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自然神经科学。作者手稿；PMC 2011年3月22日发布。
以最终编辑形式发布为：
自然神经科学。2008年6月；11(6): 721–728.
2008年5月4日在线发布。 数字对象标识：10.1038/nn.2118
预防性维修识别码：PMC3062628型
美国国立卫生研究院：尼姆斯276529
PMID：18454144

转基因小鼠中诱导性cre介导敲除的单神经元标记

保罗·杨,1,4 李秋,1 王东青（Dongqing Wang）,1 赵胜利,1 詹姆斯·格茹斯,1,三和冯国平1,2
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

为了便于对挤满数十亿细胞的哺乳动物神经系统中的神经元连接进行功能分析，我们开发了一种新技术，允许在小鼠荧光标记的单个神经元中进行诱导性基因操作。我们将此技术称为SLICK秒单神经元L（左）教唆我可导电的C类再介导的K（K）诺科特。SLICK是通过在相同的小神经元亚群中共同表达药物诱导型cre重组酶和荧光蛋白来实现的。因此，SLICK将强大的cre重组酶系统用于条件遗传操作，并将单个神经元的荧光标记用于成像。我们使用SLICK在几种类型的神经元中证明了有效的诱导性基因操作。此外，我们应用SLICK消除神经肌肉接头的一小部分中的突触传递。我们的结果为成年动物非活动性神经肌肉突触的长期稳定性提供了证据。更广泛地说，这些研究证明了一种cre-LoxP兼容系统，用于分离单个可识别神经元的基因功能。

介绍

哺乳动物的神经系统包含数十亿个神经元的异质混合物，这些神经元通过数万亿个突触相互连接。揭示单个神经元形态和电生理特性的技术克服了这种复杂性，并帮助奠定了现代神经科学的基础。今天，几个哺乳动物基因组的测序为神经科学家提供了前所未有的机会，以确定神经系统复杂结构和功能背后的分子机制。小鼠的基因操作是解剖神经系统中单个基因作用的有力工具，目前正在进行大规模项目，其最终目标是生成所有小鼠基因的条件敲除等位基因1然而，困难在于对大脑中突变体神经元的结构和功能进行详细分析，大脑中紧密地塞满了数十亿相互连接的细胞。因此，开发小鼠个体神经元的条件遗传操作工具将极大地促进神经系统的功能基因组学。此外，现在有大量的基因编码工具可用于监测和操作神经元的各种特性2-8允许将这些工具应用于单个可识别神经元的遗传方法将大大扩展其在探测神经元结构和功能方面的用途9.

对单个神经元进行遗传分析的主要困难体内是在大量野生型细胞中鉴定出少数转基因神经元10。我们之前产生了转基因小鼠，通过利用一种称为“位置效应变异”的转基因现象，小部分神经元被荧光蛋白明亮地标记11.在活体动物中以类似高尔基体的方式对孤立的单个神经元进行荧光标记，可以直接体内神经系统可接近区域神经元动力学的可视化和成像12-15在这里，我们描述了一种方法，该方法将单个神经元的荧光标记与相同标记神经元的诱导性基因操作相结合。这是通过使用两份Thy1启动子同时表达creER来实现的T2段，一种药物诱导型的cre重组酶16和黄色荧光蛋白（YFP）在同一细胞中。因此，该方法结合了强大的cre/loxP系统，用于执行条件基因敲除或转基因表达，并使用荧光报告器标记单个神经元，以揭示其形态。基因操作在空间上仅限于标记神经元的小亚群，可以通过服用激活药物三苯氧胺进行暂时控制。因此，我们将此技术命名为秒单神经元L（左）教唆我可导电的C类再介导的K（K）nockout（滑动）。我们通过在SLICK小鼠荧光标记的单个神经元中显示高效的他莫昔芬诱导的cre介导的重组来验证该方法。作为该方法应用的原理证明，我们使用SLICK小鼠操纵神经活动体内删除胆碱乙酰转移酶(ChAT公司)标记运动神经元亚群中的基因。这种方法揭示了在没有突触传递的情况下神经肌肉突触的显著长期稳定性。更广泛地说，这项研究展示了一种强大的基因工具，它可以与所有基于cre/loxP的转基因小鼠兼容。

结果

cre重组酶和YFP的转基因共表达

cre/loxP位点特异性重组酶系统已被广泛用于在小鼠中进行条件基因敲除和条件基因表达17我们的目标是开发转基因小鼠，在转基因小鼠中，可以使用cre/loxP系统在整个神经系统的荧光标记神经元的小亚群中进行诱导性基因操作。考虑到这一目标，我们评估了实现荧光蛋白和creER转基因共表达的策略T2段，一种三苯氧胺诱导的cre重组酶16,18我们推断，这将揭示单标记神经元的形态，同时允许注射三苯氧胺后cre介导的基因敲除或这些细胞中的基因表达(图1a-c).

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在SLICK转基因小鼠中联合表达YFP和cre的策略

答：。用于生成SLICK转基因小鼠的DNA构建的示意图。Thy1启动子的两个拷贝驱动YFP的表达和cre重组酶的诱导形式–creERT2段.克里尔T2段由cre重组酶融合到来自雌激素受体的修饰配体结合域组成，可被合成配体他莫昔芬激活，但不能被内源性雌激素激活16因此，三苯氧胺给药可用于控制重组的时间。B、 C、。使用SLICK系统实现条件基因敲除和表达的策略。首先将SLICK小鼠与感兴趣基因的表达通过cre介导的重组来控制的小鼠杂交。对于基因敲除，感兴趣基因的部分或全部编码序列两侧有两个短的loxP序列（“floxed”），并在cre被三苯氧胺（B）激活后被切除。对于有条件的转基因表达，转录停止序列（stop盒）位于转基因编码序列的上游。通过激活的cre删除停止盒，启动转基因表达（C）。D类,E.公司。双荧光就地SLICK-V转基因小鼠SLICK-A皮层和海马YFP（绿色）和cre重组酶（红色）的杂交。比例尺=20μm。

我们最初尝试联合表达荧光蛋白和creERT2段使用神经元特异性Thy1启动子结合内部核糖体进入位点不允许这两种蛋白质在高水平上共同表达（数据未显示）。因此，我们转而采用一种策略，即每个蛋白质的cDNA表达由Thy1启动子的单独拷贝驱动，这些拷贝以相反的方向（背对背）连接在一起。一个拷贝驱动黄色荧光蛋白（YFP）的表达，另一个驱动creER的表达T2段(图1a). 转基因小鼠是使用这种构建物产生的，以下称为SLICK转基因小鼠。由于该策略依赖于Thy1启动子的不同拷贝来驱动两种mRNA的转录，因此尚不清楚这两种mRNAs是否会在同一细胞中表达，尤其是当转录受到位置效应变异的影响时。为了测试这一点，我们进行了双荧光就地杂交检测YFP和creER的表达T2段SLICK小鼠中的mRNA(图1d). 同一细胞中两种mRNA的表达高度相关，96.2%（+/-0.6%）的YFP表达细胞也表达cre，而99%（+/-0.3%）的cre阳性细胞表达YFP。在表达仅限于极少数神经元的线中也观察到这种紧密关联(图1e).

SLICK转基因细胞中神经元的荧光标记

生成30行SLICK转基因小鼠，并对每行至少2只小鼠的整个神经系统的神经元进行荧光标记。YFP的表达主要局限于投射神经元，与之前报道的Thy1启动子标记的范围和亮度不同11与Thy1-XFP小鼠相似11，表达模式在每一代中稳定遗传(补充图1). 虽然同一直线内个体之间标记神经元的数量存在一些差异，但标记的总体模式没有改变(补充图1). 我们主要感兴趣的是那些小的神经元亚群被明亮地标记，以便在单个神经元中进行基因操作和成像的线路。因此，大多数YFP表达较弱或非常广泛的转基因株系没有得到维持。然而，一种YFP广泛而强烈表达的线（SLICK-H）被保留下来，用于不需要对神经元成像的实验中。表1总结了我们维护的不同行中观察到的YFP标记模式。

表1

7株SLICK转基因小鼠YFP表达模式综述

根据标记群体中神经元的百分比，标记范围被分为三大类。很少表示<10%标记；许多表示10-90%已标记，所有表示>90%已标记。标记特别值得注意的神经细胞群以粗体突出显示。RGC=视网膜神经节细胞，INL=内核层，DRG=背根神经节，SMG=下颌下神经节，前=突触前后=突触后，DG=齿状颗粒细胞，Mossy=小脑苔藓纤维，Purk=小脑浦肯野细胞，Gran=小脑颗粒细胞Olf B=嗅球，Mitral=二尖瓣细胞，n/d=未确定

SLICK线运动轴突视网膜DRG公司SMG公司Cortex公司海马小脑奥尔夫B
RGC公司输入之前岗位CA1公司DG公司苔藓Purk公司格兰二尖瓣
幻灯片-3全部很少很少许多无很少许多许多无许多无无很少
滑道-A很少很少无很少无无许多许多许多许多无无无
滑块-H全部全部许多全部全部许多许多全部许多许多许多许多许多
切片-I全部全部无日期全部许多很少许多许多许多许多许多无许多
滑块-P全部许多无日期许多许多无许多许多许多许多许多无许多
滑道-V很少很少无很少无无很少很少许多很少无很少无
滑轨-X很少很少无很少无日期无日期很少很少许多很少无很少无

为了评估YFP在SLICK转基因小鼠外周神经系统中的表达，我们检测了运动神经元、感觉神经元（背根神经节）和副交感神经元（下颌下神经节）。获得了几个标记了这些神经元群中限制性细胞亚群的细胞系(表1). 在SLICK-A线中，运动轴突的一小部分（<5%）在大多数检查的肌肉中被标记(图2a). 例外的是眼外肌，约50%的轴突表达YFP。同样，在SLICK-a小鼠中也标记有少量背根神经节神经元(图2b).

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SLICK转基因小鼠不同神经元群的YFP标记

答：。SLICK-A线背阔肌运动轴突的标记（绿色）。神经肌肉接头（红色）处乙酰胆碱受体与α-银环蛇毒素的协同训练表明，在这条线上只有一部分运动轴突被标记。B。SLICK-a线中少数背根神经节（DRG）神经元表达YFP。C、。标记SLICK-3系小脑颗粒细胞层中苔藓纤维轴突和神经末梢的子集。D、 E.公司。SLICK-3小鼠嗅球中一小部分YFP表达的二尖瓣细胞。图E显示了两个肾小球二尖瓣细胞顶端树突的高倍视图。F、。SLICK-X线第五层皮层神经元的标记G。明亮的YFP标记SLICK-V系小鼠视网膜中的少量视网膜神经节细胞。H、 我，J。SLICK-V小鼠海马（H和I）和新皮质（J）锥体神经元的极稀疏标记。在高倍镜下，树突棘等精细形态特征很容易辨认（I）。比例尺=20μm。

在中枢神经系统中，不同神经元亚群的标记同样可以在几行中观察到。在SLICK-3系中，嗅球中的二尖瓣细胞亚群（通常每个肾小球有1-3个二尖瓣上皮细胞）被标记(图2d，e). 在这一行的许多肾小球中，可以看到来源于单个标记二尖瓣细胞的树突状簇的精细结构，这使得体内二尖瓣细胞的双光子显微镜成像可行（数据未显示）。这条线也显示了苔藓纤维轴突向小脑颗粒细胞层的标记(图2c). SLICK-V线显示大脑中神经元的标记要稀疏得多。例如，在每个视网膜上通常只观察到6-12个明亮标记的视网膜神经节细胞(图2g). 在海马体中发现标记明亮的单个神经元的频率更高，在新皮质的几个区域中，锥体神经元的标记非常稀疏。(图2h，j). 标记细胞也见于大脑的许多其他区域，包括杏仁核、脑干、下丘和上丘(补充图2). SLICK-V小鼠大脑皮层和海马CA1区锥体细胞的完整树突树可以成像，树突棘等精细特征很容易被观察到(图2i). SLICK-X线的YFP标记模式与大脑许多部位的SLICK-V非常相似，但与SLICK-5相比，这些区域标记的神经元数量更多(补充图3). 特别是，SLICK-X皮层中较高程度的标记可能有利于经颅体内成像(图2f). 总之，SLICK转基因小鼠中的荧光标记揭示了神经系统许多区域神经元的详细形态，包括几个适于生存的区域体内成像方法。为了帮助评估作为实验工具的SLICK线，提供了一系列显示SLICK-V和SLICK-X线矢状截面YFP荧光的全脑图像(补充图2和3).

CreER的验证T2段SLICK小鼠的功能

接下来，我们想测试是否可以在SLICK转基因小鼠的荧光标记神经元内进行诱导性基因操作。为此，我们使用了R26R cre报告菌株19在这个菌株中，一个由loxP位点侧翼的新霉素基因被放置在LacZ公司β-半乳糖苷酶的序列编码及靶向ROSA26位点(图3a). 通过cre重组酶活性切除新霉素基因允许LacZ公司ROSA26启动子的表达。因为该菌株是通过“敲入”基因靶向方法产生的，所以报告基因构建只有一个拷贝，而转基因报告系中存在多个转基因拷贝。这使我们能够准确地确定单个位点的重组效率，这相当于条件基因敲除的cre-mediated重组。

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SLICK转基因小鼠的遗传操作

答：。R26R-cre报告菌株的示意图19在cre介导的重组后，移除新霉素抗性基因和转录停止序列，以允许表达编码β-半乳糖苷酶的LacZ报告基因。黑色三角形代表loxP站点。将与R26R报告基因杂交的SLICK-V转基因小鼠用三苯氧胺诱导cre重组酶活性或用玉米油作为对照.B-E型。在三苯氧胺处理的小鼠（B、C、D）的荧光标记神经元中观察到Lac-Z表达所指示的有效遗传操纵，但在对照动物（E）中没有观察到。B。第五层皮层神经元。C和E海马CA1区的金字塔神经元。齿状回中的颗粒细胞。

将SLICK-V小鼠与R26R报告子杂交，用三苯氧胺处理双杂合子动物以诱导cre活性(图3a). 口服他莫昔芬或单独载体（玉米油），每天一次，连续五天。通过免疫荧光染色检测重组LacZ公司三苯氧胺最终治疗两周后的表达(图3b–e).LacZ公司在载体处理的动物中从未发现阳性细胞(图3e). 在用他莫西芬治疗的动物中，我们观察到其健壮LacZ公司YFP阳性神经元的染色(图3b–d)而且很少观察LacZ公司未检测到YFP荧光的阳性细胞（<1%LacZ公司阳性细胞；未显示）。因此，SLICK-V/R26R动物没有“漏”的报告基因表达，cre活性可以诱导，并且如预期的那样仅限于荧光标记的神经元。三苯氧胺给药后24-48小时内发生重组LacZ公司治疗后5天观察表达(补充图4). 接下来，我们量化了SLICK-V/R26R小鼠多个脑区明亮荧光神经元的重组效率(表2,补充图5). 在大多数被检测的神经元群体中，重组效率超过95%(表2). SLICK-X生产线也获得了类似的结果(表2,补充图6). 因此，SLICK系统可以可靠地识别和成像基因操纵的单个神经元。

表2

在SLICK-V和SLICK-X/R26R双转基因小鼠中评估重组效率
脑干塔拉穆斯海马CA1齿状陀螺仪Cortex公司
滑道-V98% (62/63)90% (17/19)96% (204/213)95% (131/138)95% (72/76)
滑轨-X97% (140/144)90%（150/166）93% (289/312)98% (643/659)92% (274/298)

对至少7个50μm矢状切面中所有明亮标记的YFP阳性细胞进行计数。括号中的数字表示LacZ公司阳性细胞/YFP阳性细胞。根据这些数字计算百分比。

SLICK小鼠条件基因敲除

理解神经活动影响神经回路形成和可塑性的机制是神经科学研究的一个主要重点20,21为了使用SLICK系统解决这个问题，我们利用了携带胆碱乙酰转移酶条件敲除等位基因的小鼠(ChAT公司)基因22(图4a).ChAT公司是神经递质乙酰胆碱合成和基因消融所必需的ChAT公司已经证明可以消除胆碱能突触如神经肌肉接头（NMJ）的神经传递，从而导致新生儿死亡22,23为了研究成人神经肌肉突触神经传递长期抑制的后果，我们使用SLICK-A线敲除ChAT公司在YFP标记的运动神经元的一小部分中。滑道-A+/ChAT公司flox/−用三苯氧胺治疗小鼠以诱导ChAT公司或者用玉米油作为对照(图4b–e). 三苯氧胺治疗8周后，检查运动轴突和神经肌肉突触。ChAT公司免疫荧光染色检测其表达，并用α-银杏毒素标记突触后乙酰胆碱受体。未经治疗的对照动物ChAT公司存在于YFP标记的（箭头）和未标记的轴突和神经末梢中(图4b、d). 相比之下，在三苯氧胺治疗的动物中ChAT公司在99%（111/112）的YFP标记的运动轴突和97%（73/75）的YFP标记的神经末梢中检测不到(图4c、e; 箭头）。ChAT公司几乎存在于所有经他莫昔芬治疗的动物的YFP阴性轴突和末端(图4b、d)，尽管偶尔ChAT公司在非YFP标记的轴突和终末中无法检测到（未显示；参见在线补充讨论用于讨论此观察结果）。类似的总体结果ChAT公司他莫昔芬给药四周后观察到基因敲除（数据未显示）。因此，在八周时间点检查的NMJ将完全耗尽ChAT公司至少四周。总之，floxed的高效重组ChAT公司在表达YFP的细胞中观察到等位基因。这表明，SLICK系统可用于以与报告基因表达观察到的相同甚至更高的速率实现基因敲除（参见表2).

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通过以下途径抑制运动神经元亚群的神经传递ChAT公司SLICK-A小鼠的敲除

答：。条件的示意图ChAT公司等位基因。外显子3和4在cre介导的重组后被删除。B、 C、。免疫荧光染色ChAT输入进入眼外肌的神经段。高效ChAT公司在三苯氧胺处理的YFP标记的运动轴突（C）中观察到敲除，但在对照动物（B）中未观察到敲除了。箭头和箭头显示ChAT公司+和ChAT公司−轴突。D、 E。NMJ染色ChAT公司以及α-银环蛇毒素（用于标记乙酰胆碱受体）。所有神经末梢均表现强劲ChAT公司对照动物的染色，但ChAT是在他莫昔芬治疗的动物中，从YFP标记的末端特别删除。箭头和箭头显示ChAT公司+和ChAT公司−NMJ。F、 G、H。NMJ形态方面的量化ChAT公司+和ChAT公司−NMJ。NMJ的长度被确定为F（n=75个交叉点）中总交叉点尺寸的测量值。α-银环蛇毒素的染色强度被量化为G（n=40个连接点）中连接乙酰胆碱受体密度的测量值。YFP标记的NMJα-银环蛇毒素染色区域ChAT公司−和ChAT公司+突触前神经末梢，在H处测量（n=97个连接点）。所有量化中均使用了至少三块肌肉的数据。比例尺=20μm。F、G、H中的误差条表示平均值的标准误差。

为了确定运动神经元子集中的神经递质的长期抑制是否改变了NMJ的稳定性，我们比较了YFP标记的ChAT公司−未标记的NMJChAT公司+NMJ。作为NMJ总大小的测量，我们量化了α-银环蛇毒素标记显示的NMJ的最大长度。我们还通过定量α-银环蛇毒素染色的强度来检测突触后活性胆碱受体的表达水平。我们发现ChAT公司+和ChAT公司−这些参数之一的连接(图4f和4g). 接下来我们检查了YFP表达的形态学ChAT公司−神经末梢。我们发现神经末梢的YFP标记与突触后α-银环蛇毒素染色在ChAT公司−交叉点。α-银环蛇毒素标记突触后位点的占据ChAT公司−神经终末占99.7%（n=97个连接点）。这与YFP标记的突触后位点的占据相同ChAT公司+未经治疗的对照动物的终末(图4h). 因此，没有证据表明非活动终端从NMJ中收回。此外，我们没有观察到任何非活动轴突的异常生长或萌芽，也没有观察到非活动终末的复杂性或结构的任何明显异常。总之，接下来的八周ChAT公司击倒，非活动ChAT公司−NMJ在形态学上与相邻的活性连接区没有区别，也没有证据表明活性连接区替代了非活性连接区。

讨论

小鼠的基因操作已被证明是剖析神经元连接的发展、维持和可塑性机制的有力工具24在这里，我们描述了一代SLICK转基因小鼠，该小鼠允许在标记有YFP的单个神经元中进行遗传操作。诱导性转基因表达和基因敲除的重组效率均大于95%。以这种精确的方式对标记神经元进行基因操作的能力有几个优点。首先，YFP的高尔基样标记允许分析单个突变神经元的详细形态和突触连接。第二，将基因操作限制在标记的小神经元子集上，使得分析可以在以野生型为主的背景下进行，防止神经回路的大规模中断，并使细胞自主基因功能与广泛基因敲除的间接影响相区别。这将有助于研究突触形成和消除等发育过程中突变体和野生型神经元之间的竞争。第三，利用SLICK系统进行基因操作的诱导性允许在发育后期或成年阶段分析基因功能，从而避免了胚胎致死、早期发育缺陷或次级代偿机制的潜在并发症。SLICK系统的另一个重要特征是神经元的YFP标记是结构性的。这使得来自未经处理的动物的标记神经元可以用作基因操纵细胞的对照。此外，体内对YFP标记的神经元进行成像应该可以在基因操作前后对相同的细胞进行成像，从而可以在同一神经元中存在或不存在给定基因的情况下检查神经元的特性体内对基因调控神经元的这种延时成像也将使我们能够研究细胞形态和突触可塑性的动态方面。

我们的方法的目标类似于最近描述的一种称为双标记镶嵌分析（MADM）的技术10嵌合分析利用有丝分裂重组产生对感兴趣基因纯合无效的细胞克隆，并在果蝇中广泛使用25.MADM是马赛克分析的一种改进，用于小鼠。MADM和SLICK的目标是在荧光标记的细胞群中进行遗传操作。然而，这两种方法之间存在许多内在差异。例如，MADM在有丝分裂细胞中起作用，主要适用于处于早期发育阶段的神经元，此时神经元前体仍在分裂。相反，SLICK更适用于胚胎晚期、出生后和成年小鼠，因为它依赖于在这些阶段最活跃的Thy1启动子。对于基因敲除实验，每种技术可以使用的基因集是不同的。当标记最终位于所有小鼠染色体的每一条臂上时，MADM可用于所有类型的突变（靶向、自发或化学诱导）。相比之下，SLICK与所有固定的条件敲除等位基因兼容，但与其他类型的突变不兼容。MADM的优点不仅限于神经元，而且原则上可以用于任何细胞或组织。SLICK是神经元特异性的，但它的优点是能够暂时控制特定类型神经元的遗传操作。因此，尽管这两种方法的目标大体相似，但在实践中，它们可能会在神经科学研究中发现不同但非常互补的应用。

为了证明SLICK对基因敲除的实用性，我们使用该系统通过敲除细胞内的必需外显子来抑制胆碱能神经传递ChAT公司基因22这阻止了乙酰胆碱的合成，有效地使胆碱能神经元沉默。由于呼吸衰竭，胆碱能传输的全球中断是致命的22,23。我们通过使用SLICK-A系列小鼠来限制ChAT公司敲除大多数肌肉中YFP标记的运动神经元的一小部分。这为我们提供了一个独特的机会来抑制神经传递体内长时间处于神经末梢的亚群中，同时保持相邻神经末梢活动不受干扰。我们已经检查了这种操纵对NMJ稳定性的影响。我们发现，在这种条件下，NMJ的大体形态没有改变。沉默连接处的受体表达水平没有改变，这与短期药物抑制动作电位后的观察结果一致26,27我们还考虑了活动轴突可能侵入或接管不活动的NMJ的可能性，类似于失神经的NMJ可以通过从完整的相邻连接处发芽轴突来进行神经支配的方式28然而，我们没有发现任何证据表明ChAT公司−神经末梢腾空了非活动的连接，我们也没有发现活动的轴突取代了非活动轴突（参见在线补充讨论进一步讨论这些发现）。总之，成年NMJ在没有神经传递的情况下长时间保持极为稳定，尽管与邻近的活动神经末梢存在潜在的竞争。

除了用于靶向基因敲除之外，SLICK还可以用于靶向任何对单个荧光标记神经元感兴趣的基因的表达体内近年来，人们开发了许多基因编码工具来监测和操纵神经元的各种生理特性2-8,29-32这些包括突触传递和离子浓度的荧光报告，以及调节神经元兴奋性和神经递质释放的试剂。SLICK将允许这种探针在单个神经元中表达体内同时显示神经元的形态以进行成像或识别以进行电生理分析。以这种方式使用，SLICK将允许许多基因编码探针首次以单细胞分辨率应用于小鼠。虽然一些荧光报告物基于YFP，并且与此处描述的SLICK小鼠不兼容，但通过生成表达光谱上不同荧光蛋白的SLICK小鼠，可以避免这个问题33因此，SLICK有潜力扩大最近开发的各种用于监测和操作神经元和神经回路的工具的范围和用途。

SLICK基于流行的cre/loxP系统，该系统已被广泛用于实现小鼠条件基因敲除17,34,35.携带条件敲除等位基因的小鼠的可用性不断增加，一个大规模的产生“floxed”条件敲除等位基因的项目正在进行中1SLICK系统可用于开发这种资源，并应允许在这些小鼠的单神经元水平上研究细胞表型。因此，SLICK作为一种功能基因组学工具在研究神经系统的功能和功能障碍方面具有很大的潜力。

方法

转基因DNA构建物的产生

Thy1载体已在前面描述过，由Pico Caroni提供给我们11,36.矢量pCreERT2段包含creERT2段编码序列来自Daniel Metzger和Pierre Chambon16生成Thy1-YFP:Thy1-creERT2段双启动子构建体T2段从pCre-ER中切下T2段使用EcoRI并通过钝端结扎克隆到Thy1载体的XhoI位点。Thy1-YFP的生成如前所述11.Thy1-creER（你的孩子）T2段然后通过Thy1启动子5′端的EcoRI位点连接Thy1-YFP。在注入卵母细胞之前，使用NotI对最终构建物进行线性化，以去除载体主干。

老鼠

使用标准技术将凝胶纯化DNA注射到受精卵母细胞中生成SLICK转基因小鼠37注射用胚胎取自（C57BL6/J和CBA）F1杂种之间的交配。将转基因创始人回交给C57BL6/J小鼠，以分析其表达模式。用于基因分型的引物和方案在在线补充方法cre报告小鼠的R26R系19来自Jackson实验室（库存编号：003474；Bar Harbor，ME，USA）。ChAT公司条件敲除小鼠来自Joshua Sanes22.动物实验按照杜克大学的制度协议进行。科克大学学院的动物实验得到了大学伦理委员会的批准，并在卫生与儿童部的许可下进行。

原位杂交

将包含YFP和cre重组酶完整编码序列的探针序列克隆到pBluescript SKII载体（美国加利福尼亚州拉霍亚市斯特拉赫纳）。双加氧素或荧光标记RNA探针由在体外根据制造商的说明，使用MaxiScript工具包（Ambion，Austin，TX，USA）进行转录。对于就地对杂交新鲜组织进行解剖，并将其快速嵌入OCT复合物中并冷冻（TissueTek，Torrance，CA，USA）。在徕卡CM 1850低温恒温器上切下20μm切片，用4%多聚甲醛固定5分钟，并在PBS中冲洗3次。双荧光就地使用酪胺信号放大（TSA）系统进行杂交（Perkin Elmer，Waltham，MA，USA）。使用荧光标记探针和荧光素-吡喃胺检测YFP mRNA。使用地高辛标记探针和Cy3-酪胺检测Cre mRNA。使用20倍物镜在蔡司Axioskop 2荧光显微镜上采集图像。

SLICK小鼠的荧光成像

为了对YFP荧光成像，对小鼠进行麻醉，并通过心脏灌注，首先用乳酸林格溶液，然后用4%对甲醛。肌肉背根神经节和视网膜的图像取自整个组织。对于大脑，使用振动切片机切割100μm切片。使用20×和63×物镜，在尼康Eclipse共焦显微镜上获得整个支架组织和切片的共焦图像。对于神经肌肉接头的双色成像，乙酰胆碱受体用罗丹明结合α-银环蛇毒素（1:10000）标记2-3小时，并在PBS中清洗3次ChAT公司使用HCX PLAPO 63×物镜在徕卡DM IRE2共焦显微镜上进行。使用488 nm激光线激发YFP，并在508至550 nm之间收集荧光发射。Cy3在543nm处激发，荧光在555-627nm之间收集。Alexa647在633 nm处激发，在650至750 nm之间收集荧光。

抗体和免疫组织化学

有关抗体和免疫组织化学方案的详细信息，请参阅在线补充方法.

他莫昔芬给药

通过在室温下摇晃过夜，将他莫昔芬（西格玛，密苏里州圣路易斯，美国；目录号T5648）溶解在浓度为20 mg/ml的玉米油（克罗格品牌）中。这是在室温下储存的，以便立即使用。成年小鼠每天口服0.25毫克/克体重的他莫昔芬，持续五天。为了在SLICK-V/R26R小鼠中诱导重组，在第一次治疗后两周进行第二次5天治疗。SLICK-V/R26R小鼠在首次治疗之日为12-16周龄。诱导ChAT公司基因敲除后，小鼠在10周龄时用三苯氧胺治疗5天。然后在5或9周后杀死这些小鼠进行分析。

图像分析和量化

分析就地杂交数据和β-半乳糖苷酶免疫组织化学通过使用Adobe Photoshop软件对合并的两种颜色的图像中的细胞进行手动计数来进行。在合并图像之前，以盲法选择要计数的细胞。在测定SLICK-V/R26R小鼠的重组效率时，只考虑了适合详细细胞形态成像的明亮细胞。

分析ChAT公司敲除效率和NMJ结构完全在全山染色的眼外肌上进行。这是因为这些肌肉中较高程度的标记提供了ChAT公司+和ChAT公司−用于统计分析的NMJ数量大致相等。为了检查神经肌肉接头，收集共焦图像的Z序列，并对每个序列进行最大强度投影。所有图像分析均使用ImageJ软件进行。的大小ChAT公司−和ChAT公司+通过测量α-银环蛇毒素染色的最大尺寸来量化来自同一肌肉的NMJ。的统计比较ChAT公司−和ChAT公司+采用非配对Student’s T检验测定连接尺寸。通过测量成对乙酰胆碱受体的荧光强度来定量乙酰胆碱的受体密度ChAT公司−和ChAT公司+同一映像中的NMJ。对整个图像应用相同的阈值，并使用ImageJ中的棒工具选择NMJ的区域。然后测量整个NMJ上的平均像素强度。只有NMJ平放在肌肉纤维上，附近只有成对的NMJChAT公司−和ChAT公司+使用类似震源深度的NMJ进行分析。采用配对T检验进行统计分析。使用ImageJ对包括所有分支在内的银环蛇毒素染色的椒盐卷饼样模式进行直线追踪，计算神经末梢对NMJ的占有率。测量该轨迹的长度，并与基于YFP荧光的神经末梢线追踪进行比较。

SLICK鼠标的在线资源和可用性

描述不同品系SLICK小鼠神经元标记和重组模式的数据可在Feng Laboratory网站上获得(http://guopingfenglab.net/resources.html). SLICK-A和SLICK-V生产线目前可从美国缅因州巴尔港的杰克逊实验室获得(http://jaxmice.jax.org/). 有关其他线路的可用性以及如何申请的信息，请参阅Feng Laboratory网站。

补充材料

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致谢

我们感谢Joshua Sanes提供ChAT公司条件敲除小鼠和抗β-半乳糖苷酶抗体。我们感谢Adi Mizrahi对SLICK-3小鼠进行双光子成像，并感谢Robert Kotloski对他莫昔芬给药的建议。我们还感谢杜克神经转基因核心设施培育SLICK小鼠。我们感谢詹姆斯·麦克纳马拉（James McNamara）、迈克尔·D·埃勒斯（Michael D.Ehlers）和玛丽·麦卡弗里（Mary McCaffrey）使用共焦显微镜。我们感谢本杰明·阿伦基尔（Benjamin Arenkiel）、迈克尔·D·埃勒斯（Michael D.Ehlers）、安妮·韦斯特（Anne West）、凯利·迪恩（Kellie Dean）和冯实验室的成员批判性地阅读和讨论手稿。此外，还感谢露丝·K·布罗德生物医学研究基金会、爱尔兰科学基金会和国家卫生研究所的支持。

脚注

作者贡献：P.Y.和G.F.构思了SLICK方法，设计了实验并撰写了手稿。P.Y.和J.G.产生了SLICK转基因小鼠。P.Y.、L.Q.、S.Z.和D.W.描述了SLICK小鼠的特征。P.Y.和S.Z.进行了定量和数据分析。

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