过重复给予BrdU（每天两次）和与CD31或cablin共定位内皮细胞，分析Sprague-Dawley大鼠缺血再灌注（I/R）损伤后肾脏的累积细胞增殖。I/R后2天内无法检测到增殖内皮细胞，7天后仅占BrdU阳性细胞的～1%。VEGF-121保留了I/R后的血管丢失，但不影响内皮细胞、血管周细胞或管状细胞的增殖。通过用成纤维细胞标记物S100A4定位内皮标记物（CD31、cablin或注入番茄凝集素）来确定内皮-间充质转化状态。这种结构在I/R后6 h内显著，并持续至少7天。Tie-2-cre转基因与黄色荧光蛋白（YFP）杂交使用报告小鼠追踪内皮细胞的命运，并显示I/R后与S100A4和平滑肌肌动蛋白共定位的YFP阳性细胞的间质扩张。VEGF-121减弱了YFP细胞的间质扩张。转基因小鼠的多光子成像显示了与血管相关的YFP阳性血管细胞的改变，其特征是体内灌注受限。综上所述，这些数据表明，AKI后血管脱落是内皮细胞表型转变和再生能力受损共同作用的结果，这可能导致慢性肾脏疾病的进展。
关键词：毛细血管、成纤维细胞、纤维化
急性肾损伤（AKI）仍然是一个严重的临床问题，发病率和死亡率不断增加(10,43). 存活患者的肾功能通常会恢复。然而，一些研究表明，大量AKI患者易患慢性肾病（CKD）(1,11,14). 此外，肾移植术后移植肾功能延迟与初始恢复后继发的功能丧失密切相关(29). 这些观察结果表明，长期肾功能的急性肾损伤与CKD进展之间存在因果关系。
使用缺血再灌注（I/R）的AKI啮齿动物模型已用于研究损伤过程以及随后的修复和恢复过程。除了肾小球滤过率降低外，严重的I/R损伤还会导致近端肾小管损伤和坏死或凋亡导致细胞死亡(32). 上皮细胞的增殖是恢复和再生反应的重要组成部分(28). 在动物模型中，外源性添加上皮有丝分裂原（如EGF、HGF或IGF-I）可增加上皮细胞增殖，而衰老时增殖受损与恢复受损有关(27,35).
肾血管系统也因I/R损伤而受损。与近端小管相比，肾血管缺乏有效的再生能力，导致I/R后血管密度持续降低30-50%(4,12). 叶酸诱导肾损伤的其他啮齿类动物模型中也有血管密度降低的报道(45)，输尿管梗阻(9)或对一氧化氮合酶（NOS）的抑制作出反应(30). 血管密度的降低可能会通过促进缺氧、损害血流动力学和钠调节反应而导致慢性肾病和高血压，从而产生重要的功能后果(2,三,17,33).
AKI期间血管丢失的机制部分与体液营养线索的存在或缺失有关(2,5). 实验性AKI后瞬时表达的TGF-β的免疫中和作用可以保护肾血管结构，并减少恢复5周后出现的肾小管间质成纤维细胞数量(38). 此外，实验性AKI后血管内皮生长因子（VEGF）的表达暂时降低；给予非肝素结合型血管内皮生长因子（VEGF-121）保护大鼠免受血管脱落的影响，并缓解长期功能异常(19). 有趣的是，在重塑早期给予VEGF可以起到保护作用，但延迟给予VEGF（即i/R后3周）并不能提供任何长期的i/R功能保护(19).
目前对血管重塑所涉及的细胞事件以及血管内皮生长因子（VEGF）如何影响AKI后的此类事件的理解尚不清楚。VEGF给药可以通过改善早期内皮细胞损伤和/或部分通过增殖促进血管再生反应来保护血管结构。然而，目前还没有研究专门针对AKI的内皮增殖反应，包括或不包括内皮有丝分裂原的影响。虽然基于形态学和内皮屏障研究有内皮损伤的证据，但缺乏证据表明I/R诱导内皮细胞死亡。最近的一项研究，Horbelt等人(12)在I/R损伤后Tie-2/GFP小鼠肾脏中，TUNEL显示激活的caspase-3适度表达，但不能识别内皮细胞凋亡。内皮细胞丢失的另一种解释是可能的表型转变为间质/成纤维细胞表型。内皮-间充质转化（endoMT）不仅可以解释由此导致的肾微血管丢失，还可以解释I/R损伤恢复后明显的小管间质成纤维细胞沉积。因此，本研究的目的是评估以下假设：AKI后血管丢失是由于内皮细胞增殖反应和/或表型转换受损所致，VEGF-121可能调节其中一个或两个过程。
方法
动物。
根据美国国立卫生研究院（NIH）的政策，在实验过程之前和期间对大鼠进行护理实验动物护理和使用指南所有研究方案均事先获得印第安纳大学动物保护和使用委员会的批准。
雄性Sprague-Dawley大鼠（约250 g）取自Harlan（印第安纳波利斯），成对饲养在标准鞋盒笼子中。纯合B6.129X1-Gt（ROSA）26Sortm1（EYFP）成本/J雌性小鼠（杰克逊实验室库存编号006148）与半合子雄性Cg-Tg（Tek-cre）12Flv/J（杰克逊实验室库存编号004128）交配。研究中使用的Cre阳性后代通过使用标准PCR程序和Cre引物序列（5′-GCGGTCGTGGCAGTAAAAACTATC-3′和5′-GTGAACAGCATTGGTCACTT-3′，产生约100 bp的扩增子）从尾部DNA中鉴定。
小鼠及其幼崽被关在标准的鞋盒大小的笼子里，12:12小时的光暗周期。动物被安置在12:12小时的光-暗循环中，并提供标准的实验室食物（特克拉德，哈兰）和随意提供的水。
手术和治疗。
如前所述，对大鼠进行AKI(19). 用氯胺酮（100 mg/kg ip）和戊巴比妥钠（25 mg/kg ip。在中线切口后，在双肾的肾蒂上放置微血管夹。35分钟后，松开夹钳，观察再灌注情况。假手术组接受相同的治疗，但不触及肾脏。
如前所述在小鼠中进行AKI(12). 用5%异氟烷诱导麻醉，然后维持在1.5%异氟烷。将小鼠放在加热的手术垫上。中线切口后，将微血管夹置于肾蒂上18分钟，然后松开。
VEGF-121是Scios（加利福尼亚州山景城）慷慨赠送的礼物，并作为载体稀释在0.9%氯化钠中。在一些研究中，大鼠或小鼠服用VEGF-121，剂量为100μg·kg−1·天−1sc，每天两次注射，第一次给药开始于再灌注时。在一些研究中（参见结果)，BrdU在0.9%NaCl中稀释，每天两次，持续7天，剂量为120 mg/kg。
为了测量肾功能，将尾血样本收集到肝素化小管中。对于大鼠，使用肌酐II分析仪（Beckman Coulter）测定血清肌酐值，而通过毛细管电泳测定小鼠的血清肌酐（德克萨斯大学西南医学院O'Brien肾病中心）。由此产生的伤害与之前的研究结果一致(19)VEGF给药对车辆治疗对照组的肌酐值没有影响。
在研究结束时，根据需要用氯胺酮（50–100 mg/kg ip）和戊巴比妥钠（25 mg/kg ip）对动物进行深度麻醉。采集肾脏并冷冻或固定用于免疫组织化学程序，如下文更详细描述的。在一些研究中，通过静脉注射生物素化番茄红凝集素（1.25 mg/kg番茄凝集素；Vector Laboratories）（安乐死前5分钟）来鉴定功能性血管，该凝集素仅标记灌注血管中的内皮细胞(42).
内皮细胞培养。
从Sprague-Dawley大鼠身上快速取出肾脏，放入4-5 mlα-MEM和5%胎牛血清中（西格玛，密苏里州圣路易斯，Hyclone，Logan，UT的血清）。用手术刀将组织切碎后，用1 mg/ml胶原酶/淀粉酶溶液（印第安纳波利斯州罗氏市）在37°C下培养45–60分钟，每10分钟用移液管移液一次，以帮助消化。离心后，溶解残余红细胞（红细胞溶解缓冲液，Sigma），并通过70μm细胞过滤器过滤细胞（宾夕法尼亚州匹兹堡费希尔）。样品被阻断后（Fc阻断，1μg/百万细胞；PharMinen，Bedford，MA），用兔抗cablin和FITC-标记的山羊抗兔二级抗体对细胞进行染色。染色后，将细胞重新悬浮在含有15%FBS、5 ng/ml血管内皮生长因子（Sigma）、50 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（Sigma）和50μg/ml内皮细胞生长补充剂的α-MEM中，并通过40μm细胞过滤器（Fisher）过滤两次。然后以1×10的比例对细胞进行分类6使用FACS Vantage分拣机（加州Hercules Bio-Read），每毫升细胞数。在鉴定之前，将产生的阳性细胞培养2天。
免疫组织化学。
这些研究中使用的主要抗体如下：本研究使用的兔抗cablin抗体如前所述(8). 兔抗CD31/PECAM（SEW31）抗体是P.Newman博士（威斯康星州东南血液中心）慷慨捐赠的。兔抗S100A4/FSP-1从Dako获得（#A511401）；小鼠抗BrdU抗体直接与Alexa fluor 488偶联，从Invitrogen中获得；从Abcam（编号ab290）中获得小鼠抗黄荧光蛋白（YFP）；小鼠α-SMA取自Invitrogen no.18–0106。
对于检测番茄凝集素结合的光学显微镜研究，根据标准技术，对福尔马林固定石蜡包埋切片进行脱蜡处理，并在二甲苯中重新水化，降低EtOH浓度。将载玻片与链霉亲和素结合的碱性磷酸酶孵育，并用硝基蓝四氮唑（矢量蓝，矢量实验室）进行显影。根据我们之前的方法，在清洗和随后的亲和素和生物素阻断步骤（Zymed）后，使用红色AEC作为底物（Zymed-S100A4/FSP-1）检测到S100A4/FSP-1(37).
在组织中进行免疫荧光研究，这些组织在100%冰镇甲醇中浸泡固定，并使用振捣器在～100μm处切片。对于内皮特异性标记物CD31或cablin的免疫荧光分析，由于这两种主要抗体均来源于兔，因此开发了特定的方法。用2.1%的H2O（运行）245分钟，然后在含有0.1 M Tris、pH 7.5、含有0.9%NaCl、0.5%BSA（USB）、0.05%鱼皮明胶（Sigma）和0.1%Triton X-100（Sigma-）的封闭溶液中培养30分钟。序列中的第一个抗体在4°C下孵育约18小时，并分别以1:200000稀释液或0.0624μg/ml的浓度轻轻搅拌，用于抗cablin或抗CD31。在室温下，在封闭溶液中对组织进行3小时的彻底冲洗，至少进行三次改变。然后将组织在山羊抗兔HRP（1:10000 Southern Biotech no.4030-05）中孵育约18小时。冲洗后，根据制造商的说明（Perkin Elmer编号NEL744001KT），使用酪胺Cy3扩增试剂盒检测信号。然后将序列中的第二个抗体以较高的浓度培养18小时（卡布林为1:1000，PECAM为1:500），随后用FITC-结合的山羊抗兔IgG（Zymed#65–6111）培养可以直接检测到。对照实验表明，在该程序的初始阶段使用酪胺扩增检测到的一级抗体浓度太低，无法用FITC-结合的抗兔IgG抗体检测到，该抗体用于检测序列中的第二个一级抗体。在最后一次冲洗后，将纸巾放在载玻片上，并将其盖在50%甘油/20%Mowiol（Calbiochem）的溶液中，然后隔夜干燥。
上述方法针对其他双染色方案进行了修改。对于内皮细胞和成纤维细胞的双重标记，CD31或PECAM最初是使用酪胺扩增（Cy3或荧光素；Perkin Elmer）开发的，随后通过在抗S100A4（1:50）中培养组织，然后使用与FITC或Cy3结合的山羊抗兔IgG来标记成纤维细胞。
为了分析BrdU阳性内皮细胞，将甲醇固定的振动组切片（～100μm）在37°C的2 N HCl中培养1 h，然后在pH 8.4的硼酸盐缓冲液中中和20 min，随后进行PBS洗涤。然后封堵切片并放置在与AlexaFluor 488（Invitrogen#A21303）偶联的抗BrdU中。冲洗后，使用上述抗cablin和酪胺基Cy3显影法检测内皮细胞。
为了对黄色荧光蛋白进行染色，将组织固定在2%多聚甲醛中1h，转移到PBS中，并在4°C下保存直至使用。如上所述，使用兔抗GFP（1:200000）在100μm厚的振动切片中检测到YFP蛋白，并使用Cy3酪胺扩增进行开发。在一些组织中，如上所述对S100A4进行协同训练。在其他研究中，组织在IgG阻断后与小鼠抗α-SMA（1:50）孵育（M.O.M.Vector试剂盒，Vector Laboratories FMK-2201）。清洗后，将组织在与Alexa Fluor 488二级抗体（Invitrogen#A21131）结合的抗IgG2a中培养过夜。作为阴性对照，使用小鼠IgG2a同型（Invitrogen#MG2a00）代替初级抗体。
显微镜和组织分析。
使用配备Spot数码相机和图像采集软件（版本3.4.5；诊断仪器）的尼康Optiphot-2立式显微镜对组织进行光学显微镜观察。对于定量分析，通过肾皮质和外髓质的五个随机图像～0.24 mm2获得并用于手动计数S100A4/FSP-1阳性细胞。数据表示为每个场S100A4-阳性细胞。
对于荧光检测，使用配备Ar和HeNe激光器的蔡司LSM NLO共焦显微镜获得图像。使用×40浸水透镜获得图像。对于荧光素，488 nm激发，500-530 nm检测，而Cy3在545 nm激发，565-615 nm检测。
为了量化BrdU标记的细胞，使用对应于0.053 mm面积的标准1×变焦设置，获得了皮质和外髓质中的8张图像2; BrdU阳性细胞从图像中手动计数，并表示为每个场的阳性细胞数。为了区分共定位结构与相邻结构，使用2倍变焦设置从每个场获得四个不重叠的图像。如前所述，为了量化血管密度，从皮层和外髓质的4-5个随机图像中，对覆盖在任意12×12网格上的CD31染色结构进行计数(19); 数据以错误操作控制的百分比表示。对于YFP免疫组织化学定量，五个面积为0.053 mm的随机图像2获得；借助NIH image J软件对565–615范围内采集的图像进行表面积分析，数据表示为表面积百分比。
对于活体多光子显微镜，使用配备有MaiTai Deep-See可调谐激光（Spectra Physics/Newport，Santa Clara，CA）的Olympus FV1000-MPE共焦/多光子显微镜（宾夕法尼亚州中央山谷），通过腹膜后窗口通过左侧切口对戊巴比妥钠麻醉小鼠的左肾进行成像安装在奥林巴斯IX81倒置显微镜架上。成像时，通过麻醉小鼠的尾静脉注射200微升罗丹明结合右旋糖酐（500000 mol wt，3.25 mg/ml，0.9%盐水）。使用MetaMorph软件进行图像处理（Molecular Devices，Silicon Valley，CA）。
结果
使用抗CD31和抗cablin抗体对肾内皮细胞进行有效标记。
为了有效检测内皮动力学，我们首先验证了以前用于染色肾小管周围血管的抗cablin抗体的特异性(8,19). 使用抗cablin对胶原酶分散的大鼠肾细胞进行FACS分类，并将收集的细胞置于培养基中培养2天。结果培养的细胞含有乙酰化低密度脂蛋白，并表达血管性血友病因子和CD31/PECAM，这是内皮细胞的特征(). 采用双染色法比较cablin和CD31/PECAM的定位。CD31/PECAM通过Cy3的酪氨酸酶扩增、cablin定位以及FITC-标记的二级抗体的可视化来检测。在用Cy3进行酪胺扩增后，正常大鼠肾脏的肾小管周毛细血管中可见CD31染色，肾小球毛细血管（g）和小动脉（*；,A类和天). 抗钙蛋白抗体标记了相同的肾小管周毛细血管，但没有显著标记肾小球或小动脉的毛细血管(,B类和电子). 合并的图像(,C类和F类)表示两个信号的明显重叠。综上所述，这些数据表明，cablin抗体对标记肾小管周围微血管中的肾内皮细胞具有高度优先性。
Cablin抗体介导的大鼠肾脏细胞分选。将大鼠肾组织切碎，胶原酶消化，并使用产生的抗cablin抗体进行FACS。然后将Cablin+分选的细胞电镀并培养2天，通过观察乙酰化低密度脂蛋白摄取来评估内皮表型(A类)，von Willebrand因子染色(B类)CD31/PECAM染色的表达(C类). 中的样本B类和C类用DAPI复染。
大鼠肾小管周围毛细血管的Cablin/PECAM染色。使用酪胺增强法对甲醇固定的大鼠肾组织进行免疫荧光双重标记，如方法所示为Cy-3标记cablin的典型共焦图像(A类,天以红色显示），FITC-标记为PECAM/CD31(B类,电子，以绿色显示）。中显示的合并图像C类和F类显示肾小管周围血管广泛共定位。图像中的注释A类–C类，来自肾皮质，肾小球（以g表示）主要是PECAM+/cablin-，而小动脉天和电子（用*表示）也是PECAM+/cablin阴性。实验是通过染料反转进行的，并产生了类似的结果（未显示）；bar英寸天=25微米。
VEGF-121对I/R损伤后BrdU掺入的影响。
利用抗cablin的特异性来评估VEGF-121对AKI恢复期内皮细胞增殖的影响。对大鼠进行35分钟的I/R损伤，在I/R后1、2或7天的恢复期内每天重复两次给予BrdU，以评估细胞净累积增殖。根据cablin+染色的分布评估I/R和VEGF-121对血管密度的影响；在I/R后7天，与非手术对照组相比，皮质和外髓质的血管密度分别显著降低37%和49%。与以往研究结果类似(19)，相对于载体（未显示），VEGF-121不影响I/R后早期肾功能损失的峰值，但显著减弱I/R诱导的血管损失().
急性肾损伤（AKI）和血管内皮生长因子（VEGF）-121对肾缺血再灌注（I/R）恢复7天后肾血管密度的影响。所示为cablin免疫荧光染色微血管结构的形态计量学分析数据，该结构与任意网格线相交，并表示为假手术对照组的百分比；n个=每组5只动物*P（P）<0.05与非正常操作对照组†P（P）ANOVA和Student-Newman-Keuls事后测试显示，VEGF-121治疗组与车辆治疗组之间的差异<0.05。
用CD31-阳性结构对BrdU进行双重标记，有助于鉴别增殖的内皮细胞。在假手术大鼠肾脏的共聚焦切片中发现相对较少的BrdU（绿色）细胞，而在I/R损伤恢复7天后，BrdU阳性细胞大量存在(). 肾小管上皮内有明显的BrdU阳性细胞(，白色箭头），在包含两个内皮细胞（CD31-阳性；蓝色箭头，,A′和C′)和非内皮细胞（CD31-阴性；黄色箭头，,A′,B′,C′).
AKI恢复后肾小管上皮和血管内皮细胞中增殖细胞的鉴定。显示了一只大鼠肾脏的典型共焦图像，该大鼠每天两次服用BrdU，持续7天从I/R损伤中恢复。A类：绿色通道中的BrdU阳性细胞。B类：红通道中的cablin+内皮细胞。C类：合并图像。注意肾小管上皮细胞中BrdU的显著表达。放大倍率如所示A′,B′、和C′，对应于插入蓝色箭头表示间隙区域中的cablin+BrdU+细胞，而黄色箭头表示间隙区域中的cablin-/BrdU+细胞。放大倍数如所示A类.
BrdU阳性细胞的数量在每个连续时间点都会增加，并且外髓质中的细胞数量大约是皮质的两倍(). 在用BrdU治疗恢复7天后，95.4±1.1%的所有BrdU阳性细胞在小管内明显可见，而4.5±0.5%的阳性细胞在间质血管周围区（相比之下,顶部，使用,中间的和底部). 在BrdU阳性间质细胞中，大多数是非内皮细胞，而只有少数（1.0±0.2%）是BrdU+/CD31+内皮细胞。在I/R恢复后的前2天内未检测到BrdU+/CD31+细胞，尽管对血管有保护作用()，VEGF-121不影响BrdU在内皮、血管周围或管腔的掺入(). 这些数据强调了I/R损伤后肾内皮细胞的增殖能力有限，并且VEGF-121介导的保护可能通过非增殖机制发生。
在AKI恢复期间，VEGF-121对增殖缺乏影响。BrdU阳性细胞的数量是根据它们在管状细胞中的分布显示的(顶部)、内皮细胞(中间的)和血管周细胞(底部). 显示了AKI组恢复后1、2和7天的皮质和外髓质数据（开放栏，n个=每个时间点5个）和AKI VEGF-121治疗组（条纹条，n个=3）。假操作对照（填充棒）仅在7天内进行。在I/R损伤后的任何细胞室中，均未观察到VEGF-121对BrdU掺入的影响。
内皮细胞是I/R损伤后间质成纤维细胞的来源。
通过将成纤维细胞标记物FSP1/S100A4定位于血管内皮细胞，确定潜在的endoMT。在组织收获前5分钟，给假手术或I/R后大鼠静脉注射番茄凝集素（TL，生物素结合物）。手术大鼠皮层和外髓质TL修饰的肾血管(，蓝色污渍）。S100A4电池显示为红色(,B类和C类); 这些细胞的数量在I/R后6小时内显著高于假手术水平，并在假手术后至少7天内保持在假手术水平以上(). TL染色的血管结构中可见离散的S100A4+标记细胞，表明存在潜在的过渡状态(,插入). 例如，在再灌注6小时时，大量细胞被鉴定为TL阳性血管细胞（皮质6.4±0.8%；髓质外5.0±2.1%），而在随后的时间点，较小但持续水平的S100A4细胞被鉴定为TL阳性(，填充条）。相反，潜在的上皮-肾小管过渡状态相对较少；例如，再灌注6小时时，管状上皮细胞中仅观察到0.15%的S100A4细胞(，打开酒吧）。
肾I/R损伤后S100A4/FSP-1与番茄凝集素的共聚焦。生物素化番茄凝集素（TL）与血管内皮细胞的结合以蓝色显示，而在假手术大鼠肾脏中S100A4/FSP-1染色以红色显示(A类)和大鼠从I/R恢复6小时(B类)和7天(C类).插入：区域放大倍数更高B类这说明了S100A4染色在小管周围血管结构中的共定位（由黑色细箭头表示）。没有相应S100A4/FSP-1染色的血管结构也很突出（白色箭头）。注意到小静脉腔中存在S100A4/FSP-1+，早期出现巨噬细胞（AKI后6小时组，粗暗箭头）。放大倍数如所示A类对I/R损伤作出反应的S100A4/FSP-1+细胞总数的量化如所示天用于皮质和外髓质。电子：潜在的内皮-间充质过渡状态定义为S100A4+/凝集素+结构（填充条）和潜在的上皮-间充性状态定义为管状细胞中的S100A4+细胞（开放条）。ND显示再灌注24小时外髓质外条（OSOM）未检测到TL；n个=每组4只动物*P（P）<0.05，根据方差分析和Student-Newman-Keuls事后检验，差异显著。
此外，还使用免疫荧光组织化学进行了额外的双重染色，以进一步验证是否存在潜在的endoMT过渡状态，使用CD31/PECAM或cablin标记早期损伤状态下的肾内皮细胞。与TL观察到的结果类似，S100A4在错误操作的对照肾脏中并不突出，但在缺血后6小时的肾脏中很容易显现（在和红色). 无论使用哪种荧光标记内皮细胞和间充质细胞类型（CD31-Cy3，; 电缆-FITC，).
I/R损伤后CD31和S100A4的免疫荧光染色。有代表性的共焦图像来自于错位手术的大鼠肾脏(A类–C类)肾I/R损伤后6小时大鼠肾脏(天–我). S100A4染色通过荧光素的酪氨酸酶扩增实现(A类,天)而CD31染色直接使用Cy3标记的次级(B类,电子; 看见方法)，而合并的图像显示在C类和F类放大倍数如所示A类.D′,E′、和F′从轮廓区域放大，表示同时表达S100A4和CD31的细胞（白色箭头）。因遗漏初级抗体而产生的阴性对照以绿色、红色显示，合并设置如所示G公司–我分别是。每组5只动物的染色代表。
I/R损伤后cablin和S100A4免疫荧光的染色。肾I/R损伤后6小时大鼠肾脏的典型共焦图像(A类,B类、和C类)所示区域的放大图像如所示A′,B′、和C′Cablin染色通过荧光素的酪氨酸酶扩增实现(A类,A′)，而S100A4直接使用Cy3标记的次级(B类,B′看见方法)，而合并的图像显示在C类和C′放大倍数如所示A类。白色箭头表示双阳性细胞，而黄色箭头表示S100A4阳性/cablin-negative细胞。阴性对照（未显示）与.染色代表每组5只动物。
通过将表达内皮靶向cre重组酶（Tie2-cre）的转基因小鼠与漂浮的YFP报告小鼠杂交，以产生在内皮细胞及其后代中表达YFP的小鼠，建立了追踪内皮细胞命运的小鼠模型。Cre和YFP杂合子小鼠接受假手术或I/R，并在服用或不服用VEGF-121的情况下恢复14天。YFP阳性染色在假手术对照小鼠的肾小管周围血管结构中明显(,B类和C类). 从I/R恢复14天后，YFP阳性染色在肾小管间质区的分布增强，并伴有与S100A4的非同源共定位(,电子和F类)或者，在较小程度上，肌成纤维细胞标记物α-平滑肌肌动蛋白(,M（M）和N个). 在Cre阴性小鼠中，损伤后S100A4染色显著，但YFP抗体未检测到信号(). 重要的是，在经VEGF处理的动物中，YFP阳性染色的分布显著减弱(,G公司–我、和).
肾脏I/R和恢复对Tie2Core肾脏黄色荧光蛋白（YFP）表达及与S100A4和α-平滑肌肌动蛋白（SMA）共定位的影响+/−YFP公司+/−老鼠。转基因Tie2Core的共焦图像具有代表性+/−YFP公司+/−小鼠假手术恢复14天后(A类,B类,C类)肾I/R损伤后(天,电子、和F类)以及在I/R损伤后恢复期服用VEGF-121(G公司,小时,我). 荧光素显示S100A4/FSP-1的免疫荧光(A类,天,G公司)，Cy3-增强免疫荧光显示YFP表达(B类,电子,小时)，和相应的合并图像如所示C类,F类、和我中的白色箭头表示S100A4细胞与YFP的共染色天,电子、和F类在Tie2Core的AKI后组织中平行进行S100A4和YFP的控制免疫荧光−/−YFP公司+/−老鼠(J,K（K）,L（左）)，其中未观察到YFP的信号(K（K）). 对α-SMA和YFP进行了类似的定位研究；显示了I/R车辆处理小鼠的代表性图像(M（M）,N个,O（运行）). 箭头表示α-SMA和YFP染色的细胞。放大倍数如所示A类.
AKI和VEGF-121对转基因Tie2Core中YFP+细胞肾间质分布的影响+/−YFP公司+/−老鼠。数据来自肾皮质（开放条）和肾外髓质（填充条），表示为平均值±SE。YFP+免疫荧光的%表面积来自形态分析（参见方法). 这个n个括号中标明了每组的情况*P（P）不正常对照组<0.05#P（P）基于ANOVA和Student-Newman-Keuls事后测试，AKI后VEGF-121治疗组与车辆治疗组之间的差异<0.05。
采用多光子成像技术对假手术小鼠和IR后小鼠体内Tie-2-Cre/YFP小鼠的血管血流进行可视化。在假手术小鼠中，血管结构中可见YFP荧光，并使用红色荧光高分子右旋糖酐观察肾小管周围血管中的皮质血流(和补充电影；本文的在线版本包含补充数据）。相反，在完全缺乏流量或流量受限的肾小管间质区沉积了几个YFP表达细胞。血流受阻区域的YFP细胞显示出与错误操作小鼠肾脏（箭头位于与中的细箭头和补充电影）。
肾脏I/R和恢复对Tie2Core肾小管周围血管结构和流量的影响+/−YFP公司+/−老鼠。Tie2Cre的多光子图像+/−YFP公司+/−在假手术或肾脏I/R后14天，并在静脉注射罗丹明标记的右旋糖酐（MW 500000）后，通过麻醉动物的侧腹切口获得小鼠肾脏。A类：可以观察到含有标记右旋糖酐（红色）的未闭微血管，并与含有YFP的内皮细胞相邻，以绿色假彩色显示（白色细箭头）。通过这些容器的流动迹象很明显（见补充电影）。B类：在表达YFP（绿色）的管状间质中观察到相对较大的细胞。这些细胞位于流量减少或缺失的区域（用粗箭头表示，见补充电影）。棒材=25μm。
讨论
人们普遍认为，局部生长因子是根据AKI合成的，肾上皮的修复在一定程度上是由于这种营养活性(27,28). 上皮细胞向外源性生长因子增殖的进一步增加表明这些细胞在修复过程中具有高度增殖性(13,25,27,28). 肾血管丧失可能是由于对损伤缺乏适当的血管营养支持以及血管细胞反应性受损。缺氧时血管反应受损，肾缺氧立即加剧，AKI后血管收缩和毛细血管丧失导致血管反应受损(三). 虽然缺氧通常被认为会刺激促血管生成因子（如VEGF）的合成和释放，但在AKI后VEGF的表达并不增加，而是暂时减少(5). 有趣的是，其他以肾小管周围毛细血管脱落为特征的进展性肾病模型（例如低钾血症和衰老）表现出缺氧和VEGF表达的反常下降(18,34).
尽管有证据表明进展性肾间质疾病的血管营养支持减少，但重要的是要考虑血管细胞对损伤和外源性因子（如VEGF）的反应，以及潜在的治疗效用。血管内皮生长因子（VEGF）是一种有效的内皮细胞有丝分裂原，在体外和血管重塑过程中刺激内皮细胞增殖，以应对心脏组织、骨骼肌和肿瘤形成中的缺氧(26,41). VEGF-121是一种非肝素结合形式的VEGF，给药可保护AKI后大鼠的肾血管系统，并改善与盐摄入量增加相关的继发性并发症(19). 在这些研究中，只有在损伤过程早期接受VEGF-121治疗的组才能避免血管密度损失和随后的盐敏感性损伤，而延迟治疗不能防止随后的盐敏感损伤。有趣的是，Long等人(23)使用2周给药ANG II诱导的盐敏感性高血压模型；1周后开始延迟给予VEGF-121对组织损伤有好处，但不能恢复毛细血管密度，这表明肾脏中的VEGF保护可能独立于新生血管修复。基于这些观察结果，我们试图确定VEGF-121是否在I/R损伤早期促进内皮细胞增殖。
而内皮细胞增殖在肾小球起源的模型中有记录(31)，很少有研究检测肾小管周围血管对损伤的增殖反应。为了最大限度地检测增殖内皮细胞，重复给予BrdU长达7天。不出所料，肾小管细胞构成了绝大多数BrdU阳性细胞，随着肾再生的进行，其数量稳步增加。虽然发现了一些BrdU阳性的血管周/间质细胞，但大多数不是内皮细胞，而是与CD31阳性的内皮细胞非常接近。虽然在缺血AKI后的前2天内，肾小管明显增生，但在此时间范围内未发现BrdU阳性内皮细胞。此外，7天后，AKI/VEGF治疗后大鼠的BrdU-阳性内皮细胞数量小于每显微镜视野1个，这与假手术动物没有显著差异。我们认为，这种缺乏增殖是缺血后肾脏血管再生受损的基本基础。我们不得不指出，我们得出的最小肾内皮细胞增殖的结论是基于使用CD31对内皮细胞进行免疫组织化学标记的研究。虽然我们还不清楚增殖中内皮细胞CD31表达的变化，但重要的是要认识到，内皮细胞增殖后CD31的短暂降低会导致我们低估内皮细胞增殖的程度。
血管脱落的机制以及血管内皮生长因子对其的保护作用尚不清楚。由于血管稳定性的稳定状态可以被认为是促进血管再生和血管丢失的因素之间的平衡，因此检查内皮细胞增殖以及血管丢失的可能机制并确定VEGF-121对这两个过程的影响非常重要。在血栓性微血管病模型中，VEGF-121已被证明抑制人脐静脉内皮细胞以及肾小球和间质细胞的内皮细胞凋亡(40). 因此，VEGF对I/R后血管密度的保护可能是由于对凋亡的抑制。然而，在以前的研究中，我们无法一致地确定I/R损伤后的凋亡细胞死亡(12). 然而，由于TUNEL阳性结构被认为是非常短暂的，我们可能错过了损伤后的内皮细胞凋亡波。另外，缺血后细胞凋亡的比率可能太低而无法评估，但长期来看可能会产生深远的影响。因此，我们不能排除肾血管系统的某些保存是由于VEGF对细胞凋亡的抑制。
由于我们之前的研究无法确定I/R后内皮细胞凋亡，我们试图确定向间充质细胞类型的表型转变是否代表缺血后血管脱落的另一种机制。O'Riordan等人最近的研究支持了endoMT可能发生在肾脏的说法(30)他证明，NOS抑制培养的内皮细胞可刺激体外分化为肌纤维母细胞表型。此外，体内非加压慢性NOS抑制增加了肾脏中表达内皮和间充质标志物的细胞，表明存在潜在的过渡状态(30).
在目前的研究中，使用三种不同的内皮标记技术，通过对成纤维细胞标记物FSP-1/S100A4的共定位来识别endoMT转变：1)施用生物素化番茄凝集素，2)CD31/PECAM，以及三)小屋。所有这些都证明了在IR后早期存在过渡态。与凋亡内皮细胞的有限存在相反(12)从I/R中恢复后6 h内，endoMT过渡状态常见，持续长达7天。在相对较少的肾小管上皮细胞中发现FSP1/S100A4阳性细胞，这表明肾缺血后肾小管内皮/间充质过渡比endoMT罕见。
这些研究提出的一个问题与FSP-1/S100A4作为成纤维细胞标记物的使用有关。虽然FSP-1/S100A4也能标记巨噬细胞，但关于成纤维细胞特异性标记物还没有广泛共识(36)，它仍然广泛用于肾间质成纤维细胞的鉴定(39). 本研究中使用的抗体清楚地标记了巨噬细胞形态的细胞。有人可能认为，造血来源的内皮祖细胞，被称为血管生成巨噬细胞(44)，可能同时表达CD31和FSP-1/S100A4，并且这种细胞的鉴定代表了损伤后的浸润而不是过渡。然而，具有巨噬细胞形态的FSP-1/S100A4细胞并不与番茄凝集素共定位（参见). S100A4也在某些恶性肿瘤相关的迁移和转移中表达(16)以及支架损伤后的各种损伤组织，包括动脉平滑肌细胞(6). 因此，S100A4表达可能代表组织重塑过程中的细胞激活状态。
除了识别潜在的过渡状态外，我们还利用Cre-Lox转基因方法追踪内皮细胞损伤后的命运。这种方法与Iwano等人使用的方法类似(15)who标记了肾小管上皮细胞，并证明大量间质成纤维细胞来源于上皮细胞，以应对单侧输尿管梗阻，支持该模型中的上皮-间质转化。最近，Zeisberg等人(46)使用与当前研究中使用的方法类似的转基因方法，并证明在三种不同的间质纤维化模型中，大量间质成纤维细胞/肌成纤维细胞来源于内皮；即单侧输尿管梗阻性肾病、链脲佐菌素诱导的糖尿病肾病和阿尔波特肾病模型。
I/R后14天，肾间质中存在YFP阳性的S100A4和α-SMA细胞，这与该模型中相当一部分成纤维细胞来源于endoMT的说法一致。然而，很明显，循环细胞也有助于缺血后肾脏的部分成纤维细胞(7,21). 值得注意的是，与证明单侧输尿管梗阻（UUO）模型纤维化中上皮/间充质转化相似的Cre-Lox策略已应用于I/R。在这些研究中，肾小管上皮细胞在I/R损伤后脱分化和增殖，但间质中未发现管状细胞系(21). 这些结果与我们的共定位数据一致，表明在I/R模型中，肾小管上皮转变不是成纤维细胞的主要来源。最后，间质细胞来源于内皮细胞的结论与这些转基因动物中Tie-2/Cre启动子的保真度密切相关；虽然Tie-2是内皮细胞的一个公认标记物，但活化的周细胞也可能表达Tie-2。肾损伤诱导周细胞表达Tie-2将激活这些细胞及其子代中的YFP表达。根据Lin等人最近的研究(22)这表明周细胞在UUO后纤维化中起着重要作用，我们不能确定我们目前的研究是否反映了周细胞对成纤维细胞的可能贡献。
无论成纤维细胞的病因如何，endoMT都可以解释注射后肾脏管周血管数量减少的原因。以前的研究使用微血管充盈技术(4)或内皮细胞染色来测量血管损失(12,19). 使用内皮细胞Cre-lox-YFP转基因小鼠可以通过正常和恢复后肾脏中的标记结构同时显示灌注。在假手术动物中，通过右旋糖酐灌注鉴定，在血管边缘观察到YFP阳性细胞。然而，AKI后灌注与YFP标记细胞之间的关系发生了改变，因为在血流受损或无血流的间质区域存在多个形态不同的YFP阳性细胞。这些结果与endoMT是损伤后血管脱落的主要机制的建议一致。
由于VEGF-121似乎不诱导内皮细胞增殖，同时提供保护以防止血管丢失，因此有理由认为VEGF可能抑制endoMT过程。我们的观察结果支持这一观点，即VEGF治疗可以减轻但不能消除AKI后YFP阳性细胞的间质扩张。为了将这些结果联系起来，IR后肾脏中的不可逆血管丢失至少是由肾内皮细胞的两种特性引起的。首先，肾内皮细胞在反应性损伤中易发生endoMT，这一过程至少部分受到VEGF的抑制，并对应于肾VEGF表达暂时降低的时间(5). 其次，肾内皮细胞在损伤后几乎没有增殖能力，即使是对外源性VEGF-121作出反应。这可能是VEGF有效治疗时间窗有限的原因，即血管细胞在过渡到成纤维细胞/肌纤维细胞状态后无法参与血管再生。这也与I/R恢复后VEGF表达恢复后缺乏血管再生一致。
值得注意的是，本研究中使用的VEGF-121可能是也可能不是比VEGF-165更弱的内皮有丝分裂原(26). 因此，我们不能排除VEGF165在这种情况下确实可以促进内皮细胞增殖的可能性。然而，我们选择使用非肝素结合的VEGF-121，因为它很容易给实验动物注射。皮下注射后，可以在血浆中发现数小时(40)并以缺血组织为靶点(24). 相反，注射后血浆中不易检测到VEGF-165的给药(40). 此外，VEGF-121已被证明在其他肾脏疾病模型中具有有益作用，包括我们使用此处描述的模型进行的研究(19).
尽管缺氧作为进展性疾病的介质，不仅在AKI中，而且在许多情况下，其作用受到了相当大的关注，但其基础部分与受损的血管重塑过程有关。似乎有理由认为，重塑受损可能是由于肾内皮固有的低增殖能力和易转分化的特点所致。目前尚不清楚为什么肾内皮细胞似乎缺乏足够的增殖潜能。然而，很明显，并非所有血管床的所有内皮细胞都具有类似的生长潜能。有趣的是，Li等人(20)结果表明，与来自大脑、心脏、肺或肝脏的内皮细胞相比，来自肾脏的原代内皮细胞表达flk1/KDR/VEGFR2受体的比例较小。这些数据将与肾内皮细胞较低的增殖潜能相一致，并强调需要从特定血管床获得更多有关内皮细胞的信息，以了解其正常内源性生长潜能。未来的研究可能有助于确定肾内皮细胞是否可以被其他药物诱导增殖，或者内皮祖细胞是否可以被用作肾损伤后重建新血管形成的替代品。
赠款
这项工作得到了国家卫生研究院DK-063114（给D.Basile）、DK-77124和DK-79312（给T.Sutton）、DK-069408（给B.Molitoris）和George M.O'Brien Grant P30-DK-79312.的支持。印第安纳大学普渡大学印第安纳波利斯分校本科生研究机会项目为J.Friedrich提供支持，印第安纳大学生命健康科学实习项目为J.Spahic提供支持。
S.Changizi-Ashtiyani现住址：伊朗阿拉克阿拉克医科大学生理学系。
披露
作者未声明任何利益冲突，无论是财务还是其他方面。
参考文献
1Askenazi D、Feig D、Graham N、Hui-Stickle S、Goldstein SL。小儿急性肾功能衰竭患者的3-5年纵向随访.肾脏Int 69: 184–189, 2006 [公共医学][谷歌学者] 2巴西尔DP。缺血性急性肾损伤中的内皮细胞：对急慢性功能的影响.肾脏Int 72: 151–156, 2007 [公共医学][谷歌学者] 三。Basile DP、Donohoe DL、Roethe K、Mattson DL。缺血/再灌注损伤后慢性肾缺氧：左旋精氨酸对缺氧和继发性损伤的影响.美国生理学杂志肾生理学 284：F338–F3482003[公共医学][谷歌学者] 4Basile DP、Donohoe DL、Roethe K、Osborn JL。肾缺血损伤导致肾小管周围毛细血管永久性损伤并影响长期功能.美国生理学杂志肾生理学 281：F887–F8992001年[公共医学][谷歌学者] 5Basile DP、Fredrich K、Chelladurai B、Leonard EC、Parrish AR。肾缺血再灌注抑制VEGF表达并诱导新型VEGF抑制剂ADAMTS-1.美国生理学杂志肾生理学 294：F928–F9362008[公共医学][谷歌学者] 6Brisset AC、Hao H、Camenzind E、Bacchetta M、Geinoz A、Sanchez JC、Chaponnier C、Gabbiani G、Bochaton-Piallat ML。猪和人冠状动脉内膜平滑肌细胞表达S100A4，这是体外菱形表型的标记.循环研究 100：1055–10622007年[公共医学][谷歌学者] 7Broekema M、Harmsen MC、van Luyn M、Koerts J、Persersen AH、Kooten TG、van Goor H、Navis G、Popa ER。骨髓源性肌成纤维细胞对大鼠缺血再灌注后肾间质肌成纤维母细胞的数量和产生I型前胶原的作用.J Am Soc肾病 18: 165–175, 2007 [公共医学][谷歌学者] 8Charron AJ、Xu W、Bacallao RL、Wandinger-Ness A。Cablin：一种新的毛细血管基底膜蛋白.美国生理学杂志心脏循环生理学 277：1985年上半年至1996年上半年，1999年[公共医学][谷歌学者] 9骑士RL、福布斯MS、桑希尔BA。输尿管梗阻作为肾间质纤维化和梗阻性肾病的模型.肾脏Int 75: 1145–1152, 2009 [公共医学][谷歌学者] 11Coca SG、Yusuf B、Shlipak MG、Garg AX、Parikh CR。急性肾损伤后死亡和其他不良后果的长期风险：一项系统综述和荟萃分析.美国肾脏病杂志 53: 961–973, 2009[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 12Horbelt M、Lee SY、Mang HE、Knipe NL、Sado Y、Kribben A、Sutton TA。缺血性急性肾损伤小鼠模型的急性和慢性微血管改变.美国生理学杂志肾生理学 293：F688–F6952007年[公共医学][谷歌学者] 13休谟D、谢斯林斯基DA、科英布拉TM、梅萨纳JM、加尔瓦奥C。表皮生长因子促进缺血后急性肾功能衰竭肾小管细胞再生和修复，加速肾功能恢复.临床研究杂志 84: 1757–1761, 1989[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 14Ishani A、Xue JL、Himmelfarb J、Eggers PW、Kimmel PL、Molitoris BA、Collins AJ。急性肾损伤增加老年人ESRD的风险.J Am Soc肾病 20: 223–228, 2009[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 15Iwano M、Plieth D、Danoff TM、Xue C、Okada H、Neilson EG。组织纤维化期间成纤维细胞来源于上皮的证据.临床研究杂志 110: 341–350, 2002[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 16Jenkinson SR、Barraclough R、West CR、Rudland PS。S100A4在乳腺癌转移体外模型中调节细胞运动和侵袭.英国癌症杂志 90: 253–262, 2004[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 17Johnson RJ、Schreiner GF。假设：获得性肾小管间质疾病在盐依赖性高血压发病机制中的作用.肾脏Int 52: 1169–1179, 1997 [公共医学][谷歌学者] 18Kang DH、Anderson S、Kim YG、Mazzalli M、Suga S、Jefferson JA、Gordon KL、Oyama TT、Hughes J、Hugo C、Kerjaschki D、Schreiner GF、Johnson RJ。衰老肾脏血管生成受损：血管内皮生长因子和血小板反应蛋白-1在肾脏疾病中的作用.美国肾脏病杂志 37：601–6112001年[公共医学][谷歌学者] 19Leonard EC、Friderich J、Basile DP。VEGF-121保护肾微血管结构并改善急性肾损伤后继发性肾脏疾病.美国生理学杂志肾生理学 295：F1648–F16572008年[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 20Li W、Johnson S、Shelley W、Yoder M。一些原代内皮细胞可以在体外维持造血干细胞的再生能力.实验血醇 32: 1226–1237, 2004 [公共医学][谷歌学者] 21Lin F、Moran A、Igarashi P。肾内细胞而非骨髓源细胞是缺血后肾脏再生的主要来源.临床研究杂志 115: 1756–1764, 2005[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 22Lin SL、Kisseleva T、Brenner DA、Duffield JS。周细胞和血管周围成纤维细胞是阻塞性肾纤维化中胶原蛋白生成细胞的主要来源.美国病理学杂志 173：2008年6月17日至16月27日[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 23Long D、Mu W、Price K、Roncal C、Schreiner GF、Woolf AS、Johnson R。血管内皮生长因子治疗不能改善血管紧张素II后高血压盐依赖期的微血管疾病.美国生理学杂志肾生理学 291：F1248–F12542006[公共医学][谷歌学者] 24Lu E、Wagner WR、Schellenberger U、Abraham JA、Klibanov AL、Woulfe SR、Csikari MM、Fischer D、Schreiner GF、Brandenburger GH、Villanueva FS。血管内皮生长因子受体的体内靶向标记：鉴定缺血组织的方法.循环 108: 97–103, 2003 [公共医学][谷歌学者] 25Miller SB、Martin DR、Kissane J、Hammerman MR。胰岛素样生长因子I促进大鼠缺血性急性肾小管坏死的恢复.《美国科学院院刊》 89: 11876–11880, 1992[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 26Neufeld G、Cohen T、Gengrinovitch S、Poltorak Z。血管内皮生长因子及其受体.美国财务会计准则委员会J 13: 9–22, 1999 [公共医学][谷歌学者] 27Nigam SK、Lieberthal W。急性肾功能衰竭。三、 生长因子在肾脏再生和修复过程中的作用.美国生理学杂志肾生理学 279：2000年11楼3层[公共医学][谷歌学者] 28宾夕法尼亚州诺尼，Schnellmann RG。急性肾功能衰竭后肾细胞修复与再生机制.药理学实验与治疗杂志 304: 905–912, 2003 [公共医学][谷歌学者] 29Ojo AO、Hanson JA、Wolfe RA、Leichtman AB、Agodoa LY、FK港。具有移植功能的肾移植受者的长期存活率.肾脏Int 57: 307–313, 2000 [公共医学][谷歌学者] 30O’Riordan E、Mendelev N、Patschan S、Patschan-D、Eskander J、Cohen-Gould L、Chander P、Goligorsky MS。慢性NOS抑制促内皮间充质转化.美国生理学杂志心脏循环生理学 292：H285–H294，2007年[公共医学][谷歌学者] 31Ostendorf T、Kunter U、Eitner F、Loos A、Regele H、Kerjaschki D、Henninger DD、Janjic N、Floege Jr。VEGF165介导肾小球内皮修复.临床研究杂志 104: 913–923, 1999[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 32巴达尼拉姆BJ。急性肾损伤诱导的细胞死亡：细胞凋亡和坏死的作用.美国生理学杂志肾生理学 284：F608–F6272003年[公共医学][谷歌学者] 33Pechman KR、De Miguel C、Lund H、Leonard EC、Basile DP、Mattson DL。肾缺血再灌注损伤的恢复与肾血流动力学改变、压力性尿钠减少和钠敏感性高血压有关.美国生理学杂志Regul Integr Comp Physiol 297：R1358–R13632009年[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 34Ray PE、Suga S、Liu XH、Huang X、Johnson RJ。慢性缺钾导致幼年大鼠肾损伤、盐敏感性和高血压.肾脏Int 59: 1850–1858, 2001 [公共医学][谷歌学者] 35Schmitt R、Cantley LG。衰老对肾脏修复的影响.美国生理学杂志肾生理学 294：F1265–F1272，2008[公共医学][谷歌学者] 36Schneider M、Kostin S、StröM CC、Aplin M、Lyngbaek S、Theilade J、Grigorian M、Andersen CB、Lukanidin E、Lerche Hansen J、Sheikh SP。S100A4在受损心肌中上调并促进心肌细胞的生长和存活.心血管研究 75: 40–50, 2007 [公共医学][谷歌学者] 37Spurgeon-Pechman KR、Donohoe DL、Mattson DL、Lund H、James L、Basile DP。急性肾功能衰竭后恢复易患高血压和继发性肾病，对钠升高有反应.美国生理学杂志肾生理学 293：F269–F278，2007年[公共医学][谷歌学者] 38斯珀吉恩·KS，Donohoe DL，Basile DP。转化生长因子-β在急性肾功能衰竭中的表达：受体表达、对细胞增殖、细胞数和血管形成的影响.美国生理学杂志肾生理学 288：F568–F5772005年[公共医学][谷歌学者] 39斯特鲁茨F，蔡斯伯格M。慢性肾脏疾病中的肾成纤维细胞和肌成纤维细胞.J Am Soc肾病 17: 2992–2998, 2006 [公共医学][谷歌学者] 40Suga S、Kim YG、Joly A、Puchacz E、Kang DH、Jefferson JA、Abraham JA、Hughes J、Johnson RJ、Schreiner GF。血管内皮生长因子（VEGF121）对血栓性微血管病大鼠肾梗死的保护作用.肾脏Int 60: 1297–1308, 2001 [公共医学][谷歌学者] 41Witzenbichler B、Asahara T、Murohara T、Silver M、Spyridopoulos I、Magner M、Principe N、Kearney M、Hu JS、Isner JM。血管内皮生长因子-C（VEGF-C/VEGF-2）在组织缺血情况下促进血管生成.美国病理学杂志 153: 381–394, 1998[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 42Xu B、Wu YQ、Huey M、Arthur HM、Marchuk DA、Hashimoto T、Young WL、Yang GY。血管内皮生长因子诱导内皮素杂合小鼠脑微血管异常.大脑血流代谢杂志 24: 237–244, 2004 [公共医学][谷歌学者] 43Xue JL、Daniels F、Star RA、Kimmel PL、Eggers PW、Molitoris BA、Himmelfarb J、Collins AJ。1992年至2001年医疗保险受益人急性肾衰竭的发病率和死亡率.J Am Soc肾病 17: 1135–1142, 2006 [公共医学][谷歌学者] 44Yoder MC、Mead LE、Prater D、Krier TR、Mroueh KN、Li F、Krasich R、Temm CJ、Prchal JT、Ingram DA。通过克隆分析和造血干/祖细胞原理重新定义内皮祖细胞.血液 109: 1801–1809, 2007[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 45袁HT、李XZ、Pitera JE、Long DA、Woolf AS。小鼠急性肾毒性后肾小管周围毛细血管丢失与血管内皮生长因子-A和低氧诱导因子-1α的下调相关.美国病理学杂志 163: 2289–2301, 2003[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 46Zeisberg EM、Potenta SE、Sugimoto H、Zeisberg-M、Kalluri R。肾纤维化中的成纤维细胞通过内皮细胞向间充质细胞的转化产生.J Am Soc肾病 19: 2282–2287, 2008[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 
