Bcl-2是创始成员一个与细胞死亡有关的蛋白质家族最初位于t（14；18）易位的断点淋巴细胞白血病细胞系(1–6). Bcl-2和其他成员家族在胚胎发生、组织重塑和通过其作为抑制剂或细胞凋亡促进剂(7–9). 至少有16个Bcl-2人类体内发现的同源物(10). 其中包括Bcl-2、，Bcl-x公司L（左）、Bcl-w和Mcl-1，它们是细胞死亡、Bad、Bak、Bax、Bid、Bim和Bcl-x公司S公司，是细胞死亡促进剂。通过拮抗剂在正常组织中保持平衡这些抗凋亡和促凋亡蛋白的相互作用(11).
除了正常功能外，Bcl-2的异常表达蛋白质与许多疾病有关，如自身免疫和神经退行性疾病与癌症(12–14). 事实上，Bcl-2已经发现在许多癌细胞中过度表达，包括大多数B细胞源性淋巴瘤、大肠腺癌和未分化鼻咽癌(15). Bcl-2已被牵连也存在于许多癌症对放射治疗和化疗药物(10,13). 因此，Bcl-2代表一个目标用于治疗癌症，尤其是Bcl-2过度表达和传统治疗已失败(15–19).
与Bcl-2结合并抑制其结合的分子的设计抗凋亡活性可以通过Bcl-2和Bcl-2配体配合物的三维结构。这个同源蛋白Bcl-x的结构L（左），具有之前单独或复合测定Bak和Bad中的促凋亡肽(20–22).Bcl-x公司L（左）是一种全α螺旋蛋白类似于细菌毒素的膜插入域，例如白喉毒素和结肠炎。在非复杂的结构中蛋白质，一个56-残留的柔性环被观察到并发现对抗凋亡活性不重要。因此，在确定的结构Bcl-x公司L（左）–肽复合物，这种柔性环从56个残基截断为16个残基。此更改不仅简化了蛋白质的核磁共振谱也改善了Bcl-x公司L（左）溶液中。
尽管Bcl-xL（左）和Bcl-2共享高度的序列同源性（图。.），他们有不同的组织分布，在癌症(23–29). 例如，Bcl-2似乎是急性髓系白血病细胞死亡Bcl-x公司L（左）与抵抗细胞死亡相关在乳腺癌中。Bcl-2和Bcl-xL（左）在以下方面也有所不同它们对促凋亡成员的结合特异性Bcl-2家族(30). 结合特异性的这些差异可能是由这两种蛋白质之间的结构差异引起的。
全长Bcl-x序列比对L（左），三个全长Bcl-2的亚型[表示为Bcl-2（1）（1,2），Bcl-2，和Bcl-2（3）（5,6）]，以及截断的Bcl-2/Bcl-xL（左）本研究中使用的嵌合体。Bcl-2之间的氨基酸差异异构体以红色显示，截断的循环以绿色显示假定的膜跨越区域以蓝色显示。α-螺旋之前在Bcl-x中确定L（左）在上面表示红色序列。
GenBank包含Bcl-2的多个条目，差异很小氨基酸的数量。尽管这些与生理相关变化尚不清楚，其中两个差异影响预测促凋亡Bcl-2家族蛋白的结合位点：苏氨酸或丙氨酸位于96位，甘氨酸或精氨酸位于110位（图。). 这里我们描述了两种亚型的三维结构Bcl-2，表示为Bcl-2（1）(1,2)和Bcl-2（2）(三–6)，通过核磁共振在溶液中光谱学。将Bcl-2蛋白的结构与彼此之间以及之前确定的结构Bcl-x公司L（左）.确定两种亚型Bcl-2与促凋亡肽的结合不同，亲和力对来自Bak和糟糕。
材料和方法
质粒构建。
准备并评估了几种不同的Bcl-2结构它们对核磁共振结构研究的适用性。编码氨基的片段Bcl-2（1）的酸1-218（图。)来自Daudi mRNA（克隆技术）通过逆转录（RT）–使用RT-PCR试剂盒进行PCR（罗氏分子生物化学）。碎片被插入Nde公司我和Xho公司pET30b质粒的I位点（Novagen）用于表达。通过使用这个质粒作为模板制备其他质粒。在每种情况下Nde公司我和Xho公司新建筑中使用了pET28b的I位点。这个第一个质粒包含编码氨基酸1-50和92-218的片段第Bcl-2（1）条。构建了第二个包含片段的质粒编码Bcl-2（1）的1-34个氨基酸Bcl-x公司L（左）和Bcl-2（1）第92–218条。第三个质粒含有编码Bcl-2（1）氨基酸1-34的片段，Bcl-x的35–50L（左）和Bcl-2（1）第92–207条。对于构建亚型2的质粒，最后一个质粒被用作DNA模板。丙氨酸96和甘氨酸110被改为苏氨酸和精氨酸，分别使用Stratagene快速更换试剂盒（斯特拉赫纳）。
表达和纯化。
Bcl-2蛋白表达于大肠杆菌BL21（DE3）生长在含有15全日空航空公司4氯，15全日空航空公司4氯离子+[美]-13C] 葡萄糖或15全日空航空公司4氯，[美]-13C] 葡萄糖和75%2H（H）2O.对于亚型1，用镍纯化可溶性蛋白2+-亲和性色谱法。氨基末端His标签被切割掉符合制造商协议的生物素化凝血酶（诺瓦根）。通过添加链霉亲和素琼脂糖去除凝血酶（诺瓦根）到反应混合物中，然后劈开他的标签和任何把混合物放在另一种蛋白质上，以除去未分离的蛋白质预平衡镍2+列。对于亚型2细胞裂解后的可溶部分加载到Q-Sepharose柱上，用含有25 mM Tris●HCl（pH 8.0）和1 mM的缓冲液清洗DTT，用0–1 M NaCl的线性梯度洗脱。洗脱的浓缩并装载含有Bcl-2（2）蛋白的组分Superdex 75凝胶过滤柱的缓冲预平衡含有25 mM Tris●HCl（pH 8.0）、1 mM DTT和150 mM NaCl。核磁共振样品含有0.5–1.0 mM蛋白质，90%H（H）2O/10%直径2O或100%D类2O、 20 mM Tris（pH 7.8）和5 mM DTT。
核磁共振波谱。
所有核磁共振实验均在298 K下在Bruker DRX500、DRX600、，或DRX800核磁共振波谱仪。骨干1H、，13C、 以及15N共振通过以下方式完成任务[15N、，13C、，2H（H）（75%）]Bcl-2通过使用一套氘解耦三重共振实验[HNCA、HN（CO）CA、HNHN（CA）CO](31). 侧链1H和13C核磁共振信号来自HCCH-TOCSY实验(32)缬氨酸和缬氨酸的立体定向分配亮氨酸甲基是通过分析13C–13C耦合模式观察到生物合成定向的部分13C-标记的Bcl-2(33). 核过热效应（NOE）距离约束是从三维空间获得的15N-和13C编辑NOE（NOESY）光谱(34,35)以80 ms的混合时间缓慢采集在15N-异核单量子关联将蛋白质转换为用D制备的缓冲液2O.剩余偶极联轴器（HN-N和C′-Cα)测量单位：使用HNCO实验的非耦合版本[15N、，13C、，2H（H）（75%）]Bcl-2在17人在场的情况下毫克？毫升−1Pf1噬菌体(36–38).
结构计算。
Bcl-2结构通过模拟退火进行计算协议(39)使用程序CNX（分子Simulations，加利福尼亚州圣地亚哥）。平方势(F类否= 50千卡摩尔−1)用于约束NOE衍生距离。基于交叉峰强度，NOE导出距离限制的上限为3.0、4.0、5.0或6.0Å. 扭转角约束φ，ψ是通过分析N，C′，Cα、和Hα使用TALOS程序进行化学位移(40). 一力常数200千卡摩尔−1·弧度−2适用于所有扭转约束。显式氢键是包含在α-螺旋中，仅用于观察到的缓慢残留物交换酰胺质子。PROCHECK程序是用于分析计算结构的几何质量合奏(41).
肽结合。
荧光偏振竞争分析用于测定人Bad中25个残基肽的相对亲和力（NLWAAQRYGRELRRMSDEFVDSFKK）和来自Bak的16残基肽（GQVGRQLAIIGDDINR）（SynPep，Dublin，CA）用于两种Bcl-2亚型。一6-羧基荧光素琥珀酰标记的改良Bad肽酯（FAM）在这两种情况下都被用作探针[（5-FAM）-AAAA QRYGRELRRRMSDEFVDSFKK）]。滴定是在Abbott临床诊断仪器（IMx、FPIA模式）(22)在含有120 mM钠的缓冲液中同时含有蛋白质和肽磷酸盐（pH 7.55）、0.01%牛丙种球蛋白和0.1%钠叠氮化物。根据滴定曲线确定解离常数使用Dandliker的分析方法等。(42)带有程序MINSQ 4.03（Micromath Scientific软件，犹他州盐湖城）。
结果和讨论
样品制备和优化。
穷人阻碍了对野生型Bcl-2（1）的结构研究蛋白质的溶解度。由于身体状况不佳Bcl-2的性质，Bcl-2没有三维结构到目前为止已报道。相反，同源蛋白，Bcl-x公司L（左），在溶液中表现良好，允许其待确定的x射线和核磁共振结构(20). 其中一个专业Bcl-x之间的序列差异L（左）和Bcl-2在Bcl-2的一个区域中，预计将采用灵活的、非结构化的循环。对于Bcl-xL（左），蛋白质的这个区域是其抗凋亡活性不需要(20). 要测试这个预测的环区是否是穷人的原因Bcl-2（1）在溶液中的行为，在删除了哪些残基51–91(21). 不幸的是环缺失型Bcl-2的行为类似于野生型蛋白高浓度聚集。这一发现与Anderson的结果等。其中Bcl-2的一种形式被四个丙氨酸取代的假定的非结构化环不是足以用于结构研究(43).
环删除形式溶解度差的一个可能原因Bcl-2（1）是其不利的等电点（6.4），非常接近核磁共振实验中使用的缓冲液的pH值与Bcl-x的pIL（左）(4.9). 这种差异等电点，可以解释这些蛋白质主要来源于大量的阴离子Bcl-x中的残基L（左）（图。). 为了测试这个假设，制备了一种嵌合蛋白，其中Bcl-2的环被替换为负电荷回路Bcl-x公司L（左）。预计这种蛋白质有很多pI较低（5.0），因此应更易溶解。尽管如此嵌合蛋白表现出比原始结构更好的性能保持可溶性达1 mM，15N、，T型2测量表明，该蛋白质是仍在聚合。这种蛋白质的初步核磁共振实验表明11个C末端残基，其中含有几个疏水性氨基酸，在溶液中是非结构化的，可能是负责诱导聚合。因此，第二Bcl-2（1）/Bcl-xL（左）奇美拉是在其中准备的这十一个C末端残留物被清除（图。). 与其他形式的Bcl-2，这种蛋白很容易溶解，在解决方案。此外，该蛋白的生物活性为根据其提供的保护证明保留staurosporine电穿孔进入Jurkat后诱导细胞凋亡单元格（未显示数据）。
通过突变残基96从Bcl-2（1）制备亚型2嵌合体从丙氨酸到苏氨酸和甘氨酸突变残基110精氨酸。Bcl-2（2）在溶液中也表现良好，适用于用于核磁共振结构测定。
Bcl-2结构的质量。
蛋白质结构的计算基于总计2310个非平凡的亚型1和2337非平凡的NMR衍生距离约束亚型2的距离限制。图。显示了用为两种亚型编写CNX程序。不包括柔性螺旋1和螺旋2之间的环（残基33–91），八个N端残基和4个C端残基Bcl-2（1）关于平均位置的平方根偏差（RMSD）主链为0.59Å，所有重原子为1.10 \8491]。对于在Bcl-2（2）的相同区域，平均位置的RMSD为0.61Å对于主链和1.15Å对于所有重原子。结构每个系综的统计数据和能量最小化平均值结构如表所示.那里距离违规是否大于0.4Å或二面角违规超过5°。在结构细化中，只有共价几何、NOE、扭转和排斥范德华项包括。即便如此，Lennard–Jones的能量还是巨大且为负值，表明该结构具有良好的非键合接触。用程序分析平均最小化结构PROCHECK检查(41)显示78.3%和77.1%的Bcl-2（1）和Bcl-2Ramachandran地块的有利区域，19.6%和22.9%位于允许的区域。
(一)15的主干（N，Cα，C′）叠加低能NMR衍生结构和带状物(47)描述Bcl-2的平均最小结构（1）。(B类)主干网15个低能NMR衍生结构和Bcl-2平均最小化结构的带状图（2）。对于叠加，平均结构显示为红色。螺旋是根据结构中观察到的编号Bcl-x公司L（左）(20).
表1
| | Bcl-2（1） | | | Bcl-2（2） | | |
|---|
| Rmsd来自实验距离约束 | 数量限制 | 〈南非〉* | 〈南非〉第页 | 不。约束装置的 | 〈南非〉 | 〈南非〉第页 |
| 长 | 651 | 0.008 ± 0.002 | 0.005 | 661 | 0.008 ± 0.002 | 0.007 |
| 短 | 514 | 0.007 ± 0.002 | 0.003 | 544 | 0.010 ± 0.002 | 0.009 |
| 相继的 | 554 | 0.009 ± 0.003 | 0.005 | 553 | 0.016 ± 0.002 | 0.012 |
| 内部 | 591 | 0.008 ± 0.003 | 0.006 | 579 | 0.010 ± 0.004 | 0.007 |
| H股债券 | 86 | 0.014 ± 0.002 | 0.010 | 62 | 0.014 ± 0.002 | 0.009 |
| 塔罗斯 | 182 | | | 192 |
|
| CNX公司势能（kcal●mol−1) |
| E类全部的 | | 116.0 ± 4.7 | | | 160.7 ± 5.2 |
| E类债券 | | 3.9 ± 0.4 | | | 4.2 ± 0.5 |
| E类角 | | 62.2 ± 2.3 | | | 66.4 ± 2.3 |
| E类虚拟数据仓库 | | 13.8 ± 1.5 | | | 13.9 ± 1.8 |
| E类改进 | | 6.7 ± 0.6 | | | 7.8 ± 0.7 |
| E类NOE（无） | | 8.9 ± 1.7 | | | 16.7 ± 3.4 |
| E类cdih公司 | | 0.9 ± 0.4 | | | 0.7 ± 0.2 |
| E类萨尼语 | | 19.9 ± 2.9 | | | 50.9 ± 3.4 |
| E类L−J型 | | −884 ± 10 | | | −891 ± 13 |
| Rmsd，Å | 骨干 | 都很重原子 | 骨干 | 所有重原子 |
|---|
| 〈SA与。萨沙第页 | 0.59 ± 0.11 | 1.10 ± 0.11 | 0.61 ± 0.09 | 1.15 ± 0.10 |
Bcl-2结构说明。
Bcl-2（1）的整体结构包括两个中心，主要是疏水螺旋（螺旋5和6）两亲性α螺旋（图。). 螺旋1（残基11–24）是通过缩短的人工环连接到螺旋2（残基93–108）源自Bcl-xL（左）。此循环在中是非结构化的解决方案的证据是缺乏中长期NOE这个地区。螺旋线1和螺旋线2彼此平行，以大约45°的角度交叉。一个长循环，其中包含单圈3圈10螺旋，将螺旋2连接到螺旋4（残基126–137）并产生近似正交的这两条螺旋的方向。螺旋4，5（残基144–163），和6（残基167–192）以几乎相反的方式定向在组氨酸184处螺旋6扭结。由以下部分组成的不规则转弯两个甘氨酸残基连接螺旋6和螺旋7（残基195–202），使螺旋线7与螺旋线4、5和6正交。
蛋白质表面有疏水沟槽（图。). 中类似的疏水槽Bcl-x公司L（左）对应于蛋白质的区域与Bcl-2家族促凋亡成员结合。在Bcl-2，该区域的突变已被证明可以消除Bcl-2的抗凋亡活性及阻断异二聚体与其他家庭成员(44). 尽管Bcl-2（1）有净负值中性pH下的电荷，疏水性周围的电荷分布槽是平衡的，如抓住(45)图的图像。一.
显示Bcl-2（1）疏水槽的溶剂可及表面(一)和Bcl-2（2）(B类). 亮氨酸，异亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基呈黄色，天冬氨酸和谷氨酸呈红色赖氨酸、精氨酸和组氨酸呈蓝色。所有其他残留物字体是灰色的。
带有钥匙侧链和静电的装订槽[抓住(45)])Bcl-2（1）的表面(一),Bcl-2（2）(B类)和Bcl-xL（左）(C类).Bcl-2蛋白和Bcl-x之间不同的残基L（左）以黄色突出显示。
亚型2的结构与亚型的结构基本相同1（图。). 不包括柔性环和氨基和羧基末端，主链RMSD两种结构之间的取代度为1.10Å苏氨酸代表96位的丙氨酸，精氨酸代表甘氨酸在位置110对蛋白质的构象没有影响结构测定的实验误差。评估这两种蛋白质结合沟之间的潜在差异此外，它们与来自促凋亡蛋白Bak和来自促凋亡蛋白Bad在荧光基础上进行测量极化分析（表).令人惊讶的是，Bcl-2（2）结合Bad肽的量大约增加了2倍比Bcl-2（1）紧密，并且它结合Bak肽的量约为8倍紧紧地。因此，尽管两者的结构相似异构体在结合特异性方面表现出差异Bcl-2家族的促凋亡成员。
表2
| 肽 | 顺序 | Bcl-2（1）Kd，毫微克 | Bcl-2（2）Kd，纳米 | 密件抄送-xL（左）Kd，毫微克 |
|---|
| 坏25个月 | NLWAAQRYGRELRRMSDEFVDSFKK | 15 | 8 | 0.6 |
| 贝克16个月 | GQVGRQLAIIGDDINR公司 | 12,710 | 1,600 | 480 |
Bcl-2与其他家庭成员的结构比较。
将Bcl-2（1）和Bcl-2的NMR结构与先前确定的Bcl-x核磁共振结构L（左）(20)在图中。.整体褶皱为非常类似于Bcl-2（1）和之间的主干RMSDBcl-x公司L（左）在1.91Å之间以及Bcl-2（2）和Bcl-x公司L（左）1.84Å（不包括截断的循环）。最大的差异出现在螺旋3区域，这使得绑定位置的上半部分。不包括螺旋3（残基110–125）Bcl-2（1）和Bcl-x之间的RMSDL（左）降至1.71Å, 以及Bcl-2（2）和Bcl-x之间的RMSDL（左）是1.61Å。在Bcl-2中，该区域由一个三10螺旋而不是规则的α-螺旋在Bcl-x中观察到L（左）此外，该地区Bcl-2与螺旋线4的第一圈一起平移到Bcl-x中的相应区域L（左）（图。).这种差异很可能是由于Bcl-x公司L（左）在Tyr-127的侧链之间螺旋6中的螺旋4、Thr-179和Tyr-180螺旋4的氨基末端朝向螺旋6。这些联系人不是在Bcl-2中观察到，因为残基127和179是精氨酸和谷氨酸。
(一)Bcl-2（1）（红色）与Bcl-x公司L（左）（蓝色）。(B类)主干叠加Bcl-2（2）（红色）带Bcl-xL（左）（蓝色）。
除了Bcl-2和Bcl-x公司L（左）在疏水槽中，有几个主要序列中的关键差异转化为不同的装订槽的拓扑结构。在这方面不同的氨基酸这两种蛋白质的区域包括：残基111（Bcl-2中的天冬氨酸密件抄送-xL（左）)，残留物115（Bcl-2中的MetBcl-x公司L（左）)和残渣129（Bcl-2中的Arg；SerBcl-x公司L（左）). 这些氨基酸差异是图中以黄色突出显示。在这些差异中天冬氨酸到丙氨酸和精氨酸到丝氨酸的替代将是预计装订槽的特性变化最大，因为这种替换改变了蛋白质的电荷。比较抓住Bcl-x表面L（左）（图。C类)至Bcl-2（图。 一和B类)支持这一结论。负离子浓度Bcl-x中槽底部的电势L（左）Bcl-2中不存在的。这种负电荷很可能出现来自两个酸性残基：Asp-114和Glu-135。在Bcl-2蛋白中，这种负电荷由精氨酸-129补偿，精氨酸129是一种丝氨酸Bcl-x公司L（左）.
装订槽静电表面的差异至少可以部分解释Bcl-x公司L（左）Bad和Bak肽与Bcl-2（1）和Bcl-2). 在Bcl-x公司L（左）–Bak和Bcl-xL（左）–不好肽复合物(21,22)，观察到螺旋肽结合氨基端正电端朝向绑扎槽。如上所述，该区域的电负性更强以Bcl-x为单位L（左）与Bcl-2相比，这可能说明这些肽对Bcl-x公司L（左）.
最近，NMR衍生的促凋亡蛋白结构铃木报道Bax等。(46)谁用了巴克斯用假定的跨膜区和柔性环构建完整的。虽然Bax在细胞凋亡中起着非常不同的作用与Bcl-2和Bcl-x相比L（左），整体褶皱这些蛋白质中有相似的。不包括跨膜区，Bax包含与两种抗凋亡药物相同数量的螺旋蛋白质，这些螺旋的相对取向是相同的。Bcl-2（1）和Bax之间的RMSD为1.9Å，而Bcl-2（2）和Bax为2.2Å。根据核磁共振数据Bax中的螺旋1和螺旋2基本上是无序的。只有微弱的NOE在该环的中心部分和上的两个残基之间观察到螺旋线6。该结果与Bcl-x公司L（左），其中该回路灵活且表明Bcl-2中相应的环路也会被扰乱。
