大约一个世纪前，维生素A被认为是食品中的一种基本成分(1,2)从那时起，人们积累了大量关于其生物功能的知识。通常认为，亲本维生素A分子视黄醇（ROH）通过活性代谢物发挥作用：11-顺式-介导光传导的视网膜和通过激活特定核受体调节基因转录的视黄酸(三,4). ROH在体内的主要储存库是肝脏，维生素是由这个组织分泌出来的，该组织与21-KDa多肽结合，称为“血清视黄醇结合蛋白”（RBP）(5). 与RBP结合使难溶性维生素在血浆中循环，但视黄醇在进入细胞前从蛋白质中游离。有趣的是，据报道，肥胖小鼠和人类的血清RBP水平显著升高，高血清RBP水平会导致胰岛素抵抗(6). RBP如何抑制胰岛素信号传导以及这种活性是否与作为视黄醇载体的蛋白质的功能有关尚不清楚。
最近有报道称，一种称为“维甲酸6刺激”的完整质膜蛋白（STRA6）介导RBP向细胞摄取ROH(7). 人类STRA6基因突变导致胚胎发育缺陷，导致多发畸形，统称为“马太-伍德综合征”(8,9). 有趣的是，STRA6中一个已知的致病突变T644M位于蛋白质的细胞溶质C末端，该序列可识别为SH2结构域结合基序(8). 这种含有磷酸酪氨酸的基序通常被细胞因子受体用作转录因子STAT的对接位点。同源细胞外配体与细胞因子受体的结合触发酪氨酸磷酸化，导致STAT的招募及其激活Janus激酶（JAKs）。因此，这些受体传播信号级联，最终将STAT动员到细胞核，在那里它们诱导特定靶基因的转录(10). STRA6中存在假定的SH2结构域结合基序的意义以及在发育过程中对该蛋白的关键需求的基础尚不清楚。
我们在此表明，视黄醇结合的RBP（holo-RBP）与STRA6的结合诱导STRA6磷酸化，导致JAK2和STAT5的募集和激活。我们进一步表明，由RBP-ROH启动的信号级联导致STAT靶基因表达上调，包括细胞因子信号抑制因子3（SOCS3），SOCS3抑制JAK/STAT途径介导的细胞因子信号(11,12)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ），后者控制脂肪细胞脂质稳态。观察结果表明，STRA6作为细胞因子受体，通过holo-RBP传递信号，并指出了视黄醇调节胰岛素反应的一种新模式。
结果
RBP-ROH触发STRA6磷酸化，导致JAK2和STAT5的招募和磷酸化。
利用内源性表达STRA6的HepG2肝癌细胞，研究该蛋白是否是RBP-ROH激活的信号受体。人RBP缺乏其N末端分泌信号（hRBPΔN），与循环RBP相对应(13)，表示为大肠杆菌并在ROH存在下纯化以获得holo-RBP(14) (图S1A类). 通过从全蛋白中提取ROH，获得非连接RBP（apo-RBP），并通过荧光滴定法验证其活性(15) (图S1B类). 与本地RBP相同(16)，表征重组RBP与ROH相互作用的平衡解离常数为~100nM。用STRA6表达载体转染HepG2细胞。24小时后，用预复合的RBP-ROH（1μM，对应于血清水平）处理细胞，并在不同时间点裂解。STRA6被免疫沉淀，其酪氨酸磷酸化水平通过免疫印迹评估。数据()显示RBP-ROH触发了短暂的STRA6磷酸化，在约30分钟达到峰值。然后用STRA6或STRA6表达载体转染HepG2细胞，该表达载体携带假定SH2结构域结合基序Y643F的突变，该基序缺乏酪氨酸残基，以及T644M，STRA6的YTLL SH2结构域结合基序缺乏苏氨酸残基，对应于Matthew–Wood突变。用预复合RBP-ROH处理细胞，免疫沉淀STRA6，并评估其酪氨酸磷酸化水平(). RBP-ROH增加了STRA6的酪氨酸磷酸化水平，但没有增加突变对应物的酪氨酸磷酸化水平。RBP-ROH还诱导了STRA6和STAT5之间的关联(). 与已知激活STAT5的生长激素和胰岛素一样，RBP-ROH增加了STAT5磷酸化(). ROH和RBP均无效()，确定该活性是由holo-RBP特异性发挥的，并验证其不是由重组蛋白制剂中存在的细菌污染物产生的。RBP-ROH处理没有改变STAT3或STAT1的磷酸化水平(图S1C类和D类). 与STRA6磷酸化模式类似，正如真实信号事件所预期的那样，RBP-ROH诱导的STAT5磷酸化是暂时的(). 异位过度表达STRA6增强了基础和RBP-ROH诱导的STAT5磷酸化，而STRA6-T644M突变表达则消除了这种效应(). RBP-ROH还诱导STRA6与JAK2的关联()并触发JAK2磷酸化(). STRA6过表达后，JAK2对RBP-ROH的磷酸化反应增强()降低JAK2的表达水平可抑制RBP-ROH诱导的STAT5磷酸化(图S1F类). 这些观察结果表明，RBP-ROH激活由STRA6、JAK2和STAT5介导的信号级联。
RBP-ROH诱导STRA6磷酸化，触发JAK2和STAT5的募集和激活。(A类)用携带STRA6的载体转染HepG2细胞。转染24 h后用RBP-ROH（1μM）处理细胞，并在指定时间进行裂解。对STRA6进行免疫沉淀，并对沉淀进行磷酸酪氨酸印迹。(B类)如图所示转染HepG2细胞。蛋白质的类似过度表达在(图S2A类). 用RBP-ROH（1μM；15分钟）处理细胞，STRA6-免疫沉淀，并进行磷酸酪氨酸印迹。(C类)如图所示转染HepG2细胞。如图所示，STRA6沉淀，沉淀被吸干。(D类)中条带的量化B类和C类在三个独立的实验中。(*P（P）=0.05 vs.STRA6转染的非处理细胞。）(E类) (上部)HepG2细胞按指示处理，STAT5免疫沉淀，沉淀印迹STRA6和总STAT5。(下部)在三个独立实验中对谱带进行量化。(**P（P）= 0.01.) (F类)用胰岛素（15分钟，25 nM）、生长激素（GH，500 ng）或RBP-ROH处理HepG2细胞。对裂解液进行磷酸化STAT5（pSTAT5，Y694）和总STAT5的免疫印迹。(G公司)用标记的配体（1μM；15分钟）处理HepG2细胞，并对标记蛋白的裂解产物进行印迹。(H（H）)用RBP-ROH处理细胞，并对裂解产物进行pSTAT5（pY694）和总STAT5的印迹。(我)如图所示转染细胞，并用RBP-ROH（1μM；15分钟）处理细胞，并按图所示对裂解产物进行免疫印迹。(J型)用STRA6编码载体转染HepG2细胞，用RBP-ROH处理（1μM；15分钟），裂解，免疫沉淀STRA6。对沉淀进行JAK2免疫印迹。(K（K）)如图所示转染HepG2细胞，用RBP-ROH处理（1μM；15分钟），裂解，并对pJAK2（Y1007/1008）和总JAK2进行免疫印迹。(L（左）和M（M）)用STAT反应元件驱动的荧光素酶报告子和β-半乳糖苷酶表达载体共同转染HepG2细胞。(L（左）)用指定的配体（1μM）或胰岛素（5 nM）处理细胞。25小时后裂解细胞，测量荧光素酶活性并将其归一化为β-半乳糖苷酶。（平均值±SEM*P（P）<0.02与未经处理的对照；n个= 3.) (M（M）)使用转染有指定载体的细胞进行反激活分析。用RBP-ROH处理细胞24小时，荧光素酶活性归一化为β-半乳糖苷酶。（平均值±SEM*P（P）<0.02与未经处理的对照；#P（P）与转染空载体的RBP-ROH处理细胞相比，<0.05；n个= 3.)
RBP-ROH增强STAT5的转录活性。
利用由STAT5反应元件驱动的荧光素酶报告子进行反激活分析，以检测RBP-ROH对STAT转录活性的影响。HepG2细胞经ROH、RBP、RBP-ROH或RA处理，ROH代谢产物通过激活核受体调节转录(4,17,18). 胰岛素，一种公认的STAT激活剂(19)，用作阳性对照。胰岛素和RBP-ROH诱导报告活性，但RBP、ROH和RA没有(). STRA6过度表达后激活增强()并在降低受体表达水平时被抑制(图S1H（H）). 缺乏SH2结构域结合基序的STRA6变异体（Y643F，T644M，ΔC）抑制了RBP-ROH激活STAT的能力().
通过监测两个内源性STAT靶基因的表达，进一步检查RBP-ROH激活STAT的能力：SOCS3系列(20)和PPARγ(21). RBP-ROH而非ROH或RBP上调了这两个基因的表达(和图S2B类). RA有效诱导Cyp26a细胞，RA受体RAR的靶基因，但不影响STAT靶基因的表达()证明RA在这些细胞中具有转录活性，但不参与RBP-ROH反应。除了ROH外，RBP还可以结合维生素A代谢物视网膜（RAL）和RA(16). 然而，RBP与RAL或RA的复合物并没有激活STAT()RAL也没有单独激活STAT(图S2C类). 为了检测RBP-ROH发挥活性的位置，用RBP的表达载体转染细胞，RBP以全RBP的形式分泌到培养基中，可以在细胞外发挥作用，或者用缺乏分泌信号（RBPΔN）的RBP转染细胞，RBPΔN被困在细胞中。RBP诱导SOCS3异位表达，ROH治疗进一步增强了反应。相反，在表达RBPΔN的细胞中未观察到任何影响()表明RBP-ROH通过细胞外活动激活STAT。与这些结果一致，用从体外过度表达RBP的细胞中收集的条件培养基处理HepG2细胞可诱导SOCS3，而从RBPΔN个-表达细胞没有(图S2D类). 证明STRA6在RBP-ROH转录激活中的特异性参与，降低受体的表达水平可通过RBP-ROH而不是另一种JAK/STAT激活剂IL-6抑制STAT的激活(). 此外，STRA6的过度表达增加了SOCS3的基础表达并增强了RBP-ROH反应()和PPARγ(图S3A类). 有趣的是，这些基因在缺乏SH2结构域结合基序的过度表达STRA6突变体的细胞中的表达水平低于对照细胞，表明突变体具有显性的负活性(和图S3A类). 这些突变体干扰STRA6信号传导的分子机制尚待阐明。STAT5上调SOCS3和PPARγ的过度表达(和图S3B类). 两种合成JAK抑制剂AG490和ZM449289可有效抑制IL-6上调SOCS3(图S3C类)，还废除了RBP-ROH激活STAT的能力(和图S3D类). 降低JAK2而不是JAK1的表达水平，可以抑制RBP-ROH诱导的SOCS3上调()和PPARγ(图S3E类). 总之，这些观察结果表明，RBP-ROH通过STRA6和JAK2介导的途径激活STAT5。
RBP-ROH以STRA6和JAK2介导的方式激活STAT。(A类)用指定的配体处理HepG2细胞（1μM；4 h）。用qPCR方法检测SOCS3和PPARγ。（平均值±SEM*P（P）与未处理对照组相比，<0.01；n个= 3.) (B类)用RBP-ROH或RA处理HepG2细胞（1μM；4 h）。用qPCR检测SOCS3、PPARγ和CYP26a的mRNA。（平均值±SEM*P（P）<0.02与未经处理的对照；n个= 3.) (C类)用指定的配体处理细胞（1μM；4 h）。qPCR检测SOCS3和PPARγmRNA。（平均值±SEM*P（P）与未处理对照组相比，<0.01；n个= 3.) (D类)用RBP或组氨酸标记的缺乏分泌信号的RBP表达载体转染细胞（his-RBPΔN）。用载体或ROH处理细胞（1μM；4 h），用qPCR检测SOCS3 mRNA。（平均值±SEM*P（P）与相应的未处理对照组相比，<0.01；n个= 3.) (插入)免疫印迹显示标记蛋白过度表达。(E类)如图所示转导细胞。通过qPCR验证了STRA6的下调(图S1G公司). 48小时后，用ROH、RBP、RBP-ROH（1μM）或IL-6（5 ng）处理细胞4小时。用qPCR检测SOCS3 mRNA。（平均值±SEM*P（P）与未处理对照组相比，<0.01**P（P）<0.02 vs.转染空载体的RBP-ROH处理细胞；n个= 3.) (F类)如图所示转染HepG2细胞。免疫印迹证实了类似的蛋白质过度表达(图S2A类). 用RBP-ROH（1μM；4小时）处理细胞。（平均值±SEM*P（P）与未处理对照组相比，<0.01**P（P）与转染空载体的未处理细胞相比，<0.05；#P（P）与转染空载体的RBP-ROH处理细胞相比，<0.05；n个= 3.) (G公司)如图所示转染细胞。qPCR验证过表达(图S1F类). 转染48 h后，用指定的配体（1μM；4 h）处理细胞。测量SOCS3 mRNA。（平均值±SEM*P（P）与转染空载体的未处理细胞相比，<0.05**P（P）与转染空载体的RBP-ROH处理细胞相比，<0.05；n个= 3.) (H（H）)用JAK抑制剂AG490或ZM449829（50μM）预处理细胞24 h，然后用RBP-ROH（1μM；4 h）处理细胞。测量SOCS3 mRNA。（平均值±SEM*P（P）与未处理细胞相比，<0.01；n个= 3.) (我)用空慢病毒载体或携带shRNAs的慢病毒载体转染细胞。48 h后用RBP-ROH（1μM；4 h）处理细胞。测量SOCS3 mRNA（平均值±SEM*P（P）与转染空载体的RBP-ROH处理细胞相比，<0.01；n个= 3.) (插图)免疫印迹显示JAK下调。
RBP-ROH/STRA6/STAT5通路增强甘油三酯积累并损害胰岛素反应。
脂肪细胞中还检测了RBP-ROH激活JAK/STAT通路的能力。为此，使用成熟的培养脂肪细胞模型NIH 3T3-L1。通过标准方案诱导细胞分化(22)，并通过监测脂质积累来验证分化(图S4A类)并检测脂肪细胞标记物FABP4的表达(22). 前脂肪细胞显示出极低水平的STRA6和RBP，但这两个基因在分化过程中都被显著诱导(图S5A类). 根据STRA6的表达，RBP-ROH对前脂肪细胞的影响很小(图S5B类)但有效地触发了STAT5和JAK2的磷酸化(图S5C类)上调SOCS3和PPARγ的表达(图S5D类–F类)在成熟脂肪细胞中。蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺（CHX）不抑制RBP-ROH对STAT靶基因的诱导(图S5D类和E类)，表明该活动代表了直接响应。与HepG2细胞中的行为类似，STRA6或STAT5的表达降低可阻断RBP-ROH上调脂肪细胞SOCS3和PPARγ的能力(图S5G公司和H（H）). RA不影响SOCS3的表达，进一步证明该代谢产物不参与该途径(图S5G公司).
STAT靶基因PPARγ是脂肪脂质储存的关键调节因子(23). 根据该蛋白的上调，用RBP-ROH处理脂肪细胞会增加细胞的甘油三酯积累，并以STRA6依赖的方式进行(图S5我). 这些细胞中RBP的下调降低了其脂质含量(图S6A类). 在HepG2细胞中也观察到类似的作用(图S6B类和C类). SOCS3是胰岛素受体介导的信号传导的有效抑制剂(24,25). 事实上，用RBP-ROH治疗脂肪细胞可以抑制胰岛素诱导的胰岛素受体激活，这可以通过胰岛素受体自身磷酸化和胰岛素受体下游效应物Akt1的磷酸化进行监测(26) (). 降低STRA6或STAT5的表达水平(图S4B类–D类)，这削弱了RBP-ROH诱导SOCS3的能力(和图S4F类)或降低SOCS3的表达水平(图S4E类)取消了抑制(). 在HepG2细胞中也观察到类似的作用(). 胰岛素活性的另一个标志是葡萄糖转运蛋白GluT4动员到质膜。用载体或RBP-ROH预处理脂肪细胞8小时，然后用胰岛素处理（20 nM，25分钟），分离出富含质膜的部分(27). 对GluT4组分进行免疫印迹分析表明，RBP-ROH抑制胰岛素诱导的GluT4-向质膜的动员().
RBP-ROH/STRA6/STAT5通路损害胰岛素反应。(A类和B类)用胰岛素（20 nM；25 min）或RBP-ROH（1μM；8 h）处理分化的脂肪细胞，或在用胰岛素处理前用RBP-ROH预处理8 h。(上部)对裂解液进行磷酸化胰岛素受体（pIR-Y1146）和总胰岛素受体（IR）的免疫印迹(A类)或磷酸化Akt（pAkt1-S473）和总Akt1(B类). (下部)磷酸化/总蛋白的定量。（所示数据为平均值±SEM；#P（P）<0.02与未经RBP-ROH预处理的对照组相比；n个= 3. (C类)用ROH或RBP处理分化的脂肪细胞（1μM；8 h），然后用胰岛素处理（20 nM；25 min）。(上部)如图所示，对裂解液进行免疫印迹。(下部)免疫印迹的定量。（所示数据为平均值±SEM；n个= 3.) (D类和E类)分化脂肪细胞(D类)或HepG2细胞(E类)用携带指示shRNAs的慢病毒转导5天。qPCR和/或免疫印迹证实靶蛋白表达降低(图S3E类,S4系列B类、和第5章C类和D类). 用胰岛素（20 nM；25 min）或RBP-ROH（1μM；8 h）处理细胞，或在用胰岛素处理之前用RBP-ROH预处理8 h。如左图所示，对裂解物进行免疫印迹D类和上部面板E类。实验进行了两次，结果相似。右面板中D类和下部面板E类显示数据的量化，两个独立实验的平均值。(F类)分化的脂肪细胞用载体或胰岛素（20 nM；25分钟）处理，或在用胰岛素处理之前用RBP-ROH（1μM；8小时）预处理。获得了粗质膜组分（cpm）(27). (左侧)免疫印迹显示cpm中Na-K ATP酶富集。(赖特)cpm中GluT4的免疫印迹。质膜标记物Na-K ATP酶作为负荷控制。
RBP诱导体内STRA6表达组织中STAT靶基因的表达并抑制胰岛素信号传导。
在小鼠中，STRA6在白色脂肪组织和骨骼肌中表达，但在肝脏中不表达() (28). 我们每隔2小时向10周龄C57BL/6小鼠腹腔注射RBP（12.5 mg/mL，80μL）三次。最后一次注射后1小时处死小鼠。在瘦小鼠、注射RBP的瘦小鼠和喂食高脂肪/高碳水化合物饮食18周且肥胖和胰岛素抵抗的小鼠中评估RBP的血液水平(22). 如前所述(6)，肥胖小鼠的血清RBP水平大约是瘦肉动物的两倍(). 注射RBP的小鼠血清显示两条带，分别对应内源性和重组RBP，总RBP接近肥胖动物的水平。因此，注射使血清RBP升高到生理意义范围内。RBP治疗小鼠可增强脂肪组织中STRA6、STAT5和JAK2的磷酸化()，上调脂肪组织和肌肉中SOCS3的表达()，并诱导脂肪PPARγ的表达(). RBP治疗还降低了脂肪组织和肌肉中胰岛素受体和Akt1的磷酸化水平(). 引人注目的是，尽管RBP激活了JAK2/STAT5通路并抑制了这些STRA6表达组织中的胰岛素信号，但它对STAT5的磷酸化状态没有影响(图S7A类)SOCS3和PPARγ的表达(图S7B类)或胰岛素受体或Akt1的磷酸化水平()在肝脏中，不表达受体().
RBP触发STRA6、STAT5和JAK2的磷酸化，上调STAT靶基因的表达，并抑制体内胰岛素信号传导。(A类)用qPCR测定白色脂肪组织（WAT）、骨骼肌（SM）和肝脏中的STRA6 mRNA。（所示数据为三只小鼠的平均值±SEM。）(插入)两只小鼠白色脂肪组织、骨骼肌和肝脏中STRA6的免疫印迹。(B类) (上部)瘦鼠、肥胖鼠和注射RBP的瘦鼠血清RBP的免疫印迹。显示了每组两只动物的结果。(下部)血浆RBP的定量。（所示数据为平均值±SEM*P（P）<0.03 vs.瘦小鼠；n个=每组3只小鼠。）(C类)STRA6从三只对照（缓冲液）和三只注射RBP的小鼠的白色脂肪组织中进行免疫沉淀（IP），并对磷酸酪氨酸进行免疫印迹。(D类)四只对照（缓冲液）和四只RBP注射小鼠白色脂肪组织中pSTAT5和总STAT5的免疫印迹。(E类) (左侧)三只对照（缓冲液）和三只RBP注射小鼠WAT中pJAK2、PPARγ和SOCS3的免疫印迹。(赖特)量化归一化为β-肌动蛋白的指示蛋白质。(*P（P）<0.05，与缓冲注射控制相比。）(F类)对照组（缓冲组）和RBP注射小鼠白色脂肪组织和骨骼肌中SOCS3 mRNA的表达。（所示数据为平均值±SEM*P（P）与缓冲注射小鼠相比，<0.05；n个=每组3人。）(G公司)注射缓冲液或RBP的小鼠白色脂肪组织中PPARγmRNA。（所示数据为平均值±SEM*P（P）与缓冲注射小鼠相比，<0.05；n个=每组4个。）(H（H）–J型) (上部)白色脂肪组织中胰岛素受体和Akt1的磷酸化水平(H（H）)、骨骼肌(我)，和肝脏(J型)注射缓冲液或RBP的小鼠。(下部)量化归一化为总Akt1的带强度。（所示数据为平均值±SEM*P（P）< 0.05;n个=每组3人。）
讨论
本文所述的发现证实，STRA6除了是ROH转运蛋白外，还具有表面信号受体的功能。如所示数据表明，RBP-ROH作为细胞外配体触发STRA6细胞溶质域中的酪氨酸磷酸化。反过来，激活的STRA6传播JAK2/STAT5级联，最终诱导STAT靶基因。因此，RBP-ROH通过与JAK和STAT相关的表面受体结合30多种细胞因子、激素和生长因子发出信号(10). RBP-ROH作为STRA6/JAK2/STAT5级联的激活剂的鉴定，该级联诱导众所周知的胰岛素信号传导抑制剂SOCS3的表达，为RBP抑制胰岛素反应的观察提供了分子基础(6)以及最近关于STRA6中SNP与2型糖尿病相关的报道(29). 该途径也可能参与其他生物功能。例如，观察到T644M STRA6突变会损害RBP-ROH信号，导致胚胎发育缺陷(8)提示该途径可能参与胚胎发生。此外，鉴于STAT是细胞生长、迁移和存活的关键调节器(30,31)STRA6在多种癌症中的表达上调(32)，RBP-ROH可能参与癌症的发展。这些观察结果表明，维生素A的生物活性范围比先前推测的要广得多。这些活动的完整范围，以及STRA6作为维生素a转运体的功能与其作为信号受体的作用之间的关系，仍有待探索。
RBP-ROH/STRA6/JAK/STAT通路模型。RBP-ROH与STRA6细胞外部分的结合触发受体胞质域中SH2结构域结合基序内的酪氨酸磷酸化。磷酸化的STRA6招募并激活JAK2，JAK2反过来磷酸化STAT5。活化的STAT5转位到细胞核以调节靶基因的表达，包括抑制胰岛素信号传导的SOCS3和增强脂质积累的PPARγ。STRA6模型（GeneID 64220RBP）是使用软件生成的http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/susi全息RBP（GenBank登录号DAA14765.1）的3D结构如参考文献所述得到解决。33.
