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美国国家科学院院刊。2001年3月13日；98(6): 3254–3257.
数字对象标识：10.1073/pnas.051484398
预防性维修识别码：PMC30640型
PMID：11248065

ACVR1B型(ALK4，激活素受体类型胰腺癌中的1B）基因突变

格洛丽亚·H·苏,*† 拉维·班萨尔,*† 凯萨琳·M·墨菲,† 伊丽莎白·蒙哥马利,† 查尔斯·杨致远,‡ 拉尔夫·赫鲁班,*†和斯科特·科恩*†§
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

DPC4（DPC4）已知用于调解由类型启动的信号β转化生长因子（TGFβ）以及其他TGFβ激活素和骨形态发生蛋白（BMP）等超家族配体蛋白质），但对此类非TGFβ受体的突变调查迄今为止一直是负面的。这里我们描述了基因结构和新颖性激活素I型受体的体细胞突变，ACVR1B型胰腺癌。ACVR1B型有先前未被描述为突变的肿瘤抑制基因。

Smad4（Dpc4/Madh4）是一个肿瘤抑制信号通路的介体β型转化生长因子（TGFβ）配体与其细胞表面受体和随后的磷酸化路径特异性Smad蛋白(1,2). 基因失活4摩洛哥迪拉姆,马德西和人类TGFβ受体基因肿瘤已经证实这种途径与肿瘤有关抑制(三——6). Smad4还可以调解由其他TGFβ超家族配体，如激活素和BMP（骨形态发生蛋白）(1)，但对这种非转化生长因子β的突变调查迄今为止受体呈阴性(6). 突变模式研究胰腺癌中已知的抑制基因及其生物学特性胰腺癌细胞的反应性表明在这些基因中寻找额外突变目标的吸引力相关途径。在这里，激活素I型受体的突变是描述。

材料和方法

组织样品和细胞系。

胰腺癌和远端胆总管癌1992年至1997年间，约翰·霍普金斯医院进行了异种移植描述(7). 此外，手术时，切除了正常的十二指肠冷冻并储存在−80°C。乳腺细胞系MDA-MB-468和胰腺细胞系Su86.86、CFPAC-1、AsPC-1、CaPan-1、，CaPan-2、Panc1、MiaPaCa2、BxPC3和Hs766T购自美国类型文化收藏。Colo357是从欧洲动物细胞培养物收藏。胰腺细胞系PL45在我们实验室建立(7)。

DNA分析。

对基因组DNA样本（每个样本40纳克）进行纯合子筛查通过所述PCR进行的缺失(7,8). 杂合性缺失（LOH）为用三个多态性标记进行测定。LOH的标准是前面描述的(8). 所有有LOH的样品都要接受排序。每个外显子通过PCR从基因组DNA中扩增，处理带有核酸外切酶I和虾碱性磷酸酶（美国生物化学），并进行手动循环测序（ThermoSequenase，Amersham）。纯合子缺失的测序交叉点和4摩洛哥迪拉姆基因是由自动DNA完成的测序器（PE-Biosystems）并由排序器软件（Gene Codes Corporation）。

DNA构建和转染检测。

p6SBE-luc是通过插入6个回文SBE拷贝来构建的（Smad-binding元件）位于猴病毒40最小启动子后面pGL3-promoter向量(9)（Promega）。这个4摩洛哥迪拉姆cDNA为亚克隆到pcDNA3.1（Invitrogen）中，得到pDPC4 WT(9)。包含活动形式的TSR-I型(ALK1型),演员R-I(ALK2（ALK2）),BMPR-1A型(ALK3公司),ACVR1B型(ALK4公司),TGFBR1型(ALK5公司)、和BMPR-1B型(ALK6型)基因是Jeff Wrana的礼物（多伦多大学）。所有这些都是血凝素标记的cDNA序列驱动的由巨细胞病毒启动子启动。本构激活由酸性取代（在GS域中的Q到DALK1，-2，-3、和-6个和的第206密码子处的T到DALK4公司和的第206密码子ALK5公司) (10,11). 每个瞬态转染实验在6孔板中重复进行描述(9). Lipofectamin（Life Technologies）按照制造商。脱氧核糖核酸-脂质内酰胺混合物从细胞中去除转染4-5h后，培养基中加入或不加入0.1然后将ng/ml人重组TGFβ1（Sigma）添加到细胞中。转染开始后16到18小时，细胞用Reporter Lysis Buffer（Promega）制备裂解产物荧光素酶和β-半乳糖苷酶测定。荧光素酶的测定方法为使用荧光素酶分析系统（Promega）和β-半乳糖苷酶按照描述进行测定(9). 实验中的所有文化转染相同总量的质粒；pcDNA3.1根据需要添加亲本表达载体以均衡表达载体的共转染。

免疫组织化学。

从石蜡块上切下未染色的5μm切片使用标准方法脱蜡。已处理幻灯片并用Dpc4单克隆抗体（克隆B8，Santa Cruz）标记为描述(12). 三位作者（E.M。，R.H.H.和S.E.K.），并记录为正值或负值核和细胞质标记(12). 焦点的标记被解释为阳性。基质细胞作为阳性对照，阴性中省略了一级抗体控制。具有已知Dpc4基因状态的胰腺癌也包括为阳性和阴性对照(12)。

结果

激活的Acvr1b对SBE报告者激活的影响。

TGFβ受体的低表达在胰腺中很常见癌症的基因结构和表达受体激活的MADH基因（Smads 1-3）在这些细胞中是完整的(13,14). 因此，为了绕过任何受体缺陷，我们选择比较Smad4核定位的相对水平组分活性形式的转染TSR-I型(ALK1型),演员R-I(ALK2（ALK2）),BMPR-1A型(ALK3公司),ACVR1B型(ALK4公司),TGFBR1型(ALK5公司)、和BMPR-1B型(ALK6型)基因(10,11,15,16). 我们使用SBE报告子，它表达了Smad4公司(17)是所有Smad介导的信号转导的共同特征研究至今(9). 激活的Acvr1b和Tgfbr1受体导致胰腺癌中SBE报告基因的高效转录电池（图。​（图1）。1). 其他活化受体在相同条件下诱导的响应小于2倍（数据不如图所示）。Acvr1b和Tgfbr1诱导SBE报告子活化在缺乏Smad4的MDA-MB-468细胞中缺失（参考。18而数据不是如图所示）。我们还研究了胰腺癌细胞对胰腺内大量存在的激素作出反应实质，其水平接近外周血的100倍，以及其他，包括胰岛素、VIP、生长抑素、胰高血糖素、表皮生长因子、雌二醇、氢化可的松、孕酮、胰腺多肽和分泌素。没有激素诱导的Smad激活在含有稳定整合SBE的Panc-1细胞中观察到报告人（参考。19和数据未显示）。这些单元格与等式一起使用转化生长因子β和激活素受体信号的效率，而不是其他测试信号系统，激活SBE报告器。

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Tgfbr1和Acvr1b对SBE激活作用的相似性记者。用Smad报告基因转染Panc-1细胞，p6SBE-luc，以及TGFβ超家族的各种激活形式I型受体或暴露于TGFβ。这个。激活TGFBR1型(ALK5公司)和ACVR1B型(ALK4公司)基因导致5倍或更多的Panc-1细胞中的Smad报告者，亲本载体转染；转化生长因子β1、亲本载体的转染和转化生长因子α1的添加；pTGFbRI和pActR-IB，转染表达载体TGFBR1型和ACVR1B型分别是。数据表示两个实验和SEM的平均值。

的体细胞突变ACVR1B型在胰腺中腺癌。

激活素I型受体，ACVR1B型，位于人类染色体12q13。尽管如此，它还没有进行突变研究激活素在结构和功能上有很强的相似性和TGFβ受体。我们测定了ACVR1B型通过PAC克隆测序和国家生物技术中心BLASTN搜索信息（NCBI）数据库(网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/BLAST/). 两个无序发现序列包含ACVR1B型序列（GenBank条目AC019244型和AC025259型)。ACVR1B型包括9个外显子和跨度超过23kb（图。​（图2）。2). 这个外显子1和2之间内含子的大小尚未确定。我们95例胰腺癌纯合子缺失筛查使用外显子2、5和8的特异性引物进行异种移植。A类657bp纯合缺失，包括ACVR1B型在异种移植物PX226中检测到如果外显子7到9发生剪接，则帧移位（图。​（图3三一和表​表1）。1). 突变是体细胞的通过对正常组织和原代组织基因组DNA的研究验证患者的癌症标本（图。​（图3三一). 精确的通过对异种移植瘤中的缺失（图。​（图3三 一和b条)。这种缺失似乎是DNA复制过程中滑移的结果发生在4-nt重复序列（5′-ggct-3′）（图。​（图3三b条). 胰腺癌异种移植物小组分析LOH和基因内突变。

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共存纯合子缺失ACVR1B型和躯体的突变4摩洛哥迪拉姆胰腺癌异种移植，PX226，有657-bp的缺失和LOH影响ACVR1B型基因和一个无意义的突变和LOH4摩洛哥迪拉姆基因。这个体细胞突变删除了ACVR1B型基因。通过PCR绘制缺失图(一)并由验证排序(b条). (一)的PCR产物两名患者的正常DNA（N；第二名患者的泳道1、6和11患者，来自PX226患者的通道2、7和12），异种移植物PX226（X；车道3、8和13），患者的原发癌（C；车道4、9和14）和缺少模板的阴性对照（-；车道5、10和15）使用三套底漆。基因片段编号根据一份出版的ACVR1B型序列（GenBank条目L31848型). (b条)基因组PCR产物用嵌套底漆。删除的大小根据最新的序列ACVR1B型基因（GenBank条目AC019244型). (c（c）)基因组PCR产物4摩洛哥迪拉姆异种移植物PX226及其基因座用套式引物对相应正常人进行测序。胡说八道患者原发癌中证实有突变（数据未如图所示）。

表1

ACVR1B型胰腺的基因突变癌症

肿瘤等位基因状态突变网站基因改变预测产品突变的起源
PX224型LOH公司密码子387，外显子7CTT公司关贸总协定通用航空公司ACC至CTTAAC公司机架-移位躯体的
第226页LOH公司外显子8纯合子缺失删除，帧移位躯体的

LOH涉及ACVR1B型用多态性标记D12S368、D12S390和D12S359。29年发现LOH85例胰腺癌异种移植物中（34%）和11例中的5例胰腺癌细胞系（45%）。所有编码序列和拼接交叉点ACVR1B型基因（除了外显子1，它是由于GC含量高，因此研究不完全）然后对表现出LOH的癌症进行测序。一个5个碱基的缺失导致框架移位和蛋白质翻译提前终止的原因是在异种移植物PX224中检测到（表​（表1）。1). 突变是体细胞的在患者相应的原发癌组织中证实。这两种突变都消除了Acvr1b的部分激酶结构域(20). 这个Tgfbr1和Tgfbr2的细胞质激酶结构域（TGFβ受体I型和II型）都是有效TGFβ所必需的信号转导(21)预计Acvr1b的功能类似。

的共存突变ACVR1B型和4摩洛哥迪拉姆在里面胰腺癌。

PX224和PX226的原发肿瘤，其中含有灭活的ACVR1B型基因，进行免疫组织化学检查Madh4状态。样本免疫组织化学阴性Smad4/Dpc4/Mahd4在肿瘤细胞中的表达（图。​（图44 b条和c（c）)。序列分析4摩洛哥迪拉姆基因揭示了一个无稽之谈突变的外显子5（密码子245）4摩洛哥迪拉姆中的基因PX226（图。​（图3三c（c）). 体细胞突变在患者的原发肿瘤（数据未显示）。都不是纯合子在TGFBR1型和TGFBR2型这两个样本的基因(6)，表明4摩洛哥迪拉姆这两种肿瘤的失活可能是消融TGFβ途径的方法。

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Smad4在ACVR1B型-突变体肿瘤。Smad4在乳腺癌的导管上皮中表达正常胰腺(一)但这两个肿瘤中没有基因突变ACVR1B型基因(b条和c（c）). 细胞核中没有免疫检测到的Smad4或异种移植原发癌中肿瘤细胞的细胞质PX224型(b条)和异种移植PX226(c（c）). 这个促结缔组织增生基质表达Smad4控件。使用反染Smad4抗体的免疫组织化学苏木精。

讨论

在这里，我们提供了人类肿瘤的第一个基因证据支持ACVR1B型作为肿瘤抑制基因。这个识别连接已知癌基因和抑癌基因是癌症研究的主要成就研究。因为观察到的突变是由选择性决定的压力，调节途径中的肿瘤突变通常被视为相互作用，即人类肿瘤通常具有激活或一个但不超过一个特定成员的失活调控途径。此类示例包括MDM2/p53基因,这个APC/β-连环蛋白、和第16页墨水4/CDK4/RB1通路关系(22——25). 然而，多种考虑支持Smad4肿瘤抑制的组合输入（而非线性）模型胰腺癌。首先，胰腺癌是由导管内前体，PanIN（胰腺上皮内瘤变），Smad4表达的缺失仅限于PanIN-3入侵前晚期(26). 其次，报告表明TGFβ受体的失活与4摩洛哥迪拉姆，因为已知一些肿瘤具有遗传性禁用两个成员(6,27). 这些发现符合对组合输入模型的期望，这可以使观察到这些基因的遗传失活共存。我们因此，重新审查了这些分支机构的贡献能力信号将由4摩洛哥迪拉姆中的基因胰腺癌。我们在具有完整的和那些被破坏的4摩洛哥迪拉姆基因。共存属于ALK4公司和4摩洛哥迪拉姆两个胰腺的失活因此，腺癌与人类肿瘤的先前证据非常吻合关于TGFβ超家族/Smad系统的突变。

这些结果使我们提出，在胰腺肿瘤发生，在仍含有a的肿瘤克隆中功能性的4摩洛哥迪拉姆基因、突变或表达缺陷损害或排除激活素或转化生长因子β的功能受体可能发生。激活素或TGFβ信号的失活输入为携带这种新功能的克隆提供了选择性优势缺陷。在这个克隆中，其余的4摩洛哥迪拉姆-介导的途径（转化生长因子β或激活素），或其他肿瘤抑制受体输入尚待最终证实通过鉴定肿瘤突变，保持其活性克隆的部分抑制。在这些早期阶段目前尚不清楚的原因，Smad4/Dpc4/Madh4的丢失功能是有害的4摩洛哥迪拉姆-空克隆不能因此Smad4/Dpc4/Madh4表达的缺失不会早于PanIN-3晚期(26). 在非常晚的阶段在PanIN的导管内进化过程中，在现在窝藏的细胞内细胞周期检查点和其他调控中的多重遗传缺陷系统，Smad4的功能丧失不再有害，但变得有利。所有剩余Smad4介导的信号因失去4摩洛哥迪拉姆。这将删除剩余的由存活途径提供的肿瘤抑制信号。A类因此，通路成员失活的非互易模式可以是在一些癌症中表现出来，并且是由阶梯状的性质产生的失活分支途径抑癌作用的过程系统。

在TGFBR1型,TGFBR2型、和ACVR1B型基因可能是相互的高频率表达缺陷的表现TGFβ受体(14). 相反表达缺陷和肿瘤抑制输入的多样性4摩洛哥迪拉姆将为4摩洛哥迪拉姆继续介导肿瘤抑制。这样的角色将说明最终损失4摩洛哥迪拉姆在后期PanIN-3中，以及随后迅速演变为具有侵略性和极端致命性胰腺癌分期。

的平行贡献ACVR1B型和TGFBR1型肿瘤抑制中的信号通路也引起了人们对激活素途径是癌症治疗的合法靶点。早期胰腺肿瘤或其他肿瘤类型的发病率较高转化生长因子β-无反应，但发生率低4摩洛哥迪拉姆激活素诱导肿瘤的刺激可能有益于突变抑制。对某些癌细胞株施用激活素是已知会引起凋亡和其他抑制作用(28,29)。

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院SPORE的支持胃肠道肿瘤（卓越研究专项）拨款CA 62924和国立卫生研究院拨款CA 68228。

缩写

LOH公司杂合性缺失
面板IN胰腺的上皮内瘤变
小型企业实体Smad-binding元素

脚注

本论文已提交直接（轨道II）到PNAS办公室。

工具书类

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