生物化学杂志。2011年3月18日；286(11): 9636–9645.
ESCRT-0作为异四聚物在膜上组装并同时结合多个泛素化载体*
,‡ ,§ ,‡ ,¶,1 ,§和‡,2
伊恩·菲菲
这个§英国剑桥大学药理学系，剑桥CB2 1PD
埃德温·查普曼
¶威斯康星大学麦迪逊医学院生理学，威斯康星州麦迪逊53706和
J.迈克尔·爱德华森
这个§英国剑桥大学药理学系，剑桥CB2 1PD
来自以下部门‡生物分子化学和
¶威斯康星大学麦迪逊医学院生理学，威斯康星麦迪逊53706和
这个§英国剑桥大学药理学系，剑桥CB2 1PD
1霍华德·休斯医学研究所研究员。
2010年9月14日收到；2010年12月13日修订
- 补充资料
补充数据
GUID:73F9F6EA-3D89-4098-ACEF-113920059383
GUID:A40977E8-FB5F-4702-8DDD-C9BA299B1C6E
摘要
ESCRT机制由多个蛋白质复合物组成，共同参与多泡内体（MVE）的生物生成。ESCRT-0复合物由两个亚基组成，即Hrs和STAM，这两个亚单位都可以与用于溶酶体降解的泛素化底物结合。在这里，我们使用等温滴定量热法对ESCRT-0：泛素相互作用进行了全面分析，并定义了完整ESCRT-01复合物中每个泛素结合域（UBD）的亲和力。我们的数据表明，泛素结合在ESCRT-0 UBD之间是不合作的。此外，我们的研究结果表明，Hrs双泛素相互作用基序（DUIM）对泛素的亲和力比STAM中发现的UBD大2倍以上，表明Hrs是ESCRT-0中的主要泛素结合蛋白。体内、Hrs和STAM定位于内膜。为了研究重组ESCRT-0在脂质双层上的组装，我们使用了原子力显微镜。我们的数据表明，在有膜的情况下分析时，ESCRT-0主要形成Hrs和STAM的异二聚体和异四聚体。与这些发现一致，内源性ESCRT-0的流体力学分析表明，它主要以其两个亚基的异四聚体复合物的形式存在。基于这些数据，我们提出了一个修正的ESCRT-0在内体货物补充和浓度中的功能模型。
关键词：秀丽线虫、内切体、溶酶体、膜贩运、泛素
介绍
许多质膜蛋白，包括激素受体，必须被内化和降解以适当调节其活性(1). 受体转换缺陷已被证明会导致构成细胞信号传导，从而导致疾病(2). 细胞表面蛋白质的下调可由泛素化启动，泛素化允许一组蛋白质的成员识别细胞表面蛋白质，这些蛋白质统称为ESCRT（运输所需的内体分选复合物）三机械(三). 膜蛋白的泛素化发生在质膜和早期内体，最终导致其并入多泡内体（MVEs）并在酸化溶酶体室中降解(4,5). ESCRT机制的一个子集使用多种泛素结合域（UBD）选择性地结合预定降解的膜蛋白上的泛素修饰；6,–8). 每个UBD的相对贡献仍然不明确，ESCRT复合物中单个蛋白质的整体功能也是如此。
ESCRT机制由五个多亚基复合物组成，其中三个已被证明含有UBD：ESCRT-0、ESCRT-I和ESCRT-II(9). 在后生动物中，ESCRT-0是目前已知的唯一含有一个以上泛素结合位点的ESCRT复合体(10,11). ESCRT-0由Hrs和STAM两种蛋白质组成，在溶液中形成1:1的复合物(12). Hrs含有两个表征良好的泛素结合位点，这两个位点都位于其双泛素相互作用基序（DUIM）内(11). STAM还包含两个泛素结合位点，一个Vps27/Hrs/STAM（VHS）域和一个泛素相互作用基序（UIM）(10). 因此，ESCRT-0被认为能够同时结合至少4个泛素部分。已测定了ESCRT-0中单个UBD的结合亲和力。在每种情况下，都使用表面等离子体共振（SPR）进行间接热力学测量，大多数研究仅使用Hrs和STAM中的孤立区域进行分析(11,–13). 因此，完整ESCRT-0复合体中每个UBD的相对贡献仍不明确。
在细胞中，Hrs和STAM主要定位于内胚层膜(5). Hrs-FYVE（Fab1/YOTB/Vac1/EEA1）结构域与富含磷脂酰肌醇3-磷酸（PI3P）的相互作用介导了它们与内体的联系。在缺乏PI3P的细胞中，Hrs和STAM均不能有效定位于内体(14). 此外，STAM的稳定性取决于Hrs的存在，这表明Hrs和STAM是组成性结合在一起的体内(15,16). 尽管研究表明重组Hrs和STAM在1:1的溶液中相互结合(12)，目前尚不清楚它们与膜的结合是否会影响ESCRT-0组装体内由于该复合物包含多个UBD，每个UBD都能与泛素化货物相互作用，因此在膜存在的情况下测定Hrs和STAM的化学计量比对于理解ESCRT-0在货物补充和浓缩中的作用至关重要。
在本研究中，我们使用等温滴定量热法（ITC）对ESCRT-0：泛素相互作用进行了全面分析，并定义了完整ESCRT-0-复合物中每个UBD的结合亲和力。我们进一步表明，重组Hrs和STAM可以在膜上形成异四聚物复合物在体外与这些发现一致，我们证明内源性ESCRT-0也组装为Hrs和STAM的2:2复合体。总之，我们的数据表明，ESCRT-0可以与多达8种独特的泛素修饰同时关联体内这可能会增强MVE生物发生过程中的货物聚集。
实验程序
重组蛋白纯化
Hrs和STAM从秀丽隐杆线虫cDNA文库，并克隆到经过多顺反子表达修饰的pRSETa载体中。将多组氨酸标记附加到Hrs的氨基末端，以便使用镍亲和色谱进行纯化。蛋白表达在用0.1m诱导的BL21（DE3）细胞中进行米25°C下IPTG 3小时。收集细胞并将其重新悬浮在裂解缓冲液中（50 m米磷酸钠（pH 8），300 m米氯化钠，10米米咪唑，0.15%吐温-20，5米米β-巯基乙醇）。将澄清的裂解产物与1 ml Ni-NTA-海藻糖（Qiagen）孵育1 h。用含有0.10%吐温-20和蛋白酶抑制剂的200 ml裂解缓冲液清洗树脂。将蛋白质洗脱到洗脱缓冲液中（50 m米Hepes（pH 7.6），100 m米KCl，1米米EDTA和250 m米咪唑），并应用于Superose 6凝胶过滤柱（GE Healthcare Life Sciences），在缺乏咪唑的洗脱缓冲液中平衡。对于ITC实验，将峰值部分汇集在一起，并在50 m内透析过夜米Hepes（pH 7.6），100米米KCl和1 m米EDTA公司。
蠕虫菌株及其提取物的制备
准备秀丽线虫胚胎提取物，怀孕的成年雌雄同体在液体培养物中生长，收获，并用5的1:2溶液处理n个氢氧化钠和6%次氯酸钠。在此过程中分离的胚胎在裂解缓冲液（50 m）中冷冻米Hepes（pH 7.6），100 m米KCl，1米米EDTA，1米米MgCl和10%甘油），使用研钵和杵进行手动破碎，然后在蛋白酶抑制剂存在下进行超声波处理。通过离心（160000×克)如前所述，用于流体动力学研究或免疫沉淀(17,18). 为了制备全虫提取物，将妊娠成虫雌雄同体生长在10 cm的培养板上，接种细菌（OP50），并在M9缓冲液（42 m）中收获米纳2高性能操作4，24米米千赫2人事军官4，9米米氯化钠，19米米全日空航空公司4Cl），含0.1%吐温-20。将动物冲洗到裂解缓冲液中，并制备与胚胎提取物类似的提取物。STAM/C34G6.7突变的动物(ok406号机组)从明尼苏达大学Caenorhabditis遗传学中心获得。
抗体产生和定点突变
秀丽线虫用多组氨酸标记的全长Hrs（C07G1.5）或STAM（C34G6.7）免疫家兔（Covance），可提高Hrs和STAM抗体大肠杆菌对于VPS-25抗体，使用纯化的ESCRT-II复合物作为抗原。所有抗体通过与相同抗原的柱结合从血清中亲和纯化。针对EEA-1的抗体已在前面描述过(19). 使用重叠延伸PCR技术产生点突变，并通过基因测序确认。
流体动力学研究
使用Gradient Master倒入甘油梯度（10–30%），并在梯度顶部（4 ml）应用样品（100μl）后离心8 h。手工收集组分（200μl），并通过SDS-PAGE或Western blot进行分析。使用Superose 6凝胶过滤柱进行凝胶过滤色谱，收集1 ml样品进行分析。对具有已知沉降值和斯托克斯半径的标准进行类似处理，以生成标准曲线，从中导出样品的水动力特性。为了计算蛋白质或蛋白质复合物的天然分子量，使用了以下方程式：M=6πηN个as/（1-γρ），其中M是天然分子量，η是介质的粘度，N个是阿伏伽德罗数，a是斯托克斯半径，s是沉降值，ν是部分比体积，ρ是介质的密度(20).
免疫荧光和原子力显微镜
对于免疫荧光研究，将胚胎固定在冷甲醇中，并使用浓度为1μg/ml的直接标记的多克隆兔抗体进行染色。在配备有Roper CoolSnap HQ2 CCD相机的扫描场共聚焦显微镜（Nikon Ti-E）上使用Nikon 60×，1.4NA Planapo油物镜获取图像。采集参数由尼康Elements软件控制。对于每个样品，以0.2μm的步长采集了11个Z截面，并用于生成最大强度投影（2-μm厚）。对于使用原子力显微镜（AFM）的研究，在存在或不存在重组ESCRT-0的情况下，将含有磷脂酰胆碱（PC，54%）、磷脂酰乙醇胺（PE，30%）、磷脂酰丝氨酸（PS，15%）和PI3P（1%）的脂质体吸附到新切割的云母上。使用Veeco Digital Instruments多模式仪器在室温下进行成像，该仪器由Nanoscope IIIa控制器控制。对AFM图像进行平面拟合以消除倾斜，并将每条扫描线拟合到一阶方程。确定了颗粒，并使用截面工具手动测量了其尺寸。根据每个粒子的高度和半径计算分子体积。
等温滴定量热仪
所有ITC实验均在MicroCal ITC 200量热计上进行。在注射1μl泛素（8 m米)进入含有重组ESCRT-0（～20μ米). 每个实验包括38次注射，每次间隔2.5分钟。背景（向含有缓冲液的细胞内注射泛素）从结合等温线中减去，并使用非线性最小二乘程序（Origin，MicroCal）分析数据。用单点模型进行曲线拟合得到了结合常数(K（K）一)自由能变化、焓变化、熵变化和离解常数计算为1/K（K）一.
结果
秀丽线虫ESCRT-0在体外形成Hrs和STAM的1:1复合物
这个秀丽线虫基因组编码人类ESCRT-0亚单位的单一同源物，我们称之为Hrs（C07G1.5）和STAM（C34G6.7）。确定Hrs和STAM是否在秀丽线虫我们制备了针对每种蛋白的亲和纯化抗体，并进行了一系列免疫沉淀实验。我们发现，无论使用哪种抗体，Hrs和STAM都可以恢复，这表明这些蛋白相互关联(A类). 相反，在ESCRT-II亚单位VPS-25的免疫沉淀中，ESCRT-0的两个组分均未恢复，表明Hrs和STAM之间的相互作用是特异性的。
Hrs和STAM形成一个综合体体内和在体外. A类、Hrs、STAM和Vps-25从秀丽线虫胚胎提取物，用SDS-PAGE分离并用α-Hrs和α-STAM抗体进行免疫印迹(n个= 3).B类，α-STAM免疫沉淀物用梯度凝胶（4–20%）和银染SDS-PAGE分离。免疫沉淀是在200或300 m米KCl，如图所示。观察到的两个主要谱带显示了Hrs和STAM的预测分子量。C和D类，重组Hrs和STAM从大肠杆菌提取物采用镍亲和层析。图中显示了在Superose 6凝胶过滤柱上对络合物进行分级后，峰洗脱组分的考马斯染色凝胶(C). 蛋白质在10–30%甘油梯度上进行分馏(D类)，并计算沉降值。每个面板中显示的结果代表了至少三个单独的实验。测量每个谱带的强度以确定峰洗脱分数，并根据特征标准的流动性计算斯托克斯半径或沉淀值。这个星号表明存在与Hrs和STAM共同洗脱的细菌热休克蛋白。
为了确定是否有任何额外的蛋白质与Hrs和STAM组成性结合秀丽线虫通过SDS-PAGE和银染凝胶分离抗STAM免疫沉淀物。在200-500 m的各种盐浓度下米KCl，我们观察到对应于Hrs和STAM的谱带(B类和数据未显示）。然而，我们未能检测到具有类似恢复水平的任何其他蛋白质。因此，我们得出结论，ESCRT-0复合物在秀丽线虫而且它们之间的联系能够抵抗相对高浓度盐的破坏。
以前的报告表明，重组人ESCRT-0由Hrs和STAM的1:1异二聚体组成(12). 与球状标准物相比，人ESCRT-0在凝胶过滤色谱中表现出异常的迁移特征，这与它采用的细长构象一致。我们着手确定秀丽线虫ESCRT-0复合体的组装类似于它的人类复合体。秀丽线虫Hrs和STAM通过多顺反子表达系统在大肠杆菌在Hrs的氨基末端附加一个多组氨酸标签，以便使用镍亲和层析进行纯化。与我们的发现一致，内源性Hrs和STAM相互作用，我们发现重组蛋白从镍树脂中共同纯化，尽管仅Hrs含有亲和标记(C).
通过凝胶过滤色谱法和甘油梯度沉淀法分析纯化后的复合物的流体力学性质。在这两种情况下，Hrs和STAM作为单一复合物共同迁移，Stokes半径为～7.05nm，沉积值为～4.7S(,C和D类). 通过组合这些值，我们获得了其天然分子质量（～139 kDa）的准确测量值，这与Hrs和STAM的1:1异二聚体的预测分子量（134 kDa.）类似。
在ESCRT-0纯化过程中，我们发现两种主要污染物在镍亲和纯化、凝胶过滤色谱和密度梯度分馏之后，始终与Hrs和STAM共同纯化。使用质谱法，两者都被鉴定为细菌热休克蛋白（数据未显示）。然而，根据计算的ESCRT-0的天然分子量，热休克蛋白似乎没有直接与Hrs或STAM结合。相反，在流体力学分析中，他们只是在相同的组分中发现。与这一想法一致，我们发现热休克蛋白在凝胶过滤色谱中的分馏与ESCRT-0相似，即使它们与其他多组氨酸标记蛋白共同纯化(补充图S1). 我们得出结论，重组秀丽线虫Hrs和STAM在溶液中以1:1的化学计量比直接相互结合，与人类的对应物相似，形成一个具有细长形状的复合物。
Hrs和STAM UBD中的点突变不影响ESCRT-0组装
Hrs和STAM UBD中抑制其与泛素结合能力的突变已被定义(11,13,21). 为了确定这些点突变是否影响ESCRT-0的构象，我们分别或同时将它们引入ESCRT-0-多顺反子表达结构。具体而言，Hrs的DUIM（A263Q和A265Q）、STAM的UIM（A181Q和S185A）和STAM的VHS域（W29A）发生突变(A类). 在每种情况下，突变复合物都表现出稳定，并且表现出与野生型ESCRT-0相似的斯托克斯半径(,B类和C). 此外，删除整个STAM VHS域未能中断ESCRT-0程序集，这与Hrs和STAM中线圈域在调解其关联中的既定作用一致(B类; 12, 22, 23). 我们的数据表明，抑制UBD：泛素相互作用的ESCRT-0突变不会显著影响溶液中ESCRT-0复合物的构象或组装。
ESCRT-0泛素结合域中的突变不会损害复杂组装。 A类,方案描述的领域组织秀丽线虫小时和STAM。重点介绍了本研究中使用的点突变。CB，网格蛋白盒。B类凝胶过滤色谱后，使用SDS-PAGE拆分野生型和突变型ESCRT-0复合物，并使用考马斯染色。删除或变异的域以上标文本表示。C，表显示了通过凝胶过滤分析确定的野生型和突变型ESCRT-0复合物的斯托克斯半径。
泛素结合在ESCRT-0 UBD之间不起作用
在几乎所有报道的病例中，ESCRT亚基中鉴定的UBD的亲和力都是通过间接测量蛋白质结合来确定的，例如表面等离子体共振（SPR）(11,–13). 尽管SPR很有价值，但它容易受到一些伪影的影响，包括质量传输效应、表面浓度以及将一个结合伙伴固定在芯片上所引起的问题(24). 此外，在全长ESCRT复合物的背景下，每个UBD的亲和力尚未确定，禁止直接比较其各自的泛素结合特性。利用我们从细菌中纯化微量ESCRT-0的能力，我们使用等温滴定量热法（ITC）测定ESCRT-0-与泛素之间的结合亲和力。与其他约束研究相比，ITC有几个优点(25). 首先，这项技术使用平衡溶液，在该溶液中研究的蛋白质不需要标记或粘附在表面。其次，ITC不受蛋白质大小或样品光学特性的影响。最后，ITC可以在单个实验中唯一地确定结合亲和力、焓和熵(26).
我们将泛素的浓缩溶液滴定到含有ESCRT-0的量热计中。每次滴定后，释放热量，并生成结合曲线，由此我们确定ESCRT-0和泛素（307±14.5μ米) (A类). 为了剖析ESCRT-0中单个UBD的贡献，我们检查了上述突变体组。使两种STAM-UBD失活的突变导致ESCRT-0更频繁地结合泛素（127±3.5μ米)表明Hrs-DUIM与泛素的结合比任一STAM-UBD更紧密(B类). 与这个想法一致，我们发现STAM UIM和VHS结构域结合泛素，亲和力为278±20μ米和549±22μ米分别为(,C和D类;). 在所有四个UBD突变的ESCRT-0复合物未能显示出与泛素的可检测结合(;补充图S2，A类和B类). 这些数据表明，ESCRT-0对泛素的总结合亲和力是每个UBD和泛素之间亲和力的平均值，表明单个泛素分子在复合物中不协同结合。此外，我们的数据表明，ESCRT-0中不太可能存在额外的泛素结合位点，Hrs和STAM的异二聚体最多可以结合总共4个泛素分子。
与STAM中的UBD相比，Hrs DUIM与泛素结合更紧密。 A–D用等温滴定量热法测定泛素与野生型和突变型ESCRT-0的结合动力学。这个顶部面板对应于每次注射泛素（8 m）时释放的原始热量米). 这个底部面板显示了直接从原始热量数据生成并使用等效非相互作用位点模型拟合的结合等温线。每个ESCRT-0复合物和泛素之间的结合亲和力如所示。删除或更改的域以上标文本表示。每个面板中显示的结果代表了至少三个独立实验。
表1
| ESCRT-0复合体 | K（K）d日 | 绑定Ub的站点 |
|---|
| STAM；高分辨率分光计 | 307 ± 14.5 μ米 | VHS、UIM、DUIM（小时和STAM） |
| 压模ΔVHS、UIM卡; 高分辨率分光计杜伊姆 | 无绑定 | 无 |
| 压模ΔVHS、UIM卡; 高分辨率分光计 | 127 ± 3.46 μ米 | DUIM（小时） |
| STAM公司ΔVHS; 高分辨率分光计杜伊姆 | 278 ± 20.1 μ米 | UIM卡（STAM） |
| STAM；高分辨率分光计杜伊姆 | 485 ± 38.6 μ米 | VHS和UIM（STAM） |
| STAM公司UIM卡; 高分辨率分光计杜伊姆 | 549 ± 22.0 μ米 | 车辆健康服务（STAM） |
| STAM公司W29A，UIM卡; 高分辨率分光计杜伊姆 | 无绑定 | 无 |
ESCRT-0与膜结合时发生齐聚反应
ESCRT-0复合物在MVE途径中的货物分拣期间在内胚体膜上发挥作用。使用针对Hrs和STAM的亲和纯化抗体，我们证实这两种蛋白在很大程度上与早期内体标记EEA-1共定位秀丽线虫胚胎(A类和数据未显示）。研究ESCRT-0在膜上的组装及其功能体内，我们使用原子力显微镜（AFM）。重组ESCRT-0由Hrs和STAM的1:1复合物组成，与单层脂质体孵育，单层脂质体吸附在云母表面形成支撑脂质双层。AFM证明ESCRT-0的单个粒子均匀分布在双层中(B类). 在仔细检查这些粒子后，我们发现它们的体积变化很大(,C–E类). 在多次实验中对278个粒子的分析表明，体积分布中有两个主要峰值，第一个峰值在100-150 nm之间三第二次大约是第二次的两倍大（在250–300纳米之间三) (E类). 根据氨基酸组成，Hrs和STAM的1:1异二聚体的分子体积预计为162.3 nm三与第一峰相似。通过推断，第二个峰可能对应于Hrs和STAM的异四聚体，当ESCRT-0与膜结合时形成。此外，我们观察到，相当大比例的剩余颗粒表现出更大的体积，可能对应于Hrs和STAM的低聚物(E类). 这些数据表明，ESCRT-0与膜结合时可以寡聚。
ESCRT-0可以在脂质双层上进行低聚。 A类用Cy2-标记的α-EEA-1对固定在单细胞期的对照胚胎进行染色(右上角)和Cy3标记的α-Hrs抗体(左上角) (n个= 12). 图像是2μm以上采集的三维共焦数据集的最大强度投影。棒材，10μm。胚胎部分高倍视图的彩色叠加如下图所示。Hrs染色如所示红色，EEA-1染色如所示绿色巴，2μm。B类，由磷脂酰胆碱（54%）、磷脂酰乙醇胺（30%）、磷脂基丝氨酸（15%）和磷脂酰肌醇3-磷酸（1%）组成的双层的代表性AFM图像，在ESCRT-0（150 n）存在下组装米). 阴影高度比例尺显示在正确的.巴，200纳米。C，放大8倍装箱区在里面B类.巴，25纳米。D类，分析沿彩色编码线的高度分布，如C.A型蓝线被画在一个体积约为150纳米的粒子上三，并在体积约为300 nm的粒子上画出一条红线三.E类，结合到双层表面的ESCRT-0复合物分子体积的频率分布。显示分析的颗粒总数。观察到两个主要峰值，用彩色编码突出显示箭头.
ESCRT-0是体内Hrs和STAM的异四聚体
确定ESCRT-0是否由Hrs和STAM的多个副本组成体内，我们对天然杂岩进行了一系列水动力学研究。用凝胶过滤色谱法分离整只动物产生的提取物，该色谱法可提供有关分子大小和形状的信息。与重组ESCRT-0复合物类似，天然Hrs和STAM的Stokes半径均为～7.5 nm，这表明ESCRT-0也采用细长构象体内(A类,顶部). 为了确定内源性ESCRT-0的沉降值，秀丽线虫在甘油梯度上分离提取物，并使用Hrs抗体进行免疫印迹。这些研究表明，ESCRT-0的沉降值为9.9 S，显著大于重组复合物的沉降值(B类,顶部; 与…相比D类). 此外，根据这些发现，Hrs和STAM组装成一个～310kDa复合体体内与Hrs和STAM的2:2异四聚体的预测大小相似。
ESCRT-0组装为Hrs和STAM的异四聚体。 A类和B类、野生型（N2）蛋白印迹或压模Δ (ok406号机组)秀丽线虫在100 m存在下制备的胚胎提取物米KCl并在Superose 6凝胶过滤柱上分馏(B类)或10-30%甘油梯度(C). 根据与特征标准的洗脱曲线的比较，计算Hrs的斯托克斯半径和沉降值(n个=2个）。C、从野生型和印章(ok406号机组)突变动物(n个=2个）。加载从对照动物制备的提取物的系列稀释液，以量化不含STAM的每种蛋白质的水平。
为了进一步证实我们的发现，Hrs和STAM形成2:2复合物体内，我们检测了STAM基因缺失的突变动物(ok406号机组). 虽然缺乏STAM的动物表现出较高的胚胎致死率，但约10%的动物能够存活并长大成人。在没有STAM的情况下，Hrs蛋白水平降低了约2倍，表明Hrs的稳定性部分依赖于其与STAM的关联(C). 然而，基于凝胶过滤色谱，无论是否存在STAM，Hrs都保持着较长的构象，斯托克斯半径为6.5 nm(A类,底部). 什么时候？印章Δ突变提取物在甘油梯度上分离，我们发现与对照提取物相比，Hrs的S值（7.1S）降低(B类,底部). 在没有STAM的情况下，通过结合Stokes半径和Hrs的沉积值，我们发现Hrs聚集成一个～200kDa的复合体。完整的ESCRT-0和缺乏STAM的ESCRT-00之间的分子量差异相当于两个STAM分子，这与我们的发现一致，即天然ESCRT-0-由Hrs和STAM的2:2异四聚物组成。此外，这些数据强烈表明Hrs可以自结合形成～200kDa二聚体体内没有STAM。综上所述，我们的研究结果表明，Hrs可以结合自身和STAM来调节异四聚体复合物的形成。
为了进一步表征内源性ESCRT-0的组装，我们还处理了野生型秀丽线虫不同盐浓度的提取物（200–500 m米)并进行了一系列水动力学研究。如前所述，在这些不同的条件下，我们没有检测到免疫沉淀ESCRT-0的组成有任何变化（参见B类). 然而，在存在300或500 m米KCl，我们发现内源性ESCRT-0的沉降值显著降低，并变得与溶液中纯化的重组ESCRT-0s的沉降值相似(A类). 相反，凝胶过滤分析表明，ESCRT-0保留了其细长结构，在这些条件下表现出7.2 nm的斯托克斯半径(B类). 这些数据强烈表明，盐浓度升高足以干扰Hrs和STAM的异四聚体组装，但无法干扰1:1 ESCRT-0络合物的构象。结合我们使用AFM的结果，我们推测ESCRT-0异四聚体的形成可能需要与膜的初始结合，这可能促进Hrs之间的同型相互作用，导致ESCRT-0-齐聚。
ESCRT-0异四聚体的组装对盐浓度升高敏感。 A类，野生型（N2）的蛋白质印迹秀丽线虫200–500 m条件下制备的胚胎提取物米KCl并在10-30%的甘油梯度上分馏。B类，野生型（N2）的蛋白质印迹秀丽线虫500 m条件下制备的胚胎提取物米KCl，并在Superose 6凝胶过滤柱上分馏。根据与特征标准物洗脱曲线的比较，计算了小时的斯托克斯半径和沉降值。
讨论
与ESCRT机械的其他部件不同，ESCRT-0、-I和-II已被证明能形成在溶液中组装的杂聚合物复合物(9). 每个复合物在MVE生物发生的早期阶段都有明确的作用，但对复合物中单个亚单位的相对贡献知之甚少。在这里，我们重点关注ESCRT-0，并确定了其两个组件（Hrs和STAM）的独特属性。使用热力学方法，我们定义了完整ESCRT-0中每个UBD的亲和力，证明Hrs DUIM对泛素的亲和力至少是STAM中UBD的2倍。这些数据表明，Hrs是ESCRT-0中的主要泛素结合蛋白，STAM可能在结合泛素化货物中起辅助作用。此外，我们提供了令人惊讶的新证据，证明ESCRT-0由Hrs和STAM的2:2复合物组成体内与膜的结合在异四聚体复合物的形成中起着重要作用。总之，我们的研究为ESCRT-0在向溶酶体输送内吞蛋白中的作用提供了一个新的模型。
Hrs和STAM有助于以独特的时尚结合泛素化货物
一些研究记录了ESCRT-0 UBD和泛素之间的亲和力。在大多数情况下，已使用SPR，并且仅分析了域。然而，这种方法导致了相互矛盾的结果。人类Hrs的DUIM与泛素结合的亲和力范围为190-450μ米(11,27)，对STAM UIM的研究也同样不一致(13,27). 在一个案例中，Hrs-VHS结构域的分析显示与泛素的结合极其微弱(K（K）d日=1.4米米)而另一项研究表明，在同一区域无法检测到与泛素的结合(12,37). 这种变化可能是所用方法的结果。我们利用了另一种方法，在平衡状态下测量溶液中两种蛋白质之间的亲和力。此外，我们使用完整的ESCRT-0复合体进行了研究，而不是单独表现出非典型性质的单个结构域。根据我们的研究结果，我们认为，鉴于Hrs对泛素的亲和力更高，因此Hrs在结合单和多-联喹啉化底物以进行溶酶体降解方面比STAM发挥更重要的作用。相反，STAM-UBD和泛素之间的亲和力较弱，这表明STAM作为一种辅助蛋白发挥作用，在一些多聚-泛素化底物下调期间，它可能在结合这些底物方面发挥关键作用(27). 与这个想法一致，STAM功能丧失通常比小时丧失更容易被容忍(28,29). 在秀丽线虫例如，Hrs的缺失是致命的，而缺乏STAM的动物是可行的。
我们的研究结果还证实，重组ESCRT-0可以同时结合多达4个泛素分子，并且在该复合物中没有其他UBD等待鉴定。相反，其他后生动物ESCRT复合体中可能存在其他UBD。根据最近的证据，酵母ESCRT-I在其Mvb12p亚基中含有一个附加的UBD(30)，其他ESCRT复合物中可能有其他UBD等待表征。为了最终解决这个问题，有必要分析完整的ESCRT-I或-II与泛素之间的相互作用。
ESCRT-0与膜结合时发生齐聚反应
我们的研究结果表明，重组秀丽线虫ESCRT-0与人类ESCRT-0一样，在溶液中形成Hrs和STAM的1:1复合物。然而，大多数ESCRT-0定位于内胚层膜上体内利用原子力显微镜（AFM），我们发现重组ESCRT-0在与膜结合时可以发生齐聚反应，以1:1异二聚体和2:2异四聚体等比例组装。尽管在我们纯化ESCRT-0的过程中存在2种细菌热休克蛋白，但两种污染物都没有与膜结合在体外(补充图S3)，强烈表明在我们的AFM研究中，Hrs和STAM是唯一与支持的脂质双层相关的蛋白质。
为了证实ESCRT-0可以组装成Hrs和STAM的异四聚体，我们检查了内源性复合物，发现其天然分子量为～310kDa，与2:2复合物的形成一致。然而，以前的研究表明，Hrs和STAM都可以与其他几种蛋白质结合，这可能是该复合物意外大量存在的原因。STAM已被证明与多种去泛素酶和泛素连接酶相互作用，这可能有助于调节货物进入MVE的分拣效率(31,32). Hrs与氯氰菊酯向MVE的补充有关，MVE可能具有将货物保留在早期内体微域内的功能(14,33). 在人类细胞中，Hrs还与Eps15b相互作用，Eps15是一种缺乏EH结构域并调节受体贩运的内胚定位亚型(34). 在每一种情况下，相互作用是暂时的还是稳定的尚不清楚。天然形式和重组形式的人类Hrs和STAM的凝胶过滤图谱显示相似，表明内源性ESCRT-0仅由Hrs和STAM组成(12). 我们的凝胶过滤研究使用秀丽线虫Hrs和STAM亚型证实了这些结果。然而，与重组复合物相比，内源性ESCRT-0的沉降值明显更大，这表明ESCRT-01不是Hrs和STAM的1:1复合物体内相反，根据我们的数据，我们建议ESCRT-0包含每个亚单位的两个副本。与这个想法一致，我们发现ESCRT-0从印章Δ突变动物表现出相当于两个STAM分子的质量损失。此外，这些数据表明，在没有STAM的情况下，Hrs存在一个二聚体，能够维持足够的ESCRT-0功能秀丽线虫生存能力。以前的研究表明Hrs-FYVE结构域可以进行二聚化，从而在内胚层膜中对PI3P具有更高的亲和力，这一发现得到了支持(35,36).
最近另一项研究表明，在没有STAM的情况下纯化的重组Hrs可能会形成六聚体，再次支持了Hrs可以自我结合的观点(37). 我们未能观察到从中提取的提取物中Hrs六聚体的形成印章Δ动物。然而，我们的AFM研究表明，ESCRT-0可以在脂质双层上齐聚。Hrs的同型结合可能促进先前在人类细胞中观察到的内体微结构域的形成(33). 内体膜的这些区域可能表现出增强的ESCRT-I、-II和-III组装，最终驱动MVE的形成。有必要进行进一步的研究，以确定Hrs内介导自结合的精确位点，以确定内体上微结构域的形成是否需要Hrs多重聚合。
MVE生物发生过程中货物分类的修正模型
已经提出了几个模型来描述ESCRT机器如何招募泛素化货物沉积到MVE内的腔泡中(三). 在“传送带模型”中，货物依次从ESCRT-0复合体传送到ESCRT-I，然后是ESCRT-II(三). 虽然每个复合物包含至少一个能与泛素结合的亚单位，但泛素与ESCRT-I亚单位Tsg101的UEV结构域之间的低亲和力相互作用（～510μ米)不支持从ESCRT-0进行货物运输的想法(38). 对酵母的研究表明，ESCRT-0、-I和-II中的UBD可以合作有效地对泛素化货物进行分类，从而可能组装成ESCRT机器的“超级复合体”(30,39). 然而，早期作用的ESCRT复合物是否在内胚体膜上共同组装成更大的复合物尚待证实。基于我们的数据，我们提出了一个替代模型，其中ESCRT-0在货物运输到MVE过程中起主要的多价泛素结合因子的作用(). 通过在内胚体膜上进行寡聚化，ESCRT-0将几个UBD聚集在一起，亲和力高达127μ米，这可能足以进行货物隔离和集中。随后，ESCRT-I和ESCRT-II在囊泡形成中发挥作用，而ESCRT-III负责囊泡断裂(40). 还需要进行额外的工作来全面剖析这一途径，并准确确定与ESCRT-0相关的货物如何释放到腔泡中，最终在溶酶体腔中降解。
描述ESCRT-0在内胚层膜上货物募集和浓度中作用的模型。根据我们的研究结果，我们推测Hrs:STAM与内胚体膜的结合促进了Hrs分子之间的同型相互作用，从而导致ESCRT-0寡聚化。ESCRT-0的大部分似乎由Hrs和STAM的异源四聚体组成，它们可以同时与多种泛素化货物结合，可能导致货物在内胚体膜的微域内聚集。
致谢
我们感谢Enfu Hui博士（加州大学旧金山分校）在进行热力学测量方面的帮助。我们也感谢Audhya实验室的成员批判性地阅读这份手稿并提供技术援助。
三使用的缩写如下：
- 电子顺磁共振成像
- 运输所需的内胚体分选复合体
- 杜伊姆
- 双泛素相互作用基序
- ILV公司
- 腔内小泡
- 国际贸易中心
- 等温滴定量热法
- MVE公司
- 多泡内体
- SPR公司
- 表面等离子体共振
- UBD公司
- 泛素结合域
- UIM卡
- 泛素相互作用基序
- 车辆健康服务
- Vps27/小时/标准。
参考文献
1Raiborg C.、Stenmark H.（2009）自然 458, 445–452 [公共医学][谷歌学者] 2Saksena S.、Emr S.D.（2009）生物化学。社会事务处理。 37, 167–172 [公共医学][谷歌学者] 4.Katzmann D.J.、Odorizzi G.、Emr S.D.（2002）自然修订版分子细胞生物学。 三, 893–905 [公共医学][谷歌学者] 6Katzmann D.J.、Babst M.、Emr S.D.（2001）单元格 106, 145–155 [公共医学][谷歌学者] 7Bilodeau P.S.、Urbanowski J.L.、Winistorer S.C.、Piper R.C.（2002）自然细胞生物学。 4, 534–539 [公共医学][谷歌学者] 8Alam S.L.、Sun J.、Payne M.、Welch B.D.、Blake B.K.、Davis D.R.、Meyer H.H.、Emr S.D.、Sundquist W.I.（2004）EMBO J。 23, 1411–1421[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 10Mizuno E.、Kawahata K.、Kato M.、Kitamura N.、Komada M.（2003）分子生物学。单元格 14, 3675–3689[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 11Hirano S.、Kawasaki M.、Ura H.、Kato R.、Raiborg C.、Stenmark H.、Wakatsuki S.（2006）自然结构。分子生物学。 13, 272–277 [公共医学][谷歌学者] 12Ren X.、Kloer D.P.、Kim Y.C.、Ghirlando R.、Saidi L.F.、Hummer G.、Hurley J.H.（2009）结构 17, 406–416[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 13.Fisher R.D.、Wang B.、Alam S.L.、Higginson D.S.、Robinson H.、Sundquist W.I.、Hill C.P.（2003）生物学杂志。化学。 278, 28976–28984 [公共医学][谷歌学者] 14Raiborg C.、Bache K.G.、Mehlum A.、Stang E.、Stenmark H.（2001）EMBO J。 20, 5008–5021[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 15Mizuno E.、Kawahata K.、Okamoto A.、Kitamura N.、Komada M.（2004）生物化学杂志。 135, 385–396 [公共医学][谷歌学者] 16小林H.、田中N.、浅草H.、三浦S.、九尾M.、三村K.、石井N.、杉木K.（2005）生物学杂志。化学。 280, 10468–10477 [公共医学][谷歌学者] 17Cheeseman I.M.、Niessen S.、Anderson S.、Hyndman F.、Yates J.R.I.、Oegema K.（2004）基因发育。 17, 2255–2268[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 18Audhya A.、McLeod I.X.、Yates J.R.、Oegema K.（2007）普洛斯一号 2，e956。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 19.Sato M.、Sato K.、Fonarev P.、Huang C.J.、Liou W.、Grant B.D.（2005）自然细胞生物学。 7, 559–569[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 20Siegel L.M.，Monty K.J.（1966年）生物芯片。生物物理学。学报 112, 346–362 [公共医学][谷歌学者] 21Hong Y.H.、Ahn H.C.、Lim J.、Kim H.M.、Ji H.Y.、Lee S.、Kim J.H.、Park E.Y.、Song H.K.、Lee B.J.（2009）FEBS信函。 583, 287–292 [公共医学][谷歌学者] 22Takata H.、Kato M.、Denda K.、Kitamura N.（2000）基因细胞 5, 57–69 [公共医学][谷歌学者] 23Asao H.、Sasaki Y.、Arita T.、Tanaka N.、Endo K.、Kasai H.、Takeshita T.、Ento Y.、Fujita T.和Sugamura K.（1997）生物学杂志。化学。 272, 32785–32791 [公共医学][谷歌学者] 24Dam T.K.、Torres M.、Brewer C.F.、Casadevall A.（2008）生物学杂志。化学。 283, 31366–31370[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 25Wiseman T.、Williston S.、Brandts J.F.、Lin L.N.（1989）分析。生物化学。 179, 131–137 [公共医学][谷歌学者] 26Turnbull W.B.、Daranas A.H.（2003）JACS公司 125, 14859–14866 [公共医学][谷歌学者] 28Chanut-Delalande H.、Jung A.C.、Baer M.M.、Lin L.、Payre F.、Affolter M.（2010）公共科学图书馆一号。 5，e10245。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 29Katzmann D.J.、Stefan C.J.、Babst M.、Emr S.D.（2003）《细胞生物学杂志》。 162, 413–423[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 30Shields S.B.、Oestreich A.J.、Winistorer S.、Nguyen D.、Payne J.A.、Katzmann D.J.、Piper R.（2009）《细胞生物学杂志》。 185, 213–224[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 31Clague M.J.，UrbéS.（2006年）趋势细胞生物学。 16, 551–559 [公共医学][谷歌学者] 32Ren J.、Kee Y.、Huibregtse J.M.、Piper R.C.（2007）分子生物学。单元格 18, 324–335[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 33.Raiborg C.、Bache K.G.、Gilloly D.J.、Madshus I.H.、Stang E.、Stenmark H.（2002）自然细胞生物学。 4, 394–398 [公共医学][谷歌学者] 34Roxrud I.、Raiborg C.、Pedersen N.M.、Stang E.、Stenmark H.（2008）《细胞生物学杂志》。 180, 1205–1218[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 35Mao Y.，Nickitenko A.，Duan X.，Lloyd T.E.，Wu M.N.，Bellen H.，Quiocho F.A.（2000）单元格 100, 447–456 [公共医学][谷歌学者] 36Hayakawa A.、Hayes S.J.、Lawe D.C.、Sudharshan E.、Tuft R.、Fogarty K.、Lambright D.、Corvera S.（2004）生物学杂志。化学。 279, 5958–5966 [公共医学][谷歌学者] 37Pullan L.、Mullapudi S.、Huang Z.、Baldwin P.R.、Chin C.、Sun W.、Tsujimoto S.、Kolodziej S.J.、Stoops J.K.、Lee J.C.、Waxham M.N.、Bean A.J.、Penczek P.A.（2006）结构 14, 661–671 [公共医学][谷歌学者] 38Garrus J.E.、von Schwedler U.K.、Pornillos O.W.、Morham S.G.、Zavitz K.H.、Wang H.E.、Wettstein D.A.、Stray K.M.、CéM、Rich R.L.、Myszka D.G.、Sundquist W.I.（2001）单元格 107, 55–65 [公共医学][谷歌学者] 
