胃肠病学。作者手稿;PMC 2011年3月25日发布。
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缺氧诱导因子信号传导在艰难梭菌-诱导性肠损伤
,1,2 ,1,2 ,2 ,1 ,1 ,1 ,2 ,4 ,5 ,6 ,2 ,三 ,7 ,7 ,7 ,6 ,2 ,1和2
西蒙·A·平田
1加拿大卡尔加里卡尔加里大学生物化学与分子生物学系
2加拿大卡尔加里卡尔加里大学医学系
凯拉罚款
1加拿大卡尔加里卡尔加里大学生物化学与分子生物学系
2加拿大卡尔加里卡尔加里大学医学系
Jeffery Ng(杰弗瑞·吴)
2加拿大卡尔加里卡尔加里大学医学系
丹亚·特拉布西
1加拿大卡尔加里卡尔加里大学生物化学与分子生物学系
乔什·李
1加拿大卡尔加里卡尔加里大学生物化学与分子生物学系
岩原英吉
1加拿大卡尔加里卡尔加里大学生物化学与分子生物学系
郑硕允
5美国波士顿马萨诸塞州总医院和哈佛医学院医学部胃肠科
梅兰妮·M·斯卡利
6美国丹佛科罗拉多大学健康科学中心胃肠科粘膜炎症项目
肖恩·梅德利科特
三加拿大卡尔加里卡尔加里大学病理学系
马尼甘丹·勒琼
7加拿大卡尔加里卡尔加里大学微生物与传染病系
克里斯·查迪
7加拿大卡尔加里卡尔加里大学微生物与传染病系
格伦·阿姆斯特朗
7加拿大卡尔加里卡尔加里大学微生物与传染病系
肖恩·科尔根
6美国丹佛科罗拉多大学健康科学中心胃肠科粘膜炎症项目
贾斯汀·麦克唐纳
1加拿大卡尔加里卡尔加里大学生物化学与分子生物学系
1加拿大卡尔加里卡尔加里大学生物化学与分子生物学系
2加拿大卡尔加里卡尔加里大学医学系
三加拿大卡尔加里卡尔加里大学病理学系
4加拿大渥太华卡尔顿大学生物系
5美国波士顿马萨诸塞州总医院和哈佛医学院医学部胃肠科
6美国丹佛科罗拉多大学健康科学中心胃肠科粘膜炎症项目
7加拿大卡尔加里卡尔加里大学微生物与传染病系
- 补充资料
1
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摘要
背景和目标
艰难梭菌(艰难梭菌)是医院感染性腹泻的主要原因。发病率的增加、抗生素耐药性和毒力更强的菌株大大增加了艰难梭菌-全球相关死亡。天然宿主对艰难梭菌未解决;然而,我们假设缺氧诱导因子(HIF-1)在艰难梭菌结肠炎。因此,我们评估了艰难梭菌毒素对HIF-1的调节及HIF-1α在艰难梭菌-介导的损伤/炎症。
方法
体外研究评估了暴露于艰难梭菌毒素。体内研究采用了小鼠回肠环模型艰难梭菌毒物引起的肠道损伤。使用肠上皮中靶向缺失HIF-1α的小鼠来评估HIF-1α信号传导对艰难梭菌毒素。
结果
粘膜活检和Caco-2细胞暴露于艰难梭菌毒素显示HIF-1α转录和蛋白水平显著增加。在Caco-2细胞中也观察到毒素诱导的DNA结合。一氧化氮合酶抑制剂减弱了毒素诱导的HIF-1α积累。体内肠上皮HIF-1α的缺失导致更严重的毒物诱导的肠道损伤和炎症。相反,用二甲基草酰甘氨酸稳定HIF-1α,可以减轻毒素诱导的损伤和炎症。这与诱导HIF-1调节的保护因子(包括VEGFa、CD73和肠三叶因子)以及下调促炎分子TNF和KC有关。
结论
我们的研究首次描述了HIF-1α对艰难梭菌毒素。利用HIF-1α的先天保护作用应对艰难梭菌毒素可能是一种新型的治疗艰难梭菌-相关疾病。
关键词:HIF-1,艰难梭菌,二甲基草酰甘氨酸,上皮屏障
介绍
艰难梭菌是一种孢子形成、产毒(毒素a-TcdA;308 kDa;毒素B-TcdB;270 kDa)细菌1这是导致令人担忧的流行病的原因。最近出现的NAP-1/027菌株毒性更强,对抗生素耐药,扩大了当前的影响艰难梭菌危机。令人震惊的是,艰难梭菌-自1999年以来,美国相关死亡人数每年增加35%2以便艰难梭菌现在导致的死亡人数是艾滋病毒的两倍。即使采用最好的药物治疗,患者也可能迅速发展为中毒性巨结肠、败血症和死亡。
艰难梭菌毒素通过破坏肠上皮屏障和诱导促炎介质快速诱导肠道损伤和炎症三TcdA和TcdB都是葡萄糖基转移酶,它们不可逆地灭活小GTPase的Ras超家族1TcdA诱导的肌动蛋白细胞骨架变化破坏紧密连接,诱导细胞圆形和分离4–6分离后,肠上皮细胞可被驱动产生IL-8和上调ICAM-17导致中性粒细胞的化学吸引、粘附和随后的粘膜炎症8粘膜屏障的破坏允许毒素激活固有层内的免疫细胞,并触发IL-8、IL-1β、TNF和一氧化氮(NO)的产生7–10这些事件会导致免疫细胞进一步浸润,并导致与之相关的组织损伤艰难梭菌-相关疾病(CDAD)。
低氧诱导因子-1(HIF-1)转录因子复合物对细胞应激、损伤和炎症反应迅速,并能保护肠粘膜11–13HIF-1由一个含氧α亚基和一个核定位β亚基组成,是一个主转录因子和氧的原型调节因子依赖性基因转录。HIF-1α亚单位广泛且组成性表达,但在正常毒性条件下,蛋白质会被脯氨酰羟化酶(PHD)羟化。该事件触发了靶向HIF-1α的von Hippel-Lindau蛋白与蛋白酶体的结合,以进行降解14缺氧期间稳定后,在没有羟基化的情况下,HIF-1α-亚基转移到细胞核,在那里与HIF-1β-亚基结合,并通过与不同基因启动子或增强子区域中的缺氧反应元件(HRE)结合来启动转录事件。因此,阻止HIF-1α亚基降解的事件触发了HIF-1介导的强效转录事件14,15.
除了促进对缺氧的适应性反应外,HIF-1信号在涉及免疫的多种细胞过程中也具有调节作用13和肠道屏障功能16–19HIF-1可增加与伤口修复、炎症、细胞通透性和凋亡有关的基因(如VEGF、eNOS、iNOS和ITF)的转录。
HIF-1的转录激活也可以在常压下由许多细胞因子、生长因子和其他循环分子(例如NO)通过稳定HIF-1α亚基而诱导13的确,HIF-1可以减弱炎症/损伤级联反应的几个方面,并促进一系列屏障保护基因的表达,包括肠三叶因子(TFF3/ITF)、粘蛋白家族成员(MUC-1)和外-5’-核苷酸酶(CD73)18这些观察结果使我们假设HIF-1α稳定和下游HIF-1信号事件在艰难梭菌-引起肠道炎症和损伤。
为了验证这个假设,我们评估了艰难梭菌毒素可以提高HIF-1αmRNA和蛋白水平,并影响人类结肠上皮细胞系中HIF-1 DNA结合活性。我们还评估了CDAD患者和暴露于艰难梭菌毒素。最后,我们使用小鼠回肠环模型来检验艰难梭菌靶向肠上皮的HIF-1α基因敲除动物或用PHD抑制剂二甲基草酰甘氨酸(DMOG)治疗的动物的肠道炎症毒素,以抑制HIF-1 a的降解体内16.
方法
人体组织取样和HIF-1α免疫组织化学
采用标准免疫组织化学方法和适当的对照,用HIF-1α抗体(NB100-105)对CDAD结肠切除患者的结肠组织切片进行检测。用迈尔苏木精(Sigma)对载玻片进行复染。所有研究均由卡尔加里大学/卡尔加里健康区联合健康研究伦理委员会批准。
艰难梭菌毒素的分离纯化
艰难梭菌菌株NAP-1/027(TcdA+/TcdB+;来自卡尔加里健康区)在无菌厌氧条件下在脑心灌注培养基中生长。接种后第5天通过离心(10000g,60m)获得培养物。如前所述,通过阴离子交换色谱法从浓缩和过滤的培养上清液中纯化TcdA和TcdB20(请参见补充材料完整方法)。
mRNA表达评估:RNA分离、半定量RT-PCR和实时RT-PCR分析
在Trizol中收集Caco-2或组织活检,并根据制造商的方案(Invitrogen)分离RNA。总RNA通过RT逆转录2第一链试剂盒(SABiosciences)。使用特定引物对所得cDNA进行RT-PCR(见补充材料表1)。在ABI 7500实时PCR热循环仪上进行定量实时PCR(qPCR),以量化基因表达的变化。对于Caco-2细胞,购买了人类活检HIF-1α特异性实时引物(SABiosciences)。对于小鼠回肠样品,购买了GAPDH、VEGFa、ITF、CD73、TNF和KC/CXCL1的特异性引物(SABiosciences)。用序列检测软件检查扩增图,以确定阈值周期(CT型). 在所有反应中,内源性控制被放大,CT型已确定。
蛋白质印迹/蛋白质分析
对Caco-2细胞或组织活检匀浆的蛋白提取物进行免疫印迹。我们使用小鼠单克隆抗HIF-1α抗体(NB100-105和ab6489)、兔多克隆抗β-肌动蛋白抗体(Novus)和小鼠或兔的次级HRP-结合抗体(GE Healthcare)。如有必要,在暴露于培养基或培养基的结肠活检中测定HIF-1α蛋白水平艰难梭菌毒素。在4°C的裂解缓冲液(150mM NaCl、20mM Tris pH 7.5、1mM EDTA、1mM EGTA、0.1%SDS和Complete™蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Roche))中均质化活检。通过离心清除样品,并根据制造商的方案,通过基于化学发光的夹心免疫分析(Meso-Scale Diagnostics)测定上清液中的HIF-1α。所有样品均归一化为总蛋白质含量。
荧光素酶报告子和电泳迁移率变化分析(EMSA)
双荧光素酶报告基因检测系统(Promega)用于通过以下方法监测HIF-1报告基因的激活艰难梭菌毒素符合制造商的协议(参见补充材料完整方法)。EMSA以标准方式进行32含有HIF-结合序列(HRE)的P标记EPO基因衍生W18寡核苷酸序列(参见补充材料完整方法)。
小鼠回肠环模型
小鼠(I29上皮HIF-1α(Ep−/−)和野生型同窝仔)保持在传统的单一屏障外壳单元中,并在手术前8小时从食物中取出。I29上皮HIF-1α−/−(HIF-1α(Ep−/−))之前用卡豪森对小鼠进行了表征等。(2004)18用DMOG治疗的小鼠在手术前每天接受一次I.P.注射(8mg溶于0.3cc无菌盐水中),持续2d,并在手术后立即进行额外注射,据报道该方案可上调HIF-1α体内16.在相同的方案下给非治疗动物注射0.3cc无菌生理盐水。在回肠袢手术中,用异氟醚对小鼠进行麻醉,并保持麻醉状态。打开腹部,从回肠-盲肠交界处的空腔中取出小肠。在回肠-盲肠交界处近端约1cm处形成一条松散的结扎线。艰难梭菌将毒素(100µg总蛋白稀释在无菌PBS中)或载体(与无菌PBS的体积相匹配)注入回肠腔,并闭合结扎。另一个位于注射部位远端的结扎器被应用,肠被送回腹腔。术后恢复4小时处死动物,取出组织和血液进行分析。卡尔加里大学动物护理委员会批准了涉及动物的实验方案。
一氧化氮、组织髓过氧化物酶和肠组织损伤评分的测定
使用Bioxytech NO检测试剂盒(OxisResearch)并按照制造商的说明评估全身NO。按照标准方案测定肠粘膜段的髓过氧化物酶(MPO)活性21为了进行损伤评分,用苏木精和伊红(H&E)对固定、嵌入和切片标本进行染色。以盲法评估幻灯片,并生成损坏分数。使用以下参数评估切片:结构评分–0=正常,1=绒毛空泡化/出血,2=上皮丧失,3=隐窝/绒毛结构完全丧失;炎症评分–0=正常,1=固有层(LP)中炎症细胞增多,2=粘膜下层炎症细胞增加,3=致密炎症细胞团,4=跨壁炎症;上皮损伤–0=无,1=绒毛尖端破坏,2=1/2绒毛破坏,3=绒毛完全破坏;中性粒细胞评分–0=零,1=主要边缘化的罕见PMN,2=边缘化和外渗PMN(近血管最多5个),3=边缘化并通过LP和上皮细胞外渗。
跨上皮耐药评估
Caco-2细胞以6×10的密度接种5细胞/mL置于半透膜过滤器(Costar)上,在添加20%胎牛血清和青霉素-链霉素(100µg/mL;1nM,Invitrogen)的Dulbecco改良Eagle's培养基中培养,并在含5%CO的37°C湿室空气中培养2直到跨上皮电阻(TER)大于1000欧姆/厘米2如前所述,通过RNA干扰产生稳定击倒HIF-1α的Caco-2细胞22在所有实验中,对照单分子膜均使用适当的毒素载体(无菌培养基的匹配体积)和药物抑制剂(二甲基亚砜的匹配容量)进行处理。
统计分析
用α值为0.05的学生T检验对两组进行比较。使用单向方差分析对多组进行比较,然后进行Neumann-Keuls事后分析。
结果
识别以下各项之间的功能链接艰难梭菌毒素暴露和HIF-1激活,我们首先分析了艰难梭菌毒素。患有以下疾病的患者艰难梭菌结肠炎上皮HIF-1α蛋白免疫组化染色增强(组织切片iii–vi)。评估对艰难梭菌毒素,我们将新鲜分离的正常人结肠粘膜活检暴露于载体或毒素(含有TcdA和TcdB,从人NAP-1/027分离物中纯化,见补充图1). 接触毒素不仅显著增加蛋白质水平,而且还增强HIF-1α转录(). 此外,在体外应用艰难梭菌毒素直接上调HIF-1αmRNA()和蛋白质水平()以时间和浓度依赖的方式在Caco-2细胞中。纯化的TcdA和TcdB均能独立增加HIF-1α蛋白().
艰难梭菌结肠炎与HIF-1α表达增加有关。(a)使用小鼠抗HIF-1α单克隆抗体(NB100-105)对组织切片进行HIF-1蛋白染色。HIF-1α在患者结肠组织中的免疫定位(手术切除):(i–ii),在结肠癌筛查或结肠癌正常切除边缘活检的正常人结肠组织中没有HIF-1α染色;(iii–vi),结肠组织中HIF-1α染色强烈艰难梭菌-相关病理学。炎症细胞、上皮细胞、内皮细胞以及粘膜肌层(箭头之间)的平滑肌细胞、内膜血管和肌层中的粘膜、粘膜下层和肌层进行了离散染色。标准免疫组织化学对照(例如省略小鼠抗HIF-1α抗体)为阴性。(b)暴露于艰难梭菌毒素(50µg/mL;3h)。从健康人身上采集两次活检(并排进行),并立即用毒素或溶媒溶液(与无菌BHI培养基体积相匹配)培养。所有值均为平均值±S.E.M.,(n=14)。*表示p<0.05。
Caco-2细胞在正常氧条件下经HIF-1αmRNA和蛋白水平升高艰难梭菌毒素。(a)Caco-2细胞暴露于毒素(0.1µg/mL)或CoCl2(100µM)持续1小时、2小时和4小时。将PBS/BHI添加到细胞中作为对照。分离总RNA,通过半定量RT-PCR测定HIF-1α和β2-微球蛋白(β2-MG;内部对照)的表达。(b)Caco-2细胞暴露4h,浓度增加艰难梭菌qPCR评估毒素增加HIF-1α基因表达;*表示与0µg/mL相比p<0.05,#表示与0.1和0µg/mL相比p<0.05,n=5。(c)HIF-1α蛋白在Caco-2细胞中表达增加艰难梭菌毒素(100µg/mL)或氯化钴2(100µM)。通过western blotting(NB100-105)分析核提取物(50µg总蛋白)的HIF-1α蛋白水平。所有值(平均值±S.E.M.,n=4)*p<0.05。抑制NO合成酶可减弱毒素诱导的HIF-1α蛋白增加。用100µM L-NAME预处理Caco-2细胞(d)或1400W(e)暴露毒素前30分钟(100µg/mL;12小时)。通过western blotting(NB100-105)评估细胞溶胶提取物。所有值均为平均值±S。E.M.,(n=4)*与对照组相比p<0.05**与毒素处理细胞相比,p<0.05。
纯化的TcdA和TcdB增加HIF-1α蛋白和DNA结合。(a)将Caco-2细胞暴露于纯化的TcdA(100ng/mL,500ng/mL)和TcdB(10ng/mL,100ng/mL)中4h。Western blot是四个实验的代表(ab6489)。(b)CoCl作用下Caco-2细胞中HIF-1α与EPO HRE的DNA结合2(100µM)或纯化的TcdA(100ng/mL)和TcdB(100ng/mL)。
阐明艰难梭菌毒物介导的HIF-1α诱导我们评估了NO的作用,因为在某些情况下NO可以稳定HIF-123HIF-1α蛋白诱导艰难梭菌毒素依赖于NO,因为它被L-NAME(100µM,pan-NOS抑制剂;)或1400W(100µM,选择性iNOS抑制剂;). 毒素诱导的HIF-1αmRNA上调不受L-NAME(100µM)预处理的影响,表明HIF-1β蛋白水平的NO依赖性增加涉及翻译后步骤(补充图2a). 电泳迁移率变化分析(EMSA)评估HIF-1特异性DNA结合活性()显示从用艰难梭菌毒素或氯化钴2,(缺氧模拟)。在HIF-1α单克隆抗体存在的情况下进行的“超移位”EMSA分析进一步支持了这一发现,并证实了HIF-1与缺氧反应元件(HRE,). 此外,纯化的TcdA和TcdB(补充图1a–b)诱导HIF-1依赖性DNA结合(). 最后,艰难梭菌通过HIF-1依赖性荧光素酶分析评估毒素增强HIF-1转录活性(). 为了评估HIF-1α活性改变对IECs的影响,采用了siRNA敲除方法24用靶向HIF-1α的siRNA稳定转染Caco-2细胞后,在毒素处理后HIF-1β蛋白表达减弱(),这种效应使细胞更容易受到毒素诱导的TER降低的影响().
艰难梭菌毒素暴露促进Caco-2细胞中HIF-1依赖性启动子结合活性和转录活性。(a)通过电泳迁移率变化分析(EMSA)评估HIF-1α与EPO低氧反应元件(HRE)的DNA结合。核提取物是从暴露于艰难梭菌毒素(100µg/mL)或氯化钴2(100µM)。在某些情况下,在DNA结合反应中添加抗HIF-1α单克隆抗体会产生EMSA“超转移”。(b)通过荧光素酶报告检测,毒素暴露促进Caco-2细胞中HIF-1α转录活性。Caco-2细胞与萤火虫荧光素酶报告子和Renilla荧光素酶控制质粒瞬时共转染。细胞在10µg/mL的常氧条件下培养4、18或24小时艰难梭菌毒素或100µM CoCl2通过将萤火虫荧光素酶活性归一化为雷尼拉荧光素酶活性来校正转染效率。用空pGL3载体转染对照细胞,并用艰难梭菌毒素或氯化钴2.所有值(平均值±S.E.M.,n=4)均表示为相对于任意定义为1的对照组的折叠诱导。(c–d)HIF-1α缺陷的Caco-2细胞更容易受到艰难梭菌毒素引起的损伤。(c)稳定转染HIF-1αsiRNA(Caco-2 HIF-1 a-艰难梭菌毒素或氯化钴2.(d)Caco-2 HIF-1α−/−细胞对艰难梭菌毒素,通过与毒素(60µg/mL)孵育2小时后的经上皮阻力(TER)进行评估。所有数值均为平均值±S.E.M.,(n=4),*表示p<0.05。
采用小鼠回肠环模型检测这些过程体内.注入艰难梭菌野生型小鼠回肠毒素上调HIF-1αmRNA()和蛋白质水平(). 这与HIF-1调节基因产物(VEGFa、ITF和CD73;)炎症介质(TNFα和CXCL1/KC;)经qPCR评估。如前所述25,艰难梭菌结肠MPO增加证明毒素引起炎症()和血清NO水平()以及组织中性粒细胞数量的增加(). 炎症伴随着严重的肠道损伤,包括上皮屏障破坏、空泡化和隐窝绒毛结构改变(),所有这些都是CDAD的标志性特征。与HIF-1α的假定保护作用一致,艰难梭菌毒素引起的更严重的炎症(),增加系统NO水平()肠道损伤加重()肠上皮HIF-1α缺乏小鼠。
艰难梭菌毒素增加HIF-1α表达并诱导炎症体内CDAD模型。(a)用qPCR测定对照动物(无手术)、经溶媒处理或暴露于100µg艰难梭菌回肠环中的毒素(与对照组和载体相比,p<0.05,n=5)。(b)HIF-1α蛋白在用载体或艰难梭菌毒素(100µg),*与载体相比p<0.05,n=4(NB100-105)。(c)在对照动物(无手术)和用载体或艰难梭菌毒素(100µg),与对照组和载体相比,*p<0.05,与载体相比,**p<0.05,n=9。(d)用溶媒或艰难梭菌毒素(100µg),*与溶媒相比p<0.05,n=9。(e)对从载体和毒素处理的回肠环中分离的RNA进行qPCR。数据表示为相对于控件的折叠式变化,其中1等于控制组中的表达式(虚线)*与对照组相比p<0.05,n=3。
肠上皮HIF-1α靶向缺失增强艰难梭菌毒物引起的炎症。(a)用MPO水平评估从野生型I29和HIF-1α上皮靶向敲除小鼠(HIF-1β−/−)中分离的回肠中的组织炎症艰难梭菌毒素(100µg),*p与野生型I29相比<0.05,n=6。(b)对野生型I29和HIF-1α上皮靶向敲除小鼠(HIF-1艰难梭菌毒素(100µg),*p与野生型I29相比<0.05,n=6。(c)HIF-1α−/−(顶行)和野生型I29(底行)暴露4h后的H&E染色回肠切片艰难梭菌毒素(100微克)。
用二甲基草酰甘氨酸(DMOG,手术前2天每天8毫克)预处理的动物表现明显减少艰难梭菌毒素引起的组织损伤。(a)用溶媒处理的小鼠回肠H&E染色的代表性切片(i和ii),艰难梭菌毒素(iii和iv)和DMOG预处理,然后艰难梭菌毒素暴露(v&vi).(b)用载体(无菌PBS、黑条)处理的小鼠回肠切片的组织学分析,艰难梭菌毒素(100µg,灰条)或DMOG艰难梭菌毒素(白条):拱门。Sc.——建筑分数;燃烧。Sc.——炎症评分;墓志铭。大坝。–上皮损伤;中微子。Sc.–中性粒细胞评分,与培养基相比*p<0.05#与相比p<0.05艰难梭菌毒素;n=8-12。
为了评估上调HIF-1α活性的影响,用PHD抑制剂二甲基草酰甘氨酸治疗小鼠26(DMOG;手术前2天每天服用8毫克)艰难梭菌毒素暴露。DMOG减轻毒性损伤()和炎症(),并提高了整体组织学评分(). 这与VEGFa和屏障保护分子的表达显著增加有关;ITF和CD73()TNFα和CXCL1/KC的表达显著降低()与车辆处理的动物相比。我们假设艰难梭菌DMOG治疗引起的毒性损伤可能部分是由于屏障功能增强,因为DMOG显著降低了Caco-2单层中毒性诱导的TER降低(). 此外,DMOG处理的(500µM,2小时)Caco-2单层显示HIF-1α蛋白显著上调(补充图3).
用二甲基草酰甘氨酸(DMOG,手术前2天每天8毫克)治疗的小鼠HIF-1α水平增加(a)与注射PBS载体的小鼠相比,从全层回肠段分离的蛋白质提取物中(b)用MPO水平评估肠道炎症。对照组表示在未接受手术的动物中测得的水平,*p与对照组和载体相比<0.05**与相比p<0.05艰难梭菌毒素治疗,n=6-8。之前用DMOG进行预处理艰难梭菌毒素暴露与肠屏障功能和保护相关因素的升高有关(c)炎症介质水平降低(d)如用qPCR测量的。数据是折叠式的艰难梭菌毒素治疗,其中1等于毒素组的表达*与毒素相比,p<0.05,n=3。(e)DMOG治疗可防止艰难梭菌毒素诱导的上皮屏障功能破坏。Caco-2细胞暴露于载体(对照),艰难梭菌毒素(60µg/mL)、DMOG(500µM)和艰难梭菌毒素(60µg/mL)或DMOG(500µM)单独使用。时间(以分钟为单位)表示向单层添加毒素后经过的时间,数据以对照TER的百分比表示,*与对照和毒素相比p<0.05**与毒素相比p<0.005#与对照组相比,p<0.005,n=4。
讨论
当前的治疗方法艰难梭菌专注于消灭病原体的结肠炎正在失败。此外,疫苗接种策略已经失败,以前的接触也没有保护作用。临床上,患者之间的疾病严重程度存在显著差异,即使是感染相同危险因素的患者艰难梭菌这表明可能存在一种先天性途径来保护某些CDAD患者,而不是其他CDAD患者。显然,粘膜屏障的破坏是CDAD发病机制中的关键步骤;因此,旨在维持屏障功能的疗法可能在CDAD的治疗中被证明是有价值的。一种新的治疗模式是利用肠粘膜固有的保护性反应来减少CDAD的进展。
在本研究中,我们报道了HIF-1α在暴露于艰难梭菌在常氧条件下产生毒素。这种上调似乎提供了保护,因为HIF-1α的缺失使上皮细胞更容易受到毒素诱导的损伤在体外和体内相反,通过药物稳定HIF-1α,激活该途径可显著减少毒素诱导的损伤在体外和体内HIF-1α被认为是肠保护的关键介质,在伴随粘膜损伤的缺氧和炎症期间16–19因此艰难梭菌上皮细胞中HIF-1α的毒物依赖性诱导可能是一种新的保护机制,在CDAD发作期间暴露于致病菌和毒素时保护肠道。
虽然我们最初假设HIF-1α的NO-依赖性稳定可能解释了艰难梭菌毒素依赖性蛋白质水平的增加,很明显,各种机制可能有助于艰难梭菌HIF-1信号的毒物依赖性增加,包括翻译后稳定以及从头开始HIF-1α转录水平增加。后一项发现令人费解,因为HIF-1α丰度主要是在翻译水平而非转录水平上调节的27在我们的研究中,用L-NAME预处理细胞对毒物诱导的HIF-1α上调没有影响,这表明no-依赖机制正在驱动这种转录反应。其他人认为HIF-1信号激活的机制与HIF-1α蛋白的稳定无关28,29然而,调控HIF-1α转录调控的确切机制尚未完全阐明。
在我们的实验模型中,HIF-1α活性的上调显著降低艰难梭菌毒素诱导的上皮损伤、屏障破坏和中性粒细胞浸润,这些发现与屏障保护基因增加和促炎分子减少相平行。显然,上皮HIF-1α的基因缺失导致了更严重的毒物诱导损伤和炎症。有趣的是,在HIF-1α中观察到的损伤增加(Ep−/−)与野生型小鼠相比,接触毒素的小鼠全身NO增加。尽管这一观察看似自相矛盾,但其重要性却是双重的。首先,在HIF-1α中观察到血清NO水平升高(Ep−/−)小鼠表明,在毒素暴露期间,NOS表达细胞(可能是粘膜空间中的细胞)的激活增强。其次,尽管NO在HIF-1α、HIF-1(Ep−/−)小鼠表现出更强的毒物诱导损伤和炎症,这表明NO和HIF-1α诱导之间的脱节可能是这些小鼠中观察到的敏感性增加的部分原因。
与HIF-1α形成鲜明对比(Ep−/−)用DMOG治疗的野生型小鼠在暴露于艰难梭菌毒素。用DMOG稳定HIF-1α可增强分子的表达,这些分子在维持肠上皮屏障功能方面具有强大的作用。我们的在体外数据表明HIF-1信号有助于维持屏障功能艰难梭菌毒素暴露;然而,很难从免疫调节效应中描述HIF-1信号的前载体效应体内其他地方也有报道30HIF-1信号在结肠炎动物模型中起保护作用的机制似乎主要由上皮HIF-1表达介导,因为PHD抑制剂对HIF-1α无效(Ep−/−)老鼠19在我们的研究中,DMOG治疗的小鼠中保护基因ITF和CD73的上调与以下肠道超结构的维持改善有关艰难梭菌毒素暴露。这与我们的在体外DMOG治疗减轻毒物诱导的屏障功能丧失的研究。然而,抑制PHD也可能影响NFκB信号传导。体外据报道,DMOG治疗可激活HIF-1和NFκB依赖的基因转录31因此,抑制PHD可能通过HIF-1α和NFκB信号通路的协同活性提供胃肠道保护。这种协同作用将有助于上皮细胞存活,并在损伤期间维持屏障功能,从而限制毒素诱导的粘膜免疫系统激活。
CDAD与深层炎症细胞浸润有关,而炎症细胞浸润在一定程度上是由艰难梭菌毒素诱导有效的趋化因子和细胞因子反应。在以下背景下艰难梭菌感染、HIF-1信号的激活以及随后屏障功能的增强将限制TcdA和TcdB向粘膜下空间的迁移,在那里它们通常会与LP单核细胞相互作用。事实上,HIF-1α在我们体内研究显著降低了小鼠KC和TNF的转录水平,这两种中性粒细胞趋化性的有效调节因子。此外,根据组织学评估,粘膜完整性得到增强。这些数据表明,HIF-1α的上调和屏障功能的增强可能足以降低毒素诱导粘膜免疫系统激活的可能性,最终减少促炎细胞因子的产生和免疫细胞浸润。
如前所述,一些患者出现严重的CDAD,导致败血症和死亡,而另一些患者具有相同的危险因素,并感染了相同菌株的CDAD艰难梭菌,可以有轻微的疾病。基于本研究的发现,我们假设那些患有更严重疾病的患者可能会降低充分诱导HIF-1α活性的能力和/或改变下游信号传导。或者,侮辱的严重性可能会压倒HIF-1的保护作用。在我们的人类结肠活检中确实发现了这种患者间的差异,在这些活检中,毒物介导的HIF-1α转录诱导和蛋白质水平都有显著差异。这些发现表明,HIF-1不仅在艰难梭菌-介导疾病,但它也可能导致临床疾病严重程度的变异。然而,由于粘膜活检很少(如果有的话)从轻度CDAD症状患者中分离出来,因此测试这一假设将非常困难。然而,对HIF-1α及其下游分子的进一步研究可能会产生重要的工具,可以识别那些有更严重临床病程风险的患者。此外,增强HIF-1α活性和/或HIF-1β下游的靶向通路可能是治疗这种毁灭性疾病的新方法。
致谢
这项工作得到了加拿大胃肠病学协会/加拿大卫生研究院博士后奖学金(S.H.)、AHFMR临床研究(P.L.B.)、加拿大研究主席和艾伯塔省传统医学研究基金会(AHFMR)高级学者奖(J.a.M.)的支持,以及国家卫生研究院DK50189、DE13499和HL60569(S.P.C.)、美国克罗恩和结肠炎基金会(S.P.C)和CIHR(P.L.B.&J.A.M)的拨款。特别感谢研究对象Ida Rabbani(IBD转化研究组织库)和胃肠研究小组的同事,特别是W.MacNaughton和K.Sharkey的有益讨论。
缩写
HIF-1型 | 低氧诱导因子-1 |
TcdA型 | 毒素A |
TcdB(千分贝) | 毒素B |
人力资源 | 缺氧反应元件 |
CDAD公司 | 艰难梭菌-相关疾病 |
ITF/TFF3 | 肠三叶因子 |
DMOG公司 | 二甲基草酰甘氨酸 |
HIF-1α(Ep−/−) | 靶向上皮HIF-1α−/−淘汰赛 |
脚注
作者贡献:S.A.H.和K.F.设计并执行了主要实验,分析了数据并撰写了手稿。D.T.、J.L.、J.N.、E.I.和Y.L.进行了蛋白质印迹,并协助动物手术。W.G.W.克隆并制备用于转染实验的质粒。哥伦比亚特区提供HIF-1αsiRNA敲低Caco-2细胞。S.P.C.和M.M.S.提供上皮靶向的HIF-1α−/−小鼠,进行HIF人类活检蛋白评估并讨论手稿。提供T.L.和G.A艰难梭菌分离物。S.M.协调艰难梭菌结肠炎组织采集和病理切片制备。M.L.和K.C.为DMOG做出了贡献在体外TER研究。P.L.B.、J.A.M.和D.A.M.进行了初步观察,监督和协调了项目。
披露:不存在利益冲突
参考文献
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