谷氨酰胺酶抑制剂优先减缓IDH1突变胶质瘤细胞的生长

摘要

介绍

尽管有氧气，但癌细胞表现出较高的糖酵解速率和增加的乳酸生成，这被称为Warburg效应或有氧糖酵化，而不是高氧化磷酸化。在过去的十年中，癌基因（MYC、PI3K、RAS和AKT）和抑癌基因（VHL和p53）被证明可以重新编程癌细胞代谢为有氧糖酵解(1,2). 癌细胞也消耗谷氨酰胺作为能量或碳骨架或氮供体(三,4). 最近，发现癌基因MYC可诱导线粒体生物生成并增加谷氨酰胺代谢，表明MYC同时刺激有氧糖酵解和谷氨酰胺氧化(5).

在发现异柠檬酸脱氢酶1（IDH1）和2（IDH2）突变之前，导致HIF-1α稳定和遗传性癌症综合征的琥珀酸脱氢酶（SDH）和富马酸水合酶（FH）突变是唯一已知的代谢酶致癌突变。IDH1和IDH2突变经常发生在恶性低级别胶质瘤、继发性胶质母细胞瘤和急性髓细胞白血病（AML）中(2,6–8). 这些发现强调了代谢改变在肿瘤发生中的重要性，并提示了以基因改变的癌症代谢为靶点的可能性。

虽然野生型（WT）IDH1将异柠檬酸盐和NADP+转化为α-酮戊二酸盐（α-KG）和NADPH，但IDH1和IDH2中突变的氨基酸位于催化囊中，导致新酶活性：α-KG+NADPH→D-2-羟基戊二酸（2-HG）+NADP⁺(9). 迄今为止，在胶质瘤和急性髓细胞白血病中仅在R132残基中发现IDH1突变，该残基最常突变为组氨酸(7). 在R140和R172都发现了IDH2的突变(10). 所有已记录的IDH1或IDH2突变都能从α-KG中产生2-HG(9,10).

虽然IDH1突变在肿瘤发生中的作用尚未确定，但IDH1变异引起的酶功能变化可能有助于肿瘤的形成。IDH1 WT功能丧失导致NADPH生成减少，再加上2-HG水平增加可能导致氧化应激(11,12). 其次，2-HG干扰电子传递链，并可能改变线粒体生理学，推动细胞有氧糖酵解(13). 由于2-HG和α-KG的结构相似，2-HG也可能干扰利用α-KG的酶的功能（例如组蛋白脱甲基酶）。最后，2-HG是在先天性代谢错误（L-2或D-2-羟基戊二酸尿）中产生的，其中代谢2-HG（L-或D-2-羟戊二酸脱氢酶）的酶是非功能性的(14,15). 据记载，患有L-2-羟基戊二酸尿症的患者会发展成胶质瘤(16)但在D-2-羟基戊二酸尿症患者（突变型IDH1/2产生的对映体）中没有。

目前尚不清楚阻断IDH1突变活性是否是一种有效的治疗方法，特别是如果突变蛋白仅参与肿瘤的发生。然而，由于突变型IDH1肿瘤需要α-KG产生2-HG，因此它们可能容易受到α-KG稳态改变的影响。已经证明2-HG主要来源于谷氨酰胺(图1) (9). 谷氨酰胺被谷氨酰胺酶水解生成谷氨酸，谷氨酸随后转化为α-KG。α-KG随后被突变型IDH1转化为2-HG。因此，我们试图确定抑制谷氨酰胺酶是否会扰乱α-KG体内平衡，并在携带IDH1突变酶的癌细胞中产生选择性反应。

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图1

显示谷氨酰胺和抑制剂靶点产生2-HG的途径。

材料和方法

使用标准技术将R132H突变引入使用6X-His-tag工程的人类IDH1，并产生包含WT或突变IDH1的慢病毒。用病毒转导D54细胞或转化的正常人星形胶质细胞（TNA），用有限稀释法从单个细胞中培养出细胞系。使用6X-His标签抗体（Millipore）证实了0.04µg/mL多西环素对IDH1的反应。如前所述进行LC/MS(9). siRNA用于敲除谷氨酰胺酶，并使用蛋白质印迹法评估细胞的敲除情况(5). 按照DMSO或BPTES处理后的描述，使用alamarBlue进行细胞生长分析(17). 用二甲基亚砜或BPTES处理后，通过培养细胞提取物和[^三H] -谷氨酰胺。[^三H] -谷氨酸通过阴离子交换从反应混合物中分离出来，并使用闪烁计数器进行测量。治疗48小时后检测BPTES的所有效果。数据采用双尾学生t检验进行评估。p值≤0.05被认为是显著的。详细材料和方法如下补充信息.

结果

目前，还没有报道已建立的胶质母细胞瘤细胞系具有IDH1或IDH2突变，我们试图从IDH1突变患者身上获得细胞系，但未能成功。因此，我们建立了tet诱导的、稳定的D54胶质母细胞瘤细胞系，该细胞系过度表达WT或R132H IDH1(图2A). 与过度表达WT IDH1和亲代D54细胞的细胞相比，R132H IDH1的表达分别使总IDH活性降低50%和25%(补充图1). 该观察结果证实了细胞培养模型和胶质母细胞瘤切片中IDH活性降低(7,11,18). 与表达WT IDH1的细胞相比，突变IDH1细胞中的2-HG水平升高，而α-KG水平没有显著差异(图2B和2C).

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图2

Tet-诱导的稳定D54胶质母细胞瘤株的验证。A.蛋白质印迹显示多西林诱导6X-His-Tag-IDH1表达。B.2-羟基戊二酸LC/MS保留峰。C.通过LC/MS测量的2-HG和α-KG水平。

之前的研究表明突变型IDH1消耗的α-KG来自谷氨酰胺(图1) (9)，我们用siRNA靶向谷氨酰胺酶，以确定突变IDH1细胞与WT IDH1相比是否表现出生长下降。抗谷氨酰胺酶的siRNA特异性减缓突变IDH1细胞的生长，但不减缓亲代细胞或过度表达野生型IDH1的细胞的生长(图3A). 与谷氨酰胺酶抑制剂BPTES（双-2-（5-苯基乙酰氨基-1,2,4-噻二唑-2-基）乙基硫醚）抗谷氨酰胺酶siRNA的作用一致(19)，优先减缓突变IDH1细胞的生长而不诱导凋亡(图3B,补充图2和三). 我们还用BPTES处理过表达R132H或WT IDH1的TNA，发现突变IDH1细胞对BPTES也更敏感(补充图4).

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图3

突变IDH1细胞依赖谷氨酰胺酶进行细胞生长，谷氨酰胺酶的抑制作用被二甲基-α-酮戊二酸所抵消。A.抗谷氨酰胺酶siRNA（siGLS）减缓突变IDH1细胞的生长。Western blot显示谷氨酰胺酶水平降低是对siGLS的反应。B.在不存在或存在1mM二甲基-α-酮戊二酸的情况下，测量BPTES的影响。B显示了三个具有类似趋势的代表性实验，以及每个浓度下四个重复的平均值和SEM*对应于p值≤0.05。对于A，p值是相对于siCont的siGLS。细胞数量标准化到第0天。对于B，与D54和D54+WT IDH1相比，D54+R132H的p值为。折叠生长表示处理细胞的阿拉玛蓝荧光单位与载体处理细胞的比率。

然后，我们试图恢复BPTES处理的细胞中的α-KG水平，以确定这是否会抑制生长。细胞暴露于二甲基-α-酮戊二酸（一种细胞可渗透的α-KG前体）显著降低BPTES对突变IDH1细胞的生长抑制(图3B,补充图2). 这些观察结果表明，突变IDH1细胞中的谷氨酰胺酶抑制降低了α-KG水平，可能改变中间代谢，从而抑制细胞增殖。然而，1 mM二甲基-α-酮戊二酸不能阻止较高浓度的BPTES的作用。尽管原因尚不清楚，但1 mM二甲基-α-酮戊二酸可能不足以缓解50或100µM的影响，或者BPTES在较高浓度下可能具有额外的生长抑制作用。

10µM BPTES显著降低WT和突变IDH1表达细胞中的谷氨酰胺酶活性（分别抑制59%和68%）(图4A). 与谷氨酰胺酶活性降低一致，BPTES处理降低了谷氨酸和α-KG水平。α-KG的降低导致随后的TCA循环中间体（琥珀酸和苹果酸）以及天冬氨酸的减少，天冬氨酸是由草酰乙酸与谷氨酸作为氮供体的转氨作用产生的。令人惊讶的是，在经过处理的突变IDH1细胞中，2-HG水平保持不变(图4B,补充图5). 然而，随着BPTES处理，糖酵解中间产物（果糖-1,6-二磷酸、二羟基丙酮磷酸和3-磷酸甘油酯）的水平增加，表明糖酵化通量发生了改变。有趣的是，在BPTES治疗前后，WT和IDH1突变细胞的柠檬酸水平发生了截然相反的变化。与BPTES处理后降低的WT IDH1细胞的较高基础水平相比，处理后突变IDH1的基础柠檬酸水平较低，但有所增加(图4C).

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图4

突变型IDH1过度表达和使用10µM BPTES治疗48小时导致代谢变化。在WT和突变IDH1细胞中测量谷氨酰胺酶活性（A）和谷氨酸、α-KG和2-HG水平（B）。C.使用LC/MS测量其他代谢物水平，以应对BPTES治疗。对于B和C，*表示p值≤0.05。p值为D54 WT IDH1 DMSO与10µM BPTES或D54 R132H IDH1 DMSO与10µM BPTES。

为了进一步证明突变型IDH1细胞对抑制α-KG合成的敏感性，我们抑制了将谷氨酸转化为α-KG的酶。突变型IDH2细胞对谷氨酸脱氢酶抑制剂表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）和泛转氨酶抑制剂氨基氧乙酸（AOA）更敏感。然而，为了观察EGCG和AOA的作用，需要降低培养基中的葡萄糖浓度，这表明糖酵解代偿的减少对于揭示突变IDH1细胞对这些抑制剂的敏感性是必要的(补充图6). 突变IDH1细胞对谷氨酰胺缺乏的敏感性不高于WT细胞(补充图7). 尽管如此，获得突变IDH1活性似乎足以使细胞对α-KG合成的抑制敏感。

讨论

目前正在开发针对癌细胞代谢各个方面的治疗方法，主要侧重于葡萄糖代谢(2). 癌症细胞对谷氨酰胺的依赖性在各种过程中都有很好的记录(2–4)也是治疗的目标；然而，由于谷氨酰胺类似物缺乏疗效或不良副作用，临床试验收效甚微(2,4). 在这里，我们探索了谷氨酰胺代谢抑制剂BPTES，其变构抑制谷氨酰胺酶（GLS，但不是GLS2），并且不是谷氨酰胺类似物(19). 具体而言，我们研究了IDH1突变的癌细胞对谷氨酰胺酶活性的依赖性，以维持α-KG内环境稳定。

IDH1突变的发现(6)在大部分胶质瘤和细胞遗传学正常的急性髓性白血病中发现代谢基因改变(6,8). 从遗传学角度来看，IDH1杂合突变在单个残基上的聚集表明是一种获得功能的突变，该突变由突变IDH1获得的新酶活性支持。突变型IDH1不是将异柠檬酸转化为α-KG，而是消耗α-KG并产生2-HG。研究表明，谷氨酰胺是突变型IDH1消耗的α-KG的细胞来源(9). 目前尚不清楚抑制突变型IDH1和减少2-HG的产生是否具有治疗作用，因为突变型IDH2或2-HG在肿瘤维持中的作用尚未确定。因此，我们试图通过抑制谷氨酰胺酶来减缓突变IDH1细胞的生长。

在此，我们证明，BPTES抑制谷氨酰胺酶活性，从而降低突变和WT IDH1细胞中的谷氨酸和α-KG水平，但只有突变IDH1的细胞生长会因BPTES处理而优先减缓。有趣的是，BPTES治疗与糖酵解中间产物升高有关，这可能反映了糖酵化的代偿性增加，以产生α-KG并维持体内平衡。谷氨酰胺酶抑制扰乱α-KG稳态并导致生长抑制的观点得到了使用膜可渗透的α-KG前体的拯救实验的支持。此外，抑制将谷氨酸转化为α-KG的酶对突变IDH1细胞具有选择性，但仅在葡萄糖缺乏的条件下。然而，突变的IDH1细胞并不比WT IDH1更容易受到谷氨酰胺缺乏的影响，完全提取谷氨酰胺最终会减缓任何需要谷氨酰胺作为必需营养素的细胞的生长。这一结果增加了以下可能性：与抑制谷氨酰胺摄取相比，抑制谷氨酰胺酶对IDH1突变细胞可能具有不同的治疗效果。

我们的代谢组学研究揭示了一些有趣的发现。尽管BPTES处理降低了谷氨酸和α-KG水平，但2-HG水平没有显著降低。因此，如果2-HG与α-KG竞争α-KG-依赖酶上的结合位点，那么在BPTES处理中，α-KG与这些位点的占有率将下降。虽然这种作用在野生型细胞中可能并不显著，其中α-KG可能占据了大多数位点，但在BPTES处理表达突变IDH1的细胞时，它可能会导致细胞生长受损。其次，BPTES处理降低了随后的TCA循环中间产物，琥珀酸和苹果酸。此外，糖酵解中间体水平增加，表明代谢受到干扰，甚至远离TCA循环。我们假设糖酵解中间产物增加是因为糖酵化通量增加，以补偿α-KG水平降低；然而，我们并没有排除中间产物因糖酵解通量减少而形成的可能性。一个有趣的观察结果是，经过处理的WT和R132H IDH1细胞之间柠檬酸水平的变化截然相反。目前，这些差异的原因尚未完全理解，对这些机制的剖析超出了本文的范围。尽管如此，WT和突变IDH1细胞之间的中间代谢差异足以激发突变IDH2细胞对谷氨酰胺酶抑制的敏感性增加。

虽然谷氨酰胺酶活性在突变型IDH1细胞中显著降低，但BPTES对生长的影响不大（约20%生长降低）。适度的生长减少并不特别令人惊讶，因为D54细胞具有遗传背景，可以耐受siRNA介导的谷氨酰胺酶水平的显著降低。然而，突变型IDH1的简单过表达足以改变中间代谢，使突变型IDH2细胞对谷氨酰胺酶的抑制敏感。我们推测，具有自然发生的IDH1突变的神经胶质瘤细胞将表现出对谷氨酰胺酶抑制的易感性增加；然而，目前尚不存在这样的细胞系。

此外，细胞代谢具有令人难以置信的动态性，似乎可以补偿BPTES治疗后中间代谢的变化，如糖酵解增加。因此，我们认为抑制谷氨酰胺酶作为单臂疗法将不会有效，但它将是可能涉及同时抑制糖酵解的更复杂策略的一部分。

与所有治疗方法一样，这种治疗策略可能存在潜在的缺点，因为用突变型IDH1或IDH2构建的胶质母细胞瘤细胞可能具有假缺氧表型(18). 先前的研究表明，外源性α-KG可以重新激活脯氨酰羟化酶，降低HIF-1α水平，并抑制SDH和FH突变引起的假性缺氧导致的细胞生长(20). 因此，通过抑制谷氨酰胺酶降低α-KG可能会增强假缺氧并有利于肿瘤生长。

我们的研究表明，谷氨酰胺酶可能是突变IDH1癌细胞的潜在治疗靶点。然而，还需要进一步研究突变IDH1细胞对谷氨酰胺酶抑制的代谢后果和生化特异性。了解这些影响将有助于开发联合疗法，以增强谷氨酰胺酶抑制的效果，并提供IDH1突变和2-HG生成如何影响细胞生理学的见解。

补充材料

致谢

脚注

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