p73：神经生物学中的一种多功能蛋白质

摘要

p73的分子性质

p73是p53家族的成员[1]尽管与p53相比，p73（和p63）与蛋白质的祖先形式更为密切。这三种哺乳动物基因编码的转录因子在增殖、分化、细胞死亡、干细胞更新和细胞命运承诺的调节中起着关键作用[2–4]. 所有p53家族基因都包含相同的模块结构域，包括一个氨基末端反式激活域（TA）、一个DNA结合域和一个羧基末端齐聚域。p73基因包含15个外显子，转录可以由两个N-末端启动子启动（图1). 来自最上游ATG（启动子1）的转录产生反式激活（TA）亚型，而位于内含子3内的第二个启动子产生氨基末端截断蛋白（ΔN亚型）。总的来说，TA和ΔN亚型显示出不同的生物活性。TA亚型诱导细胞周期阻滞和凋亡，因此是候选的肿瘤抑制剂[5,6]而截短的ΔN亚型（通常）是促生存的，有利于致癌转化[7]. 此外，TAp73和ΔNp73转录物都经历了选择性的C末端剪接，理论上在正常细胞中产生了多达七种不同的变体，尽管并非所有这些都在蛋白质水平上检测到[8–10]. 这种复杂性导致了理解p73生物学的重大困难。

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图1

p73基因结构。一p73的基因组组织和产生p73亚型的不同剪接变体的表示。P1启动子产生TA亚型，而P2启动子生成ΔN亚型。b条p73不同亚型编码域的示意图。在顶部，显示了每个结构域中包含的氨基酸。助教反式激活结构域，数据库管理员DNA结合域，外径齐聚域，山姆SAM域，TID公司反式激活抑制域

然而，现在普遍认为，ΔN亚型通过竞争启动子DNA中的共识元素和二聚体，在很大程度上作为TA亚型活性的主要负抑制剂[7,11]. 然而，由于最长的ΔNp73α亚型包含第二个C末端TA结构域，并且可以处理一组不同于TAp73识别的基因，因此这种概括必须是合格的。此外，TA和ΔNp73的α亚型都包含一个C末端反式激活抑制结构域，由于分子内相互作用，该结构域可以破坏N末端TA结构域介导的转录活性。因此，将p73表达的输出视为TA和ΔN亚型表达比率的结果可能过于简单。

p73的生物学：转基因小鼠的经验教训

1997年，人类Trp73基因被确定位于1p36染色体内，该区域在神经母细胞瘤和其他晚期人类癌症等肿瘤中经常被删除[12,13]. 单体1p36也与大脑发育异常有关[14]. 虽然1p36区域中除p73以外的基因，如CHD5，也可能与这些表型有关，但这些数据表明p73可能在神经发育和癌症中起作用。

p73基因敲除小鼠的表型证实了p73的这种发育作用。与易感肿瘤的p53基因缺失小鼠不同，p73基因敲除的小鼠不会发生肿瘤，但表现出中枢神经系统的发育缺陷（表1) [15]，包括先天性脑积水和海马发育不全，CA1–CA3锥体细胞层和齿状回异常。为了与这些解剖异常保持一致，总p73^−/−基因敲除小鼠在胚胎和成年神经发生方面也存在缺陷，这表明p73亚型可能是神经干细胞的存活因子[16]. 第73页^−/−由于成熟皮层神经元的丢失，小鼠的皮层厚度也会减少[17].

这种神经表型主要归因于ΔNp73亚型的丢失，因为这些亚型在有丝分裂后神经元中表达并作为存活因子[11]. 因此，交感颈神经节细胞中NGF的退出或p53的过度表达导致内源性ΔNp73水平的降低和凋亡，而ΔNp 73的过度表达阻止了细胞凋亡[18]. 最近，ΔNp73异构体特异性KO小鼠的产生证实了ΔNp 73在分化成熟神经元中的促生存作用[19]. 事实上，ΔNp73运动皮层的神经元密度^−/−小鼠在10个月大后显著减少，并有神经退行性变的迹象[20]尽管没有明显的海马异常。同样的表型在第二个ΔNp73中也很明显^−/−鼠标模型[21]. 特别是，已经观察到犁鼻神经细胞和Cajal-Rezius细胞的数量显著减少，脉络丛萎缩。

然而，在ΔNp73特异性敲除中观察到的神经缺陷的严重性不如在总p73中所观察到的严重性^−/−这表明TAp73也可能有助于中枢神经系统的发育。虽然选择性TAp73缺失小鼠的皮层厚度正常，但它们显示海马发育不全，齿状回下叶缺失，与总p73相似^−/−在心室扩大的复杂效应之前，P14的小鼠在总敲除中进一步扭曲海马结构[22]. 这种解剖表型反映在齿状回颗粒下区神经发生的减少（图2)表明TAp73可能是神经干细胞增殖所必需的[23]. 事实上，TAp73已被证明调节负bHLH-Hey2，已知其维持神经前体。因此，异构体选择性敲除研究表明，TAp73和ΔNp73以仅部分重叠的方式促进中枢神经系统的发育。

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图2

从p73开始齿状回中假定干细胞的减少^−/−老鼠。正常人出生后第7天（P7）的齿状回（p73）^+/+)和淘汰赛（第73页^−/−)用胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和巢蛋白抗体对小鼠进行染色。箭头表示双阳性细胞。敲除小鼠表现出近一半的GFAP/Nestin细胞，表明这些小鼠的干细胞潜能大大降低。德国劳埃德船级社颗粒细胞层，毫升分子细胞层，希尔希卢斯。比例尺50微米

分化还是茎干？

胚胎和成人神经干细胞（NSC）都是主要的前体细胞，能够分化成不同的细胞类型（神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞），同时保留产生相同NSC后代（自我更新）的能力[24]，p53和ΔNp63已经与NSC生物学有关[25,26]. 最近，四个独立小组[16,23,27,28]已经证明p73也是胚胎和成人NSC的阳性调节因子，上述体内证据已经讨论过。

NSC可以作为神经球在体外培养，然后分化为成熟神经元。来源于p73的神经球^−/−小鼠较小，S期细胞数量减少，衰老人口增加[16]. 在分子水平上，已经显示来自p73的NSC^−/−小鼠存在Sox-2、Sox-3、Nanog、Notch-I、Notch-2、Hes-5、Jag2和Deltex的转录失调，这些都是参与增殖和/或自我更新调节的信号通路的组成部分[29]尽管还需要进一步研究p73在生理上如何调节这些因子。TAp73是胚胎NSC中表达的主要亚型，在NSC分化过程中TAp73的内源性表达增加[27]. 进一步的研究表明，p73可以衍生出数量较少的神经元^−/−NSC没有完全区分，树状树的树状结构和物理连接存在缺陷。这反映在p73齿状回海马神经元的解剖结构中^−/−与正常小鼠相比，活体小鼠的分支数量减少（图三).

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图3

敲除后齿状回海马神经元形态发生改变（p73^−/−)老鼠。正常人齿状回高尔基染色（p73^+/+)和p73^−/−小鼠（年龄=出生后18天）。敲除小鼠的神经元分支和连通性减少。显示了具有代表性的显微照片。比例尺100微米(顶部面板)和50微米(低割面)

p73也与少突胶质细胞和神经元分化有关[30]和p73的少突胶质细胞分化^−/−NSC也受损，与野生型NSC相比，NSC的数量较少，质量较差。然而，游离p73^−/−NSC保留分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力，这表明p73的缺失不会影响NSC的多能性。

另一个可能不太明确的模型是维甲酸（RA）诱导的神经母细胞瘤细胞的终末分化，这与TAp73的表达增加有关。此外，TAp73自身的异位表达可诱导终末神经元分化。在RA治疗期间，TAp73亚型调节N-CAM启动子，而TAp73的异位表达导致N-MYC的下调和pRB的增加，模拟RA对这两个基因的影响[31]对神经母细胞瘤的生存至关重要[32,33].

总之，虽然最近的研究表明p73，特别是TAp73在体内外通过一种尚未完全确定的机制维持干细胞中有明确的需求[16,23,27,28]，其他数据表明p73参与神经元[31]和少突胶质细胞[30]分化。神经系统中的这些多重生物活性可能反映了p73的14种蛋白亚型的分子复杂性、它们之间的相互作用以及它们与其他p53/p63家族成员的相互作用，这些成员本身表现为多种亚型。另外，由于p73似乎调节1000到2000个基因，包括100到200个转录因子，几个明显不同的途径可能同时被激活。

p73与神经变性

在过去15年中，人们发现p53家族在几种神经退行性疾病中起着重要作用。我们特别感兴趣的是，他们在最普遍（并且越来越普遍）的神经退行性疾病阿尔茨海默病（AD）中的作用，我们将重点关注这一点。

AD以家族性和散发性两种形式存在。家族性早发（EOAD）仅占病例的一小部分，是通过β淀粉样前体蛋白（APP）或两种早老蛋白（PS）之一PS1和PS2的突变而遗传的。相反，散发性晚发型（LOAD）的最大遗传风险是载脂蛋白E（APOE）的ε4等位基因[34]. 最近，全基因组关联研究确定了另外三个风险基因，尽管其影响比APOE弱得多；ApoJ/CLU、PICALM和CR1[35,36]

这种疾病的散发性和家族性表现为两种脑损伤：β-淀粉样蛋白（Aβ）肽细胞外沉积的老年斑；和神经纤维缠结（NFT）-成对螺旋丝（PHF）的细胞内聚集物，由微管相关蛋白tau的超磷酸化形式组成[37]. 老年斑块的出现先于NFT。Aβ由APP的蛋白水解过程产生，早老素是γ-分泌酶复合物的必要成分，负责该过程的最后阶段[37]. tau的磷酸化状态调节其结合微管的能力；在其过度磷酸化状态下，τ未结合，最终聚合成成对螺旋丝，然后聚集成NFT。现在看来，并不是这些不溶性τ聚集体，而是某种可溶性形式的τ是导致神经元功能障碍和最终神经元死亡的有毒物质[38]. APP突变导致Aβ生成增加（正如随后观察到的早老蛋白突变一样），并且随着老年斑块的出现先于NFT，淀粉样级联假说被提出[39]. 这一尚未被驳斥的假说认为，Aβ水平的增加会导致tau的过度磷酸化，进而导致神经元功能障碍，最终导致神经退行性变。在小鼠中模拟这一级联事件的尝试大多失败了，因为即使引入APP和PS1的突变转基因形式，尽管Aβ生成水平高，导致广泛的斑块形成，但没有观察到tau的聚集。只有当APP、PS1和人tau在三重转基因小鼠中同时过度表达时，才能观察到斑块和缠结。

p53家族可能在AD中起作用的第一个迹象是在1996年，该证据表明细胞内的aβ上调了转基因小鼠大脑中的p53，只过度表达APP的aβ片段[40]. 同年，Kosik小组检查了p53的神经元^−/−小鼠，观察到p53在神经元分化和tau磷酸化中起作用[41]. 2001年，一种p53依赖性基因转录抑制剂pifithrin-α的使用被证明可以保护神经元免受Aβ诱导的凋亡[42]. 研究还发现，阿尔茨海默病患者大脑中的p53蛋白上调[43]，我们后来证实了这一发现[44]. 2004年，Caricasole等人[45]表明Aβ激活编码可溶性wnt拮抗剂Dickkopf-1（Dkk1）的p53靶基因的表达[46]初级神经元中Dkk1的敲除几乎完全阻断了Aβ诱导的tau磷酸化，这与“淀粉样级联”途径中的p53家族有关。同年，也有报道称[47]p73蛋白在AD脑中的亚细胞分布发生改变。在对照组的海马锥体神经元中，p73免疫反应主要为细胞质，而在AD样品中，在锥体神经元的细胞核和营养不良的神经突中发现p73水平升高。

我们采用一个简单的细胞模型来证明p53的转录活性形式能够在特定的磷酸化表位诱导tau磷酸化，特别是AT8/tau-1（S199、S202和S205）和PHF-1（S396和S404）位点[44]. 我们发现p73也是如此，TA形式增加了τ磷酸化，而∆N形式没有[48]. 在这个系统中，我们还发现p63的转录活性形式激活tau磷酸化，而∆Np63形式则不激活（未发表的观察结果）。

2008年，米勒/卡普兰集团[49]据报道，在年龄（16-18个月）的杂合子p73的大脑中^+/−小鼠的tau磷酸化水平以及与NFT相似的高磷酸化tau丝状聚集体显著增加。当他们将这些单倍体p73小鼠与含有APP双突变形式的小鼠（TgCRND8小鼠）杂交时，早在1.5个月就发生了τ磷酸化和τ丝形成。鉴于基于Aβ的AD小鼠模型没有明显的tau病理学表现，这一发现尤其引人注目。它还进一步支持淀粉样级联假说，表明Aβ位于tau病理学的上游，并且Aβ必须启动的级联事件导致tau过度磷酸化和随后的神经变性，涉及p53家族，尤其是p73。

米勒/卡普兰团队继续展示[49]在p73-KO小鼠产生的初级皮层神经元中，c-jun N末端激酶（JNK）的活性随着WT p73等位基因数量的减少而增加，而JNK的抑制降低了这些神经元中的tau磷酸化。他们提出，由于∆Np73可以结合和抑制JNK，而p73的TA形式无法结合和抑制，正是p73的∆N形式的缺失导致τ磷酸化和神经退化。同一研究组此前已证明∆Np73在中枢神经系统中起神经保护作用[17,50]并声称∆N形式的p73占主导地位，至少在出生后的小鼠大脑中是如此。整个p73基因的一个拷贝丢失导致∆Np73亚型减少，导致JNK活性增加。

为了支持这一说法，有大量文献表明JNK与AD病理学有关，例如[51–53]. 我们的团队已经证明JNK直接针对tau[54]并对APP处理起到调节作用[55]. 在APP/PS1 AD脑切片模型中，抑制JNK也被证明可以防止Aβ毒性[56].

还有另一只基因敲除小鼠，其表型包括神经退行性变和伴随的过度磷酸化tau丝聚集体[57]. 缺失的基因是脯氨酸蛋白酶-1，它通过与APP的磷酸化Thr688结合而与Aβ的产生和聚集相关，通过与tau的磷酸化-Thr231相互作用而与tau磷酸化相关。有趣的是，Pin1还通过c-Abl途径稳定TAp73[58].

已证明Aβ可激活c-Abl并增加p73水平[59]，而APP的瑞典突变形式增加了p73基因TA和∆N启动子的表达，但导致TA形式的总体增加[60]. 因此，p73在AD中起着关键作用，尤其是TA和∆N形式之间的平衡至关重要。然而，从以上和其他观察结果来看，例如p53转录活性受早老蛋白调节，γ-分泌酶复合物的许多成分本身也受p53调节[61]，p73单独行动似乎不太可能。进一步研究p73与其他p53家族成员，尤其是p53本身在神经组织中的相互作用，无疑将有助于我们了解其在正常成人大脑和阿尔茨海默病发病过程中的作用。

结论

从这些研究中可以看出，p73是p53家族成员，在中枢神经系统的发育和维持，甚至在其退化过程中起着基础性作用。事实上，如图4p73基因在从神经干细胞到成熟的有丝分裂后神经元的整个神经发生过程中发挥作用。尽管在这个阶段可能过于简单，但这些新发现表明TAp73是神经元分化和维持神经干细胞所必需的亚型。相反，∆Np73似乎在神经元存活中起着重要作用。然而，在亚型特异性敲除小鼠中观察到的表型比完全敲除小鼠的表型温和，这表明，与癌症一样，p73亚型之间的相互作用最终决定了表型。

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图4

p73在神经发生中的作用。功能神经元由神经干细胞生成，成熟后集成在神经元回路中。TAp73对神经干细胞的分化和维持至关重要。ΔNp73作为一种生存机制和未知途径发挥着重要作用。问号表明分子机制尚未完全研究

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参与者信息

理查德·奈特，电子邮件：ku.ca.lcu.hci@thgink.r.

马西米利亚诺·阿戈斯蒂尼，电子邮件：上午582点，ku.ca.retseciel.

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