三聚体HIV-1阴道内免疫后的抗体反应_{54元人民币}Carbopol凝胶中的C基团gp140通过系统启动或添加佐剂配方增强

2.2. 动物

14只英国圈养的红色雌性食蟹猴(束状猕猴)在实验开始时，年龄在4至5岁之间，按照英国内政部（1989年）实施规程居住。手术前用盐酸氯胺酮给动物镇静剂。月经周期由出血开始时间决定。

2.3。免疫

动物被分配到实验组(表1). 免疫时间因个体月经周期而异。Gp140的配方为100μg/ml⁻¹如前所述，在Carbopol凝胶中[21]通过插入阴道约2厘米的注射器给药。对于任何一个阴道内接种周期，动物在月经周期的间隔期内每隔2-3天接受9次配方产品。对于系统免疫，将100μg gp140与等量的AS01佐剂混合，并向每个三角肌注射0.2 ml。

2.4. 生殖道分泌物

使用预先称重的Weck-cel手术矛（Medtronic Ophthalmics，佛罗里达州杰克逊维尔）在宫颈口或阴道壁上放置1分钟，对分泌物进行取样。重新称重后，如前所述从海绵中洗脱分泌物[21]在−80°C下冷冻等分试样之前，将.8μl热灭活的胎牛血清添加到合并的提取物中。

2.5. 总免疫球蛋白和抗gp140结合抗体检测

用夹心ELISA法测定粘膜洗脱液中的总免疫球蛋白浓度。96-well板（中等结合，英国斯通豪斯Greiner Bio-One）涂有山羊抗猴IgG（γ链特异性）（KPL，美国盖瑟斯堡）或山羊抗猴免疫球蛋白A（α链特异性⁻¹清洗和封闭后，如抗体ELISA的下文所述，以1/100和1/1000的稀释度添加粘膜洗脱液。通过添加山羊抗猴IgG（Fc-特异性）HRP结合物（英国Kidlington的AbD-Serotec）或山羊抗猴-IgA（Fc--特异性）HRP结合物来检测结合免疫球蛋白。使用纯化恒河猴IgG（美国伯明翰SouthernBiotech）或纯化人IgA（英国Sigma）得出标准曲线，并考虑样品重量得出的稀释系数计算粘膜分泌物中的浓度。由于纯化的猴IgA不可用，该同种型的结果以单位（U）ml表示⁻¹.

使用标准化ELISA测定抗gp140结合抗体。96-well板每孔涂50μl重组CN54gp140，浓度为5μg ml⁻¹在37°C的PBS中放置1小时。在含有0.05%吐温20（PBS-T）的PBS中洗涤四次后，通过在37°C下与含有10%胎牛血清的PBS-T孵育1h来阻断反应位点。进一步清洗后，添加PBS-T中的血清或粘膜洗脱液系列稀释液，并在37°C下培养1 h。结合IgG用山羊抗猴IgG（Fc-特异）HRP结合物（Serotec）检测，结合IgA用山羊抗猴子IgA（α-链特异）生物素结合物（Acris，Herford，Germany）检测，然后用亲和素-HRP结合物（Sigma）检测。正常对照猴血清用作阴性对照。使用HIV-1免疫猕猴的血清得出标准曲线_W61D型gp120标准[28].根据稀释因子校正抗体滴度和免疫球蛋白浓度，稀释因子由样品重量/样品重量+600导出，假设密度为1 mgμl⁻¹ [19].

2.6. 病毒感染性中和试验

使用TZM.bl细胞中基于标准化荧光素酶的分析，通过转染293T/17细胞制备的1级和2级HIV-1包膜假型病毒，测量中和抗体反应[29,30]50%抑制浓度（IC₅₀)滴度计算为减去细胞对照RLU后，与病毒对照孔相比，相对发光单位（RLU）减少50%的血清稀释度。所有检测均包括小鼠白血病病毒（MuLV）阴性对照。

2.7. 组织单核细胞的提取和ELISpot分析

通过100μm筛孔筛分，在RPMI中分离经解剖的脾组织和淋巴结或骨髓，然后在4°C、400×克取下上清液，将颗粒重新悬浮在剩余介质中，并用10 ml RPMI再次清洗。细胞再次悬浮在25 ml RPMI中，然后通过50μm filcon（英国牛津BD Biosciences）过滤，然后分层到Histopaque-1077（英国Sigma）上，并在室温下以1500×克收集界面细胞并计数活的单核细胞。

体外扩增ELISpot分析基于Bergmeier等人描述的方法。[31]PVDF膜板（Muliscreen HTSIP，Millipore）用35%乙醇处理1分钟，用无菌PBS洗涤三次，并用重组CN54 gp140或KLH（Calbiochem）在10μg ml⁻¹在4°C下过夜。在用PBS-T进一步清洗6次后，在室温下用含有10%FCS和pen/strep的RPMI 1640培养基培养1小时，从而阻断反应位点。将新回收的组织MNC以1×10的比例添加到三个重复的微孔中⁵和5×10⁵细胞/孔，并在37°C、5%CO的环境中培养24小时₂在PBS-T中进一步洗涤后，用1/2000稀释的山羊抗猴IgG-HRP（Serotec）或1/1000的山羊抗猴IgA生物素（Acris）检测结合的分泌抗体，然后用1/2000稀释的抗生物素-HRP（Sigma）检测结合的分泌抗体。通过添加TMB底物（Sureblue TMB 1-组分过氧化物底物，KPL）检测斑点，并用读数器计数。使用涂有山羊抗猴IgG（γ-链特异性）（KPL）或山羊抗猴免疫球蛋白A（α-链特异）（KPL）作为捕获抗体的平板，采用相同的方法测定总IgG和IgA ASC。

3.2. 阴道内接种后，仅在血清转化动物的女性生殖分泌物中检测到抗-gp140抗体

阴道内免疫后，在动物E54和E55的宫颈和阴道样本中间歇性检测到IgG和IgA抗体。一般来说，只有在血清转化后才能在局部检测到抗体；然而，在E54中，在单周期阴道内免疫后和血清转换前，在宫颈样本中检测到低滴度（24-58）的IgG抗体。在E55中，血清转换后立即在宫颈和阴道样本中检测到IgG抗体，但在肌肉免疫之前，在血清转换后的其他7次测试中未检测到Ig G抗体。在8次测试中，有3次在宫颈样本中检测到IgA抗体，滴度从103到242不等，但只有一次在阴道样本中检测。阴道内免疫后，在E54的宫颈和阴道样本中检测到IgG和IgA抗体的频率较高；然而，滴度在宫颈样品中IgG阳性峰值24–295之间波动，阴道样品中的阳性峰值59–563之间波动，宫颈样品中的IgA在50–169之间波动，而阴道样品中Ig A在53–264之间波动，无法检测。抗体低于检测限的样品与回收样品的重量或总IgG或IgA含量没有一致的关联模式。

3.3. 经阴道内注射的猕猴肌肉内免疫增强粘液检测抗体反应

A组动物的肌肉内免疫导致4只猕猴中的3只出现或增强了粘膜检测抗体。此外，在研究期间，抗体滴度比单独阴道内免疫后的抗体滴度更稳定(图1). 有趣的是，在E53中，肌肉注射增强前检测不到血清抗体，但增强后表现出记忆反应，尽管总IgA浓度为2118–70528 U ml，但仅在局部检测到IgG抗体⁻¹和1338–28838 U ml⁻¹分别在宫颈和阴道样本中(表2). 由于血液污染，IgG抗体不太可能出现，因为只有一个宫颈样本检测到血红蛋白。在这两只先前通过粘膜检测到抗体的动物中，IgG和IgA抗体滴度都提高了。在E54中，宫颈和阴道样本中检测到的IgG抗体峰值滴度分别为2500和5582，而肌肉注射前的峰值滴度则分别为295和563。同样，在子宫颈和阴道样本中检测到的IgA抗体峰值滴度分别为1086和1522，而在肌肉注射免疫前的峰值滴度则分别为169和264。同样，在E55中，宫颈和阴道样本中的IgG抗体峰值滴度分别从186增加到3360和528增加到1719，IgA峰值滴度则分别从242增加到1243和355增加到515。尽管肌肉注射增强后血清反应加快，但在任何情况下均未检测到局部记忆反应。尽管有血清转化，但动物E56没有检测到抗体；然而，该动物粘膜样品中的总IgG和IgA浓度始终较低(表2). 相反，当在相同的时间段内观察到单一肌肉免疫后，通常在B组动物的宫颈和阴道样本中检测到IgG(图2)但在任何一只动物中，这是不规则的，总的来说，滴度远低于接受阴道内注射的动物E53、E54和E55（宫颈gmt 63对1298，阴道gmt 65对1511；P（P） < 0.001; Mann–Whitney秩和检验）。同样，如果检测到宫颈和阴道IgA滴度，则在肌肉免疫之前进行阴道内注射时，其滴度较高；然而，样本量太小，无法进行统计分析。

3.4. 对以单一肌肉内免疫为基础的猕猴进行阴道内免疫，可增强血清和粘膜检测到的抗gp140抗体反应

为了确定启动/预先存在的抗体对阴道内免疫的影响，4只猕猴在一个阴道内免疫周期前70–82天接受了一次肌肉内免疫（B组：表1)另外4只动物在最后一次肌肉免疫后128–143天接受3次肌肉免疫，然后进行一个周期的阴道内免疫（C组：表1). B组四只动物中有三只在阴道内注射gp140（IgG）后血清IgG和IgA滴度显著升高P（P）=0.05，IgAP（P） = 0.039; 配对t检验）(图2). 相比之下，C组动物在阴道内给药后均无血清抗体升高(图3). 正如预期的那样，与B组动物相比，接受过3次肌肉免疫的C组动物在阴道内免疫时血清IgG和IgA的滴度显著升高（IgG gmt:18197对649，P（P） < 0.001; IgA gmt:1972对173，P（P）=0.027；t检验）。

鉴于在不同采样时间以及在某些情况下同时采集的宫颈和阴道样本之间的差异性，很难解释粘膜可检测抗体的结果。B组的所有动物在阴道内免疫后似乎都有反应，包括血清抗体没有增加的E49。这只动物很不寻常，因为血清IgA滴度与IgG滴度相似，并且在宫颈和阴道样本中IgA滴定度高于IgG滴定度。有趣的是，这种动物的宫颈或阴道分泌物中的总IgA浓度没有升高(表2)只有在第126天，当宫颈样本中的抗gp140 IgA滴度下降，并且低于阴道样本中的检测限时，才出现明显的血红蛋白污染。

肌肉注射免疫后，C组所有动物均出现粘膜检测到的抗体反应。在大多数情况下，抗体在第二次免疫后出现，随后减弱，并在进一步肌肉注射后恢复。由于后勤原因，不可能在阴道内免疫前立即获得粘膜样本；然而，在阴道内免疫周期后，所有动物都局部检测到抗体，但峰值滴度没有升高。总的来说，在阴道内增强之前进行3次肌肉内免疫，无论是在宫颈和阴道样本中检测到的抗体反应的频率还是滴度方面，都没有任何优势。

总的来说，在C组和D组中，宫颈液中的IgG和IgA抗gp140抗体滴度均高于阴道液，阴道和宫颈样品中的Ig G和Ig A的中位滴度分别为80和24，IgA的中位数滴度分别是103和54(图4). 然而，这种差异仅在IgG方面达到统计学意义。个体动物的比较显示，在分别测试IgG和IgA的76%和85%的情况下，宫颈样本的抗体滴度高于阴道样本。同样，与阴道样本相比，宫颈中的总免疫球蛋白浓度更高（IgG中位数392μg ml⁻¹和239μg ml⁻¹; IgA中值8752 U ml⁻¹和6657 U ml⁻¹分别用于宫颈和阴道），但仅在IgG方面达到统计学意义(图4). IgG滴度与IgA滴度在任何一个位点上的直接比较都是不可能的，因为IgA抗体检测使用了一个额外的扩增步骤，之前已经证明该步骤可以更好地区分低阳性结果和背景、非特异性结合。总IgG和IgA浓度的比较也被排除在外，因为纯化的食蟹猴IgA无法用于IgA分析的校准，因此使用纯化的人类IgA。

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图4

阴道分泌物和宫颈分泌物中抗gp140特异性抗体和总免疫球蛋白的比较。用AS01佐剂中的gp-140肌肉免疫动物一次或三次，然后用Carbopol凝胶中的gp140进行9次阴道内免疫（B组和C组）（a）P（P）=0.006（**）IgG水平，但IgA无显著差异（ns）P（P）=0.097（Mann–Whitney排名总和测试）。（b） 宫颈分泌物中的总IgG浓度明显较高，P（P）=0.001（**）（Mann–Whitney排名总和测试）。（c） 两个部位体液中的总IgA浓度没有显著差异，P（P） = 0.22. 组平均值（---）和中间值（-）滴度用方框图表示。

3.5. 在肌肉注射激发的动物中，针对1级包膜假型的血清中和活性与结合抗体滴度相关，并显示出有限的特异性

在A组的4只动物中，有2只在辅助肌肉免疫后诱导了针对C分支1级MW965.26假病毒的血清病毒中和活性，尽管其中一只动物的抗体滴度很低；B组4只动物中有3只在阴道内免疫后低滴度，C组4只中有4只在3次肌肉内免疫后，这种活性没有因随后的阴道内免疫而增强。肌肉免疫34天后，在D组动物中未发现活动(表3). 在检测到中和活性高于60的截止滴度的血清中，发现该活性与IgG之间有很强的相关性(第页 = 0.87,P（P）<0.001）和IgA(第页 = 0.82,P（P） < 0.001; 皮尔逊积矩相关）抗gp140结合滴度(图5). 在B组和C组动物的血清中，抗gp140 IgG滴度大于3000始终预示着中和活性。值得注意的是，A组并非如此，尽管在阴道内免疫后诱导了高滴度的抗gp140 IgG（16000–134000），但仅在结合抗体滴度最高的动物E54中检测到明显的中和活性。

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图5

病毒中和活性与血清结合抗体滴度之间的相关性。在针对1级分支C HIV-1 MW963.26假病毒的连续血清样品中测量中和活性，并将其与通过阴道内系统（A组）和系统阴道内（B组和C组）方案用gp140免疫的猕猴的血清IgG和IgA gp140结合抗体滴度进行比较。

为了确定中和活性的广度，对血清进行了一系列假型测试，包括其他4种1级信封。尽管没有发现针对TV1.21（另一个C级包线）的活动，但针对B级SF162.LS检测到一些活动(表3)，但不针对B级、BaL.26级或A级、DJ263.8级。13个二级C包层（96ZM651.02、Du156.12、Du172.17、Du422.1、CAP45.2.00.G3、CAP210.2.00.E8、ZM197M.PB7、ZM214M.PL15、ZM233M.PB6、ZM249M.PL1、ZM53M.PB12、ZM109F.PB4、ZM135M.PL10a）均未发现任何中和活性。C族和B族之间的交叉反应仅限于对MW965.26进行高滴度中和的血清（滴度为594–2846）；然而，滴度在这个范围内的动物E58的血清没有发生交叉反应。

这项工作的资金来源于比尔和梅琳达·盖茨基金会和威康信托基金会根据全球卫生倡议的重大挑战向SGUL提供的赠款，以及比尔和梅林达·盖茨联合基金会艾滋病疫苗发现/综合抗体-疫苗免疫监测联合会向哈佛医学院提供的赠款，授予编号38619。我们感谢雷根斯堡大学的Ralf Wagner教授和Hans Wolf教授以及GENEART AG公司提供的p97CN54表达质粒，以及NIBSC的Mark Robinson和William Elsley教授提供的帮助。该研究与通过EUROPRISE杀菌剂和疫苗卓越网络标准化HIV疫苗开发的努力相结合。MPC和PFM得到了Joseph Hotung爵士信托基金的支持。