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临床癌症研究。作者手稿；PMC 2012年3月15日提供。
以最终编辑形式发布为：
《临床癌症研究》，2011年3月15日；17(6): 1463–1473.
2011年1月10日在线发布。 数字对象标识：10.1158/1078-0432.CCR-10-0091
预防性维修识别码：PMC3060277型
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院239568
PMID：21220470

肺泡横纹肌肉瘤13q31染色体区扩增的基因组学和临床分析：来自儿童肿瘤组的报告*

詹妮弗·赖切克,1,2,†‡ 丰海段,三，† 勒奈特·史密斯,4,5,† 唐娜·M·古斯塔夫森,1 罗迪·奥康纳,1 Chune Zhang先生,1 曼迪·皮特斯,6 朱莉·M·加斯蒂尔-福斯特,6,7和弗雷德里克·巴尔1,§
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

目的

这项研究确定了肺泡横纹肌肉瘤（ARMS）13q31染色体区域扩增的分子特征和临床意义，ARMS是一种侵袭性儿童癌症第3页-FOXO1系列和PAX7-FOXO1系列基因融合。

实验设计

使用寡核苷酸阵列将13q31扩增子定位在ARMS病例的初始样本中。A荧光就地设计了针对该区域的杂交检测方法，并应用于更多ARMS病例，以确定扩增的频率和分布。定量逆转录-PCR分析用于测量基因表达。用Kaplan-Meier和Cox比例风险模型确定拷贝数和表达的临床意义。

结果

我们将13q31放大器定位到0.15Mb区域，该区域包含MIR17HG型编码多顺反子microRNA簇miR-17-92的基因。23%的ARMS病例中存在这种扩增子，明显偏爱PAX7-FOXO1系列-阳性病例。在13q31扩增的肿瘤中，miR-17-92簇内六种microRNA中的五种表达显著增加（miR-17、miR-19a、miR-19 b、miR-20a和miR-92）。此外，还发现了所有六种microRNA的拷贝数独立过度表达的非扩增肿瘤子集。在临床分析中，与非扩增病例相比，13q31-扩增病例中上述五种microRNA表达增加的结果明显较差。在这些microRNA表达较低的13q31-扩增病例中，结果也有所改善。

结论

miR-17-92簇的13q31扩增和表达提供了新的标记物来识别预后良好和较差的亚群PAX7-氧代1-正ARMS。

关键词：横纹肌肉瘤，扩增，移位，microRNA，MYCN公司

介绍

横纹肌肉瘤（RMS）是一个儿童软组织癌家族，起源于与骨骼肌谱系相关的间充质细胞(1). 有两种主要的组织学亚型：胚胎型（ERMS）和肺泡型（ARMS）。与ERMS亚型相比，ARMS通常起源于四肢，具有早期转移、治疗反应差和复发频繁的特点。

细胞遗传学分析表明，ARMS与ERMS和其他儿童实体瘤具有明显的基因特征(1). A2；13染色体易位是最常见的发现，然而，变异1；13易位发生在较小的ARMS病例中。这些易位产生PAX3-氧气1和PAX7-FOXO1系列融合基因分别编码具有致癌活性的新型融合转录因子。分子遗传学分析显示，55%、23%和22%的ARMS肿瘤具有以下特征：PAX3-氧代1-积极的，PAX7-FOXO1系列-阳性或融合阴性(2).

尽管成对盒和叉头转录因子家族成员之间的融合与ARMS发病机制有关，但越来越多的证据表明，融合蛋白不足以促进肿瘤的发生(三). 许多ARMS肿瘤的初始全基因组筛查表明基因扩增的频繁发生(4–6)直接增加癌基因拷贝数和表达的策略。我们假设这些扩增事件与ARMS肿瘤发生协同模型中的基因融合相互作用，并将为临床管理提供有用的标记。我们实验室最近使用寡核苷酸阵列对来自2p24和12q13-q14染色体区域的扩增子进行的研究(7). 我们的研究发现，2p24扩增子优先出现在第3页-和PAX7-FOXO1系列-ARMS阳性病例（每例约20%），而12q13-q14扩增子优先出现在PAX3-氧气1-阳性病例（~25%）。在临床结果分析中，这个12q13-q14扩增子确定了一个预后较差的亚群PAX3-氧气1-ARMS阳性，而2p24扩增子与临床结果无关。

ARMS中的其他扩增区域以前定位于染色体区域1p36、2q34-qter、13q14和13q31(5,6). 在本报告中，我们重点关注13q31扩增子并分析儿童肿瘤组（COG）的ARMS肿瘤。特别是，我们使用寡核苷酸阵列定位扩增区域，然后从相应的遗传图谱中识别相关基因。用基于DNA的分析评估许多肿瘤的扩增状态，然后应用基于RNA的分析将拷贝数发现与这些肿瘤中靶基因的表达状态相关联。最后，通过比较拷贝数和表达结果与病理、分子和临床数据，确定扩增和靶基因表达的临床意义。

材料和方法

肿瘤病例

如前所述，冷冻组织样本来自COG软组织肉瘤（STS）肿瘤库(7). 所有样本均由隶属于COG STS委员会的病理学家进行审查，使用当前诊断ARMS的标准，包括存在超过50%的肺泡组织学。融合状态通过几种RT-PCR协议之一进行测量(8,9).

在本研究的123份ARMS样本中，86份样本来自于组间横纹肌肉瘤研究（IRS）组或COG STS临床试验中登记的患者。这些病例分布在以下试验中：IRS IV（n=23）、IRS V pilot（n=3）、D9501（n=4）、D952（n=2）、D 9602（n=四）、D9802（n=10）和D9803（n=40）。86名患者中的6名随后被确定为不符合这些试验的资格；两例患者不符合试验的病理或临床标准，两例患者没有足够的分期，其余两例没有信息。由于这些不合格患者的临床数据可用，因此他们被纳入临床相关研究。

从这些病例中提取的各种试验具有类似的化疗对照组，具有可比较的结果。此外，与控制臂相比，实验臂没有显示出不同的结果。因此，有理由在本研究中合并研究人群进行结果分析。

DNA制备和微阵列分析

按照制造商的说明，使用QIAamp DNA Mini Kit（加利福尼亚州巴伦西亚，齐亚根）提取基因组DNA。量化后，在Affymetrix基因芯片人类图谱50K上分析DNAXba公司按照制造商的指示，I 100K Mapping Panel阵列（Affymetrix，Santa Clara，CA）。所有分析都是在宾夕法尼亚大学的微阵列核心设施中进行的。为了进一步确定13q31扩增的最小区域，在Affymetrix GeneChip Human 250K上分析了选定的样本史蒂500K映射面板的I阵列。如前所述，分别使用拷贝数分析工具（Affymetrix）和拷贝数工作流（Partek Genomics Suite，St.Louis，MO）分析50K和250K寡核苷酸阵列的数据(7).

荧光就地杂交（FISH）

间期FISH是在由速冻或OCT包埋肿瘤样品制成的触摸印记上进行的。BAC探头（CTD-2058L20）包含MIR17HG型染色体区域13q31-13q32的基因使用Nick Translation Kit（雅培分子；雅培公园，伊利诺伊州）用SpectrumGreen-dUTP直接标记。这个MIR17HG型-将含有的探针与LSI13（Abbott Molecular；Abbott Park，IL）Spectrum橙色标记的控制探针杂交，该控制探针在染色体13q14处对RB1基因具有特异性。用DAPI II复染法（雅培分子；雅培公园，伊利诺伊州）对每个探针至少100个间期细胞进行计数，扩增被定义为大于或等于5的测试与控制比率。用该探针在放大的细胞中观察到典型的>10个信号。

定量RT-PCR

按照制造商的说明，使用RNA STAT-60（德克萨斯州Friendswood的Tel-Test）从原发性肿瘤中分离出RNA。如前所述，在123例患者中，121例患者的融合状态已经确定(7). 123例患者中108例的RNA可用于基因表达研究，且质量充足；这108份样本中有79份来自IRS或COG STS临床试验登记的患者，包括上述5例不合格病例。定量逆转录（qRT）-PCR是按照制造商的指示，使用primer Express软件设计的引物探针集或预先制作的ABI分析（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）进行的。使用ABI Prism 7900序列检测系统（应用生物系统）进行扩增和分析。当使用预先制作的ABI分析筛选主要miRNA（pri-miRNA）转录物时，18S rRNA被分析为内部控制基因，以确保cDNA的等效输入。相反，RNU48是用于确定成熟miRNA表达的相应控制基因。

统计分析

为了确定统计显著性，使用非配对Student t检验分析了两组的平均数据。为了确定两组以上变量的统计显著性，采用单向方差分析方法，由SPSS第12版（SPSS Science Inc）进行Scheffe的事后检验比较。为了确定两个多组变量的统计显著性，使用双向ANOVA方法，通过SigmaStat软件2.033版（SPSS Science Inc.）进行Neuman-Keul的事后比较。融合状态和扩增之间的关系通过Fisher精确检验和Bonferroni事后比较进行了检验，比较采用SAS 9.2版软件（SAS Institute，Inc.）。对于所有测试，均数差异的显著性在整体0.05水平上被接受，并且在适当的情况下，对与Bonferroni方法的多次比较进行了修正。为了检查miRNA簇每个成员之间的表达关系，对log2转换数据进行Pearson相关分析，并使用SAS 9.2软件进行分析。

为了进行生存分析，绘制了多组变量的Kaplan-Meier曲线，并使用非参数log-rank统计来评估组间结果的显著性。进一步拟合Cox比例风险模型，以评估单变量和多变量生存分析中有趣变量与结果的关联。当变量之间的交互作用表现出显著性时，通过从完整模型的方差-方差矩阵中提取信息来计算置信区间。这样，估计将比子集分析中的估计更准确（将数据分为子集并分别建模）。

结果

ARMS肿瘤13q31扩增子的微阵列分析

在之前的报告中，我们对57例ARMS肿瘤进行了拷贝数分析，包括31例PAX3-氧气1-正，9PAX7-FOXO1系列-50K寡核苷酸阵列上的阳性、16个融合阴性和1个不确定融合状态(7). 在目前的研究中，我们正在跟进之前的一份来自13q31染色体区域的重复扩增子的比较基因组杂交研究报告(6). 在57例ARMS病例中，我们还发现8例病例存在复发性13q31扩增事件，包括1PAX3-氧气1-阳性，1个融合阴性，6个PAX7-FOXO1系列-阳性病例。

为了定位13q31扩增的最小共同区域，我们确定了每个扩增肿瘤中的13q31放大子端点。通过比较这些端点，我们最初将最小公共扩增区定位为0.55Mb片段(图1). 为了进一步描绘最小共同扩增区，我们分析了在高密度250K寡核苷酸阵列上选择的五个扩增病例。因此，这些扩增病例之间共享的最小重叠扩增子减少到0.15Mb。将该区间与人类基因组图（NCBI Build 36.2）进行比较后发现，最小共同扩增区包含两个基因，MIR17HG型和肽基脯氨酸异构酶假基因，LOC390419号重要的是，miR-17-92小RNA簇（miRNA）位于MIR17HG型(10)并且以前在造血和上皮性恶性肿瘤中都与肿瘤的发展有关(11,12). 之前的一份出版物建议通用程序5是13q31扩增子的关键靶点，并提供了一种相容的前致癌功能的证据，在该功能中，蛋白质产物增强了成纤维细胞生长因子的信号传导，以刺激细胞增殖(13). 然而，目前的测绘数据清楚地表明通用程序5仅在一小部分ARMS肿瘤中使用此扩增子（8个肿瘤中的1个）进行完全扩增，并且不包含在13q31扩增的最小区域内。

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基因组13q31位点最小共同扩增区的定位

灰色矩形表示使用Affymetrix GeneChip 50K阵列在每个肿瘤中测量的放大程度。点画垂直条表示基于使用50K阵列的初始映射数据的最小公共放大区域。对角矩形表示使用Affymetrix GeneChip 250K阵列在选定的一组肿瘤中进一步定位扩增子。黑色竖线表示基于此更详细的映射分析的最小公共放大区域的最终定位。在顶部，根据人类基因图的NCBI Build 36.2显示了13q31区域中存在的基因，在底部，显示了相应基因组位置的比例（以兆碱基为单位）。

ARMS肿瘤13q31扩增的FISH研究

为了扩展这些发现，我们确定了一个对应于最小共同扩增区的BAC克隆，并将该克隆用作探针，结合来自13q14区域的对照探针，通过FISH分析量化13q31染色体区域的拷贝数。我们最初集中于对拷贝数数组分析的57个案例。与微阵列结果一致，该FISH分析发现13q31在所有ARMS肿瘤中扩增，其中13q31扩增子如上所述。此外，通过FISH分析还发现了另外两例13q31扩增的病例。一例仅在一小部分（22%）细胞中显示扩增，因此FISH分析的灵敏度提高可能解释假阴性阵列结果。然而，在第二种情况下，FISH分析检测到53%的细胞扩增，因此阵列和FISH的分析不一致的原因尚不清楚。

我们随后通过FISH分析了66例其他所有融合类型的ARMS病例。总的来说，我们在123例病例中的28例（23%）中发现了13q31扩增，包括22/33PAX7-FOXO1系列（67%），4/50PAX3-氧气18例（8%），2/38例融合阴性（5%）。通过Fisher精确显著性检验，我们发现融合状态与13q31扩增之间存在显著相关性（p<0.0001）。此外，在PAX7-FOXO1系列融合阴性组（p<0.0001）和PAX3-氧气1组（p<0.0001）。融合阴性和PAX3-氧气1组（p=1.0）。将所有p值与Bonferroni调整后的α水平进行比较，即0.05/3=0.017。

miR-17-92簇在13q31-扩增ARMS肿瘤中的表达研究

基于一个功能基因的发现(MIR17HG型)在最小共同扩增区，我们用可用的RNA探索了108例ARMS肿瘤中基因产物的表达。MIR17HG型编码包含7kb的扩展初级转录物（pri-miRNA）(10). 如上所述，miR-17-92簇位于该基因的第三内含子内，一系列的加工事件导致六个功能成熟的18-22核苷酸miRNA从MIR17HG型pri-miRNA。为了确定13q31扩增是否导致MIR17HG型通过qRT-PCR检测ARMS肿瘤中该物种的丰度。结果表明MIR17HG型与没有13q31扩增的ARMS病例相比，13q31放大的ARMS患者增加了1.9倍（p=0.004，图2A). 如下文详细讨论的，有一部分未扩增的病例具有pri-miRNA的高表达。然而，这些数据表明，增加的基因组拷贝数MIR17HG型该基因通常和ARMS肿瘤中相应的pri-miRNA的高表达有关。

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miR-17-92在13q31-扩增和非扩增ARMS肿瘤中的表达

（A） 通过qRT-PCR测定所有扩增和非扩增ARMS肿瘤中MIR17HG pri-miRNA的表达，并对18S rRNA进行归一化。MIR17HG pri-mi RNA表达的分布以方框图和Whisker图表示。将方框分为两部分的水平线表示中间值。方框的上下边缘表示25第个和75第个百分位数和线段表示下限和上限，异常值除外。使用t检验比较两组之间的表达，并显示相应的p值。（B） 通过qRT-PCR测量指定亚群中miR-20a的表达，并对RNU48的表达进行标准化。使用单向Anova和Scheffe事后检验比较子集之间的表达，并显示相应的p值。（C） 通过qRT-PCR测定指定亚群中miR-18a的表达，并对RNU48表达进行归一化。数据按照B部分进行分析。缩写：7F-PAX7-FOXO1系列; 第三层-PAX3-氧气1; FN融合阴性；放大器；NA-未放大。

当六个成熟的miRNA从MIR17HG型pri-miRNA，我们接下来通过qRT-PCR评估108例ARMS肿瘤中单个成熟miRNA的表达。对于没有13q31扩增的病例，所有六个miRNA的表达水平均显示出高度相关性；皮尔逊相关系数在0.74至0.91之间(补充表1). 除miR-18a外，所有miRNA的13q31-扩增病例都保持了这种高度相关性，这表明与其他miRNA的相关性较差（即皮尔逊相关系数在0.16到0.47之间）。这些发现提供了一种中央调控机制的证据，该机制可确保miR-17-92簇的单个成员在肿瘤中的可比表达。13q31-扩增肿瘤中miR-18a的这种调节机制明显被破坏。

为了确定13q31扩增是否导致miR-17-92簇成熟miRNA的高表达，我们比较了扩增和非扩增情况下的表达水平。我们发现六种成熟miRNA中有五种（miR-17、miR-19a、miR-19 b、miR-20a和miR-92a）的扩增与过度表达相关。如miR-20a所示，13q31扩增的病例其丰度显著高于未扩增的病例（p<0.001）。此外，miR-20a的表达在PAX7-FOXO1系列-13q31扩增阳性肿瘤（n=16）PAX7-FOXO1系列-没有13q31扩增的阳性肿瘤（n=10，p=0.006）以及未扩增的肿瘤PAX3-氧气1-阳性肿瘤（n=42，p=0.010）和非扩增融合阴性ARMS肿瘤（n=34，p<0.001）(图2B). 将这些p值与Bonferroni调整后的α水平进行比较，即0.05/3=0.017。然而，还应注意，13q31-放大PAX7-FOXO1系列-阳性病例包括不表达高miR-20a水平的子集。在miR-17、miR-19a、miR-9b和miR-92a中观察到类似的趋势(补充图1). 由于13q31扩增导致miRNA过度表达，13q31中miRNA表达增加PAX7-氧代1-阳性亚群的变化范围为1.6-3.2倍。值得注意的是PAX3-氧气1-阳性和融合阴性病例导致这些亚群中扩增和非扩增肿瘤之间miRNA表达的比较缺乏统计显著性差异，且置信度相对较低。与前五个miRNA相比，miR-18a的分析没有揭示任何扩增和非扩增亚群之间的明显表达差异(图2C).

对ARMS肿瘤中miR-17-92簇的单个miRNA的分析显示，在多个病例中，没有13q31扩增的肿瘤表达高水平的miRNA。我们选择了13q31-扩增的miRNA表达的中值PAX7-FOXO1系列-阳性病例作为衡量ARMS肿瘤中miR-17-92丰度的指标，然后询问非扩增肿瘤中是否有5个miRNA中至少3个在扩增病例中过度表达的病例表达这种高水平。根据这些标准，42人中有7人（17%）未放大PAX3-氧气1-阳性病例，1/10（0%）未扩增PAX7-FOXO1系列-阳性病例和34例（6%）非扩增融合阴性ARMS中的2例，或86例非扩增ARMS中9例（10%）表达高miR-17-92水平。这些发现与先前发表的数据一致，这些数据表明在一些缺乏13q31扩增子的ARMS细胞系中miR-17-92高表达，并表明存在独立于13q31放大的成熟miRNA表达上调的替代机制(14).

的角色MYCN公司扩增和过度表达

约20%融合阳性ARMS肿瘤中存在2p24染色体区域的扩增，通常导致MYCN公司，编码与MIR17HG型转录调控(15). 基于此信息，我们研究了miR-17-92是否在MYCN公司-依赖性方式作为上调ARMS中miRNA簇的另一种机制。对于6个miRNA中的每一个，我们使用双向方差分析来比较13q31-未扩增病例（n=5）和（n=41）MYCN公司扩增/过表达，以及控制PAX3-氧气1-和PAX7-FOXO1系列-阳性融合亚型。尽管扩增/过表达组中每个miRNA的中位数表达水平始终高于非扩增组中的水平(补充图2)，这一增长没有达到统计显著性。在一个三元方差分析中，添加一个额外的因子来控制六个miRNA之间的差异，比较13q31-未扩增病例（n=5）和（n=41）MYCN公司扩增/过度表达仍不显著（p=0.14）。我们将这种统计意义的缺乏至少部分归因于MYCN公司-可用于分析的扩增/过度表达病例以及大量非-MYCN公司-假设由于其他机制导致这些miRNA过度表达的扩增病例。

13q31扩增和miR-17-92表达与临床结果的关系

为了研究与临床特征的相关性，将86例ARMS患者的13q31扩增数据与相关临床参数进行了比较，这些患者有可用的临床数据（18例扩增，68例非扩增）(补充表2). 最显著的相关性是肢体13q31扩增肿瘤的发生率增加，13q31放大肿瘤的侵袭性降低。这些相关性以前在PAX7-FKHR阳性肿瘤中已被发现(2)，其中主要发生13q31扩增。

接下来，我们研究了与结果数据的关联，使用Kaplan-Meier方法估计生存分布，使用log-rank检验通过扩增状态比较生存分布。在总生存率和无失败生存率方面，扩增病例的结果在数量上优于非扩增病例(图3A-B). 13q31扩增状态下的总生存率存在显著差异（p=0.013），而无缺陷生存率只有显著趋势（p=0.085）。在随后的多变量分析中，调整年龄、性别、组、淋巴结状态、原发部位和肿瘤大小后，13q31扩增状态是总生存率的一个重要独立预测因子（p=0.026，HR=0.24，95%CI:0.07-0.87）(表1). 类似的多变量分析也高度提示13q31扩增对无故障生存期的独立预测作用（p=0.06，HR=0.4，95%CI:0.16–1.04）。

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13q31扩增对ARMS患者预后的影响

所有ARMS患者13q31扩增前后总生存率（A）或无失败生存率（B）的比较。放大，n=18；非放大，n=68。放大和非放大病例的结果分别用虚线和实线表示。

表1

Cox比例风险模型从临床、病理和分子预测因子预测无故障生存期。

预测器级别无故障生存总体生存率
危险比
（95%置信区间）		P值危险比
（95%置信区间）		P值
年龄（续，年）*1.03 (0.96, 1.1)0.491.04 (0.97, 1.13)0.28
性别男性（右）**-（右）-
女性0.47 (0.23, 0.95)0.0340.66（0.31，1.4）0.28
组1,2,3（右）-（右）-
43.03 (1.51, 6.08)0.00182.94 (1.36, 6.38)0.0063
节点状态0（右）-（RL）-
11 (0.52, 1.96)0.991.12 (0.53, 2.36)0.76
主要站点0（右）-（右）-
10.51 (0.25, 1.03)0.0610.58（0.26，1.28）0.18
肿瘤大小<=5厘米（RL）-（右）-
>5厘米1.46 (0.7, 3.03)0.312.03 (0.83, 4.95)0.12
13季度31不（右）-（右）-
放大是的0.4 (0.16, 1.04)0.060.24 (0.07, 0.84)0.026
*连续年，
**参考水平

接下来我们分析了miRNA表达与预后的关系。在79例有可用RNA和临床数据的ARMS患者中，我们使用Cox比例风险模型来研究每个miRNA的表达与结果的相关性，但没有发现任何显著的相关性。在下一步中，我们模拟了miRNA表达和扩增状态在预测结果中的交互作用(表2a). 在该分析中，miR-19a与13q31扩增状态在预测无故障生存期（但不是总生存期）方面存在显著交互作用，另外三种miRNA（miR-17、miR-19b和miR-92a）趋于显著。这些结果表明，与这些miRNA的表达变化相关的扩增和非扩增病例之间的无故障存活率存在显著差异。此外，扩增病例的风险比明显大于miR-17、miR-19a、miR-9b、miR-20a和miR-92a的风险比，范围从miR-92的3.5到miR-17的15.0。因此，与仅扩增结果的改善相比，在扩增病例中这些miRNA的高表达会导致显著的不良结果。相比之下，非放大病例的危险比接近1，并且在统计上不显著。这一结果表明，miR-17-92的高表达与结果的差异有关，但仅在13q31扩增的ARMS病例中。

表2

Cox比例风险模型预测miRNA表达的无故障存活率。

A.在调整临床和病理因素的影响之前（年龄和性别是进行调整的唯一混杂因素）。
微小RNA95%置信区间的危险比*相互作用的P值**
放大的非简化
miR-17a型15.03 (1.62, 139.64)1.79 (0.59, 5.39)0.085
miR-18a75.11 (0.08, 7.06 × 104)0.62 (0.23, 1.68)0.18
miR-19a型5.89（1.29，26.88）0.97 (0.39, 2.4)0.047
miR-19b型4.84 (1.35, 17.35)1 (0.34, 2.93)0.067
miR-20a型3.9 (1.08, 14.02)1.18 (0.46, 3.04)0.15
miR-92型3.52 (1.08, 11.4)0.87 (0.34, 2.23)0.078
B.调整临床和病理因素的影响后。
微小RNA95%置信区间的危险比*相互作用的P值**
放大的非简化
miR-17a型10.24 (1.04, 100.97)0.6 (0.16, 2.21)0.029
miR-18a131.26（0.04，4.21×105)0.18 (0.06, 0.58)0.12
miR-19a型4.32 (0.83, 22.41)0.33 (0.12, 0.95)0.0097
miR-19b型3.88 (0.98, 15.41)0.36 (0.1, 1.26)0.014
miR-20a型3.77 (0.89, 16.02)0.39 (0.13, 1.17)0.018
miR-92型2.97 (0.8, 11)0.38 (0.14, 1.08)0.019
*按13q31扩增状态分层的危险比。
**扩增组和非扩增组miRNA效应差异的p值。

为了确定这些参数是否独立于其他标准预后预测因素，对模型进行了年龄、性别、组、淋巴结状态、原发部位和肿瘤大小的调整。进行这些调整后，miR-17-92簇中6个miRNA中的5个miRNA（miR-17、miR-19a、miR-17b、miR-20a和miR-92）的扩增和miRNA表达之间的相互作用具有统计意义(表2b). 在这项分析中，唯一表现不同的miRNA是miR-18a，这与它没有被MIR17HG型放大。这五种miRNA在13q31-扩增病例中的风险比仍然很高，范围从3.0到10.2，miR-17a仍然显示出显著增加的风险比的统计证据（HR=10.2，95%CI:1.04-100.97）。多元分析的一个新发现是，在非扩增病例中，所有六种miRNA的风险比都降低了。在这些非扩增病例中，危险比在0.18至0.6之间，对于两种miRNA，即miR-18a和miR-19a，有统计证据表明危险比显著降低。这种效应是扩增和miRNA表达之间相互作用的第二个因素，并表明与13q31-扩增病例相比，非扩增病例中miR-17-92表达增加可能与预后改善有关。

为了进一步研究这些问题，我们重点关注PAX7-FOXO1系列-阳性病例，其中大多数MIR17HG型放大发生。在有可用RNA和随访数据的21例患者中，有11例2年内失败（5例扩增，6例非扩增），9例随访至少2年未失败（5个扩增，4个非扩增）和1例未失败，随访不到2年的患者被排除在分析之外。我们首先关注miRNA在10PAX7-FOXO1系列-阳性病例MIR17HG型放大。使用t检验比较失败和非失败结果组的miRNA表达，失败组与非失败组相比，miR-17、miR-19a、miR-9b、miR-20a和miR-92的表达明显更高(图4a). 这五个miRNA组之间的平均表达增加幅度为1.96到2.53倍，相应的p值为0.011到0.0014。如上所述的分析中发现，miR-18a与其他五种miRNA不同，两组之间的表达差异较小，无统计学意义（p=0.33）。这些发现支持这样一个前提，即miR-17-92簇的高表达与13q31扩增病例的不良预后相关。

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结果与miR-17-92表达和13q31扩增的关系

答：。miRNA表达与13q31扩增和结果状态的比较。病例分为两年内失败的病例（F）和两年以上没有失败证据的病例（NF）。一例无失败证据且随访不到2年的病例被排除在分析之外。此外，病例还分为有13q31扩增证据（Amp）和无13q31放大证据（NA）的病例。通过qRT-PCR测量指定亚群中每个miRNA的表达，并对RNU48表达进行标准化。t检验用于比较每对相关亚群之间的表达，并显示每个miRNA的相应p值。B类miR-17-92表达状态和13q31扩增状态对无缺陷存活率的影响。根据A部分的数据，miR-17a表达在低表达和高表达之间的截止水平被选择为0.8。PAX7-FOXO1系列-ARMS阳性病例分为三个亚群：13q31-amplified和miR-17a高表达，n=6；13q31扩增且miR-17a低表达，n＝5；非扩增和miR-17a低表达，n=10。PAX3-氧代1-ARMS阳性病例分为两个亚群：13q31-amplified和miR-17a低表达，n=6；非扩增和miR-17a低表达，n=26。

接下来，我们考虑了非扩增PAX7-FKHR阳性病例中单个miRNA的表达水平。在分析10个非放大PAX7-FOXO1系列-阳性病例中，与未失败组相比，失败组miR-17-92簇中所有六个miRNA的平均miRNA表达量增加了1.10到1.73倍(图4a). 与扩增病例相比，在非扩增病例中，六种miRNA中任何一种的miRNA表达差异均未达到统计学意义。然而，值得注意的是，对于除miR-18a外的所有miRNA，这些非扩增组的miRNA表达低于失败/扩增组的表达水平。与非扩增PAX7-FKHR病例中的发现类似，28例非扩增PAX中6种miRNA表达的比较PAX3-氧气1-有足够随访数据的阳性病例在失败（n=21）和非失败（n=7）亚组之间也没有显示出任何显著差异。这些发现突出表明，与miR-17-92高表达相关的不良结果仅限于13q31扩增病例。此外，值得注意的是，如果不控制多个临床参数（如多变量分析中所做的），我们不太可能在非扩增病例中看到与miR-17-92表达增加相关的改善结果。事实上，这个结果与我们在表2a（即，在调整临床和病理因素的影响之前）。

最后，我们使用前面分析中的信息来构建Kaplan-Meier曲线(图4b). 基于我们对失败和非失败13q31-扩增PAX7-FOXO1-阳性病例的比较(图4a)，我们选择miR-17a表达水平为0.8作为低表达组和高表达组的分界点。作为对照组，非放大PAX7-氧代1-阳性病例均为低表达，有中间结果。13q31扩增在PAX7-FOXO1系列-miR-17a表达低的阳性病例与非常好的结果相关。相反，当13q31放大时PAX7-FOXO1系列-阳性病例miR-17a表达高，预后差。与这些发现相反PAX7-FOXO1系列-阳性病例中，未扩增PAX3-FOXO1阳性病例的低表达亚群和高表达亚群之间的结果无显著差异，而用于分析的13q31-扩增PAX3_FOXO1-阳性病例太少。因此，这些发现突出了与13q31扩增和miR-17-92过度表达相关的不同结果。现在需要进一步研究，以将此分析扩展到独立和更大的ARMS案例集。

讨论

我们研究了广泛的ARMS肿瘤中13q31染色体区域的扩增。虽然先前对这种扩增子的研究表明GPC5基因编码细胞表面糖蛋白的基因是13q31扩增的一致靶点(13)，我们提供的数据定义了一个最小的共同扩增区域，该区域排除了通用程序5基因，并且始终包含MIR17HG型基因，编码多囊性miRNA簇miR-17-92。我们的研究结果表明，13q31扩增常常提高原发性ARMS肿瘤中miR-17-92簇的表达。我们还提供了缺乏13q31扩增的ARMS肿瘤队列中miR-17-92诱导的证据。这些数据表明，多种机制MIR17HG型miR-17-92在ARMS中的过度表达与拷贝数相关和拷贝数无关。

已经出现了一种模型，其中一些癌症中的扩增或其他功能获得性改变涉及一个编码miRNA的基因，其靶点是肿瘤抑制因子(16). 这种变化导致miRNA表达增加，相应的肿瘤抑制因子表达减少。支持此模型的一个主要示例是MIR17HG型以前在弥漫性大B细胞淋巴瘤和小细胞肺癌中发现的扩增(11,12)与我们研究中的发现类似，这些先前的研究也发现了miR-17-92表达增加的非扩增病例，表明了miR-17-92过度表达的其他机制。此外，拷贝数无关的miR-17-92在许多其他肿瘤中过度表达(17,18). 根据一般模型，各种肿瘤抑制因子被确定为miR-17-92靶点，包括促凋亡蛋白Bim、细胞周期素依赖性激酶抑制剂p21和RB相关细胞周期调节因子p130(15,19).

其他miR-17-92靶点在调节miR-17-82表达的反馈途径中发挥作用。E2F转录因子是miR-17和miR-20a的靶点，因此E2F表达的减少导致MIR17HG型转录以及减少MYC公司转录和进一步MIR17HG型下调监管(20,21). 最近的研究还表明，miR-17和miR-20a靶向细胞周期蛋白D1的第二个调节环，细胞周期蛋白D1通过该调节环调节miR-17-92的表达(22). 这些反馈回路与本研究相关，为以下变量miR-17-92的表达提供了潜在的解释MIR17HG型放大。这些肿瘤中的其他因素也可能影响反馈调节，并进一步促进在MIR17HG型-肿瘤放大。

正如我们之前对12q13-q14扩增的研究一样，在ARMS中13q31扩增和融合状态有着密切的联系。特别是，我们发现13q31的扩增在PAX7-FOXO1系列-阳性肿瘤。一种可能的解释是，这些miRNA的生物学特性与PAX7-FOXO1系列-阳性ARMS肿瘤细胞。然而，我们也注意到，13号染色体上另一个位点的扩增发生率也很高FOXO1系列的一部分PAX7-氧代1融合基因(23). 这个FOXO1系列13q14和MIR17HG型13q31位点位于13号染色体上，相距约50 Mb。我们推测FOXO1系列该位点可能导致涉及13号染色体的链断裂，并增加13号染色体上不同位点发生额外扩增事件的可能性。

我们注意到miR-18a在这些13q31-扩增的ARMS肿瘤中的独特表达特征。虽然增加了MIR17HG型拷贝数导致miR-17-92簇中其他miRNA的过度表达，与没有13q31扩增的肿瘤相比，miR-18a的表达没有显著变化。这一发现可能部分与miR-18a生物发生中核糖核蛋白hnRNP A1的需求有关(24). 因此，我们的研究结果表明，hnRNP A1水平可能由于13q31扩增而受到限制，可能是因为该蛋白与该染色体区域的其他高亲和力位点结合。

本研究的一个引人注目的方面是，在miR-17-92高表达的13q31-扩增病例中发现不良临床结果，而在miR-17-92低表达的13q31-扩增患者和miR-17-92高表达的非扩增患者中发现良好临床结果。第一个问题是比较13q31扩增病例中miR-17-92的高表达与未扩增13q31病例中miR-17-92高表达。第一个重要的考虑因素是13q31-扩增病例中没有miR-18a过度表达。由于KRAS是miR-18a的既定靶点，因此在这些扩增的病例中miR-18a-上调的缺失可能是致癌的，因此这种癌蛋白的表达不会因MIR17HG型放大(25). 作为第二种可能性，我们考虑了附近的其他13q31基因是否可能被共扩增，但在13q13扩增的miR-17-92高表达病例中没有发现任何一致的共扩增基因。作为第三个考虑因素，我们注意到，miR-17-92高表达的13q31-扩增病例几乎都是PAX7-FOXO1系列共扩增。如上所述PAX7-FOXO1系列-阳性病例通常有良好的临床结果(2)，此结果与PAX7-FOXO1系列放大（Barr等人，未发表的观察结果）。我们假设有那么高PAX7-FOXO1系列表达导致表达抑制肿瘤行为某些方面或促进治疗反应的产物，从而导致良好的结果。在高表达miR-17-92的13q31-扩增病例中，预后不佳可能是因为miR-17-82簇的miRNA靶向这些肿瘤抑制蛋白或治疗反应蛋白，降低表达或逆转活性，从而改变了一部分患者的预后PAX7-FOXO1系列-ARMS阳性病例。

最后，我们考虑了在低miR-17-92表达的13q31-扩增病例子集中改善预后的分子基础。主要关注PAX7-氧代1-阳性病例，我们必须解释低miR-17-92表达的13q31-扩增和非扩增病例之间的差异。由于这两个类别通常都有一个放大PAX7-FOXO1系列miR-17-92簇（包括miR-18a）的miRNA的融合和可比较的低水平，我们假设13q31产物而非miR-17-82簇可能是导致这种表型的原因。由于我们将最小公共放大区域定位为0.15Mb区域，其中包含MIR17HG型基因和假基因(LOC390419号)，一种可能的考虑是在这个最小的共同区域中有功能单位，例如编码其他小RNA的基因。第二种可能性是，具有低miR-17-92表达的13q31-扩增病例可能构成一个更大的扩增子，该扩增子包含除MIR17HG型随着更多病例的积累，可以通过进一步的基因组分析来探索这些可能性。最后，我们必须承认，所有这些临床差异都是基于相对较少的病例，必须在独立的病例系列中进行验证，以验证这些发现的再现性。

总之，这项研究确定了ARMS病例的不同子集，这些子集由MIR17HG型基因和相关miR-17-92簇。在一个子集中PAX7-FOXO1系列案例MIR17HG型当miR-17-92簇的miRNA高水平表达时，基因被扩增并预测结果不佳。在第二个子集中PAX3-氧代1例中，miR-17-92簇被一个与拷贝数无关的过程过度表达，并且多变量分析表明结果有所改善。在第三个亚群中，主要是PAX7-FOXO1-阳性病例MIR17HG型当miR-17-92簇在低水平表达时，该基因及其附近的13q31区域被扩增并预测了良好的结果。未来的研究将确定与miR-17-92表达和13q31扩增状态相关的预后不良和良好的分子基础，并将确定这些miRNA作为这些ARMS亚群的治疗靶点的潜在效用。由于缺乏用于下游靶基因和相关致癌表型研究的13q31-扩增PAX7-FOXO1-阳性ARMS细胞系，这些未来的研究变得复杂。因此，必须开发和验证工程模型系统，以进一步研究这些放大情况下的功能问题。

翻译相关性陈述

本研究建立了MIR17HG型作为儿童软组织癌肺泡横纹肌肉瘤（ARMS）新标记物的miR-17-92小RNA簇的位点和相关过表达。这种放大事件发生在大多数PAX7-FOXO1系列-阳性病例，但仅限于PAX3-氧代1-阳性和融合阴性ARMS病例。miR-17-92高或低水平表达的发现MIR17HG型扩增分别预示着不良或良好的结果。此外，miR-17-92的表达和MIR17HG的扩增提供了新的预后标志物PAX7-FOXO1系列-阳性分类，与其他预后标志物无关。在目前的治疗方案中，这些标记物将更好地将这些ARMS患者分为中等和高风险类别。未来，miR-17-92簇可能会成为一个新的靶点，用于使用特异性拮抗这些microRNA的表达和/或功能的药物进行治疗。

补充材料

1

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2

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三

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脚注

*支持单位：NIH授予R01 CA104896、U10 CA098543、U10 CA 098413和U24 CA114766；哈特维尔基金会；亚历克斯柠檬水站基金会；和肺泡横纹肌肉瘤研究基金。组织样本由合作人类组织网络的儿科部提供，该网络由NIH拨款U01 CA054021资助。

工具书类

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