肝再生需要来自窦内皮的诱导性血管分泌信号

在胚胎发生过程中，内皮细胞在循环发育之前诱导器官发生^1-4这些发现表明，内皮细胞不仅形成被动导管来输送营养和氧气，而且还建立了一个有指导意义的血管生态位，通过分泌旁分泌营养原刺激器官再生，其方式类似于支持造血的内皮细胞衍生的血管分泌因子^5-7然而，组织特异性内皮细胞亚群促进成人器官发生的确切机制尚不清楚。在这里，我们证明肝窦内皮细胞（LSEC）构成了一个独特的表型和功能定义的VEGFR3群体⁺CD34型⁻血管内皮生长因子2⁺VE-卡德林⁺因子VIII⁺CD45型⁻内皮细胞通过释放血管分泌营养因子，启动并维持70%肝部分切除术（PH）诱导的肝再生。PH后，残留的肝血管保持完整，没有缺氧或结构损伤，这有助于研究生理性肝再生。利用该模型，我们发现LSEC中VEGF-A受体-2（VEGFR2）的诱导性基因消融通过抑制EC特异性转录因子的上调，损害了肝细胞增殖的初始爆发（PH后1-3天）和随后肝血管团的重建（PH之后4-8天）标识1因此，标识1-由于LSEC衍生的血管分泌因子（包括肝细胞生长因子（HGF）和Wnt2）的表达减少，缺陷小鼠在整个肝脏再生过程中也表现出缺陷。值得注意的是，在在体外共培养，LSEC中VEGFR2-Id1激活刺激肝细胞增殖。事实上，脾内移植标识1^+/+或标识1^−/−用Wnt2和HGF转导的LSEC(标识1^−/−重量2⁺HGF公司⁺LSEC）在肝窦中重建诱导性血管龛标识1^−/−小鼠，启动和恢复肝血管再生。因此，在生理性肝再生的早期阶段，VEGFR2-Id1通过释放血管分泌因子Wnt2和HGF介导LSEC中的诱导血管生成，从而刺激肝脏增殖。随后，VEGFR2-Id1依赖性增殖性血管生成重建肝脏肿块蔬菜2⁺标识1⁺重量2⁺HGF公司⁺含肝细胞的LSEC提供了实现持久肝再生的有效策略。

窦状内皮细胞（SECs）组成一个结构和功能独特的毛细血管网络，为特定器官（包括骨髓（BM）和肝脏）提供血管。在成年小鼠中，BM SECs通过表达特定的血管分泌营养因子，如Notch配体，支持造血再生^5-7类似地，肝脏循环主要由肝脏SECs（LSEC）组成^8-10每一个肝细胞都位于LSEC的细胞附近。然而，缺乏肝脏内皮细胞的表型和操作定义，并且缺乏相关的小鼠血管生成基因模型^11-13阻碍了LSEC在肝脏再生调节中作用的研究^14-18.

在这里，我们使用一个生理相关的PH模型来阐明LSEC在介导肝再生中的指导作用(补充图1). 与肝毒性化学品的使用相反，肝毒性化学品会损害LSEC的组织，并导致组织缺氧、细胞死亡和炎症(补充图2)^8,13,19在PH模型中，切除70%的肝脏肿块而不影响残留肝血管的完整性¹¹激活肝细胞再生^15-17因此，该模型为研究结构和功能完整的LSEC在支持肝再生中的作用提供了一个指导性模型。

由于VEGF家族在BM SEC的再生中起着关键作用⁶，我们假设VEGF受体^20-22，包括VEGFR2或VEGFR3也调节LSEC功能。使用VEGFR2-GFP（血管内皮生长因子受体2）在GFP表达由VEGFR2天然启动子驱动的小鼠中，我们证明VEGFR2和VEGFR3只在肝内皮细胞中表达，而不在其他肝细胞类型中表达，包括肝细胞核因子4α（HNF4A）⁺肝细胞(图1a,补充图3). 值得注意的是，VEGFR3表达的分布仅限于VEGFR2⁺从CD34分支出来的LSEC⁺血管内皮生长因子3⁻大型船舶(图1b). 非实质细胞（NPCs）的多变量流式细胞术分析显示非造血VEGFR3上EC特异性标记物VE-cadherin的表达⁺血管内皮生长因子2⁺CD45型⁻LSEC，其中97.6%为非淋巴（Prox1⁻CD34型⁻)²²表达凝血因子VIII的内皮细胞(图1c、d). 因此，我们将成年小鼠LSEC的独特表型和操作特征指定为VEGFR3⁺CD34型⁻血管内皮生长因子2⁺VE钙粘蛋白⁺因子VIII⁺Prox-1传感器⁻CD45型⁻血管，将其与VEGFR3区分开来⁻CD34型⁺血管内皮生长因子2⁺VE-卡德林⁺CD45型⁻非正弦EC和VEGFR3⁺CD34型⁺Prox-1传感器⁺因子VIII⁻CD45型⁻淋巴EC。将LSEC识别为VEGFR3⁺CD34型⁻和非正弦EC作为VEGFR3⁻CD34型⁺足以对LSEC进行定量、纯化和分子分析。

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图1

LSEC在70%肝部分切除术（PH）诱导的生理性肝再生中的表型特征和作用

一)从VEGFR2-GFP报告小鼠获得的肝脏切片⁶在肝再生过程中，VEGFR2只在肝内皮细胞上表达。b）VEGFR3在LSEC上的限制表达，但不在CD34上⁺大血管或肝细胞。c）肝非实质细胞的多变量流式细胞术分析。血管内皮生长因子2⁺CD45细胞⁻，表达EC特异性VE-cadherin。d日)VEGFR3在VEGFR2上的特异表达⁺VE-卡德林⁺CD45型⁻LSEC，主要成分为CD34⁻因子VIII⁺Prox-1传感器⁻因此，LSEC可被识别为VEGFR3⁺CD34型⁻细胞。e）PH后48小时，E-cadherin⁺P-H3型⁺有丝分裂的肝细胞位于VE粘附素附近⁺和VEGFR2⁺EC。f、 g）肝再生过程中LSEC扩张（f）和肝细胞有丝分裂（g）的动力学(n个= 4). 高功率场。比例尺，50μm。误差线，s.e.m。

为了确定LSEC调节肝细胞增殖的机制，我们研究了PH后肝细胞和LSEC的再生动力学。PH后2天，用VE-卡德林、肝细胞标记物上皮（E）-钙粘蛋白和有丝分裂标记物磷酸化-己烯-3（P-H3⁺E-钙粘蛋白⁺有丝分裂肝细胞位于非增殖LSEC附近(图1e). 然而，LSEC的增殖在PH后第4天开始，第8天趋于稳定(图1f,补充图4). 相比之下，P-H3的定量⁺HNF4A型⁺肝细胞显示，肝细胞增殖率在前4天达到峰值，而在第8天趋于稳定(图1g). 这些结果表明，LSEC在介导肝脏重建中具有时间上的双相贡献。在PH早期（PH后1-3天），非增殖LSEC中的诱导血管生成可能通过释放血管分泌因子刺激肝脏再生，而PH后4天，再生肝脏的血供增加需求通过LSEC的增殖血管生成来满足。

为了研究VEGF受体在LSEC驱动的肝再生过程中的意义，我们设计了实验，有条件地删除血管内皮生长因子2杂交基因血管内皮生长因子2^{液氧磷/液氧磷}带有ROSA-CreER公司^T2段产生可诱导VEGFR2缺陷的小鼠，血管内皮生长因子2^{flox/flox公司}(蔬菜2^{飞行/飞行})老鼠(补充图5)⁶由于VEGFR2在肝脏中的EC特异性表达血管内皮生长因子2^{飞行/飞行}小鼠只有肝脏内皮细胞而非非内皮细胞会出现功能缺陷。作为对照，我们使用了杂合性缺失血管内皮生长因子2基因(血管内皮生长因子2^{佛罗里达州/+}). PH后48小时，溴脱氧尿苷⁺肝细胞增殖⁺HNF4A型⁺细胞数量）减少了67%血管内皮生长因子2^{飞行/飞行}老鼠(图2a、b). 值得注意的是，尽管VE-cadherin具有专利性⁺隔离素⁺在早期灌注血管时，肝块的再生减弱血管内皮生长因子2^{飞行/飞行}老鼠(图2c). 因此，在肝再生的早期阶段（PH第1-3天），以VEGFR2为靶点主要损害内皮细胞衍生血管分泌因子诱导肝细胞再生的作用，而不是血管灌注能力。

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图2

LSEC中VEGFR2-Id1激活介导PH诱导的肝再生

a、 b）PH受损后肝细胞增殖血管内皮生长因子2^{飞行/飞行}老鼠(n个= 5).c-e）抑制肝组织再生（c）和功能性VE-卡德林⁺异凝集素⁺血管形成（d，e）in血管内皮生长因子2^{飞行/飞行}PH后小鼠(n个= 4-6).f、 g）注射VEGF-A₁₆₄，但不是VEGFR1特异性配体PlGF，可加速肝块（f）的再生，与VEGFR3的增加相关⁺CD34型⁻LSEC编号（g）(n个= 4).h）再生肝切片同上^静脉YFP鼠标²⁴.标识1VE-cadherin中的PH选择性上调⁺船只。i）VEGFR2缺失减少标识1再生肝的上调(n个= 5). *P（P）< 0.05; #P（P）<0.01，与血管内皮生长因子2^{佛罗里达州/+}（b-e，i），与PlGF治疗组（f）比较。比例尺，50μm。误差线，s.e.m。

然而，在蔬菜2^{飞行/飞行}小鼠在肝再生的后期（PH第4-8天），增殖性血管生成也有缺陷(图2c)干扰专利VE-cadherin的组装⁺异凝集素⁺脉管系统(图2d，e)从而使肝脏肿块恢复迟缓至少28天(补充图5). 此外，在血管内皮生长因子2^{飞行/飞行}小鼠，PH后肝功能异常，表现为血浆胆红素水平升高。为了证实内皮细胞特异性VEGFR2在介导肝再生中的作用，血管内皮生长因子2^{液氧磷/液氧磷}小鼠也与VE-粘合剂-冷却器^T2段诱导VEGFR2 EC-选择性缺失的小鼠(补充图5). 肝脏质量和灌注血管的形成VE-粘合剂-冷却器^T2段血管内皮生长因子2^{飞行/飞行}PH后小鼠肝组织中VEGFR2含量降低，这表明VEGFR2在介导肝再生中的重要性。事实上，如果VEGF-A/VEGFR2途径促进LSEC驱动的肝再生，那么VEGF-A应该促进肝再生。因此，我们比较了VEGF-A的作用₁₆₄，对胎盘生长因子（PlGF），后者仅选择性激活VEGFR1²¹PH后，VEGF₁₆₄而不是PlGF，加速了肝组织的再生和VEGFR3的数量⁺CD34型⁻LSEC，持续至少28天(图2f，g). 因此，PH后VEGF-A/VEGFR2的激活，而不是PlGF/VEGFR1的激活，对于启动LSEC启动和维持肝脏增殖至关重要。

为了确定刺激肝脏再生的血管分泌信号，我们采用了微阵列分析(补充图6,补充表1). 在EC特异性基因中，转录因子标识1在PH激活的EC中特别上调²³.使用标识1^静脉YFPvenusYFP表达受同上发起人²⁴，我们发现独家标识1PH后48小时LSEC上调(图2h)，这在血管内皮生长因子2^{飞行/飞行}老鼠(图2i). 值得注意的是标识1-有缺陷的(标识1^−/−)PH后的小鼠受损28天，并且对VEGF-A保持不变₁₆₄管理(图3a,补充图7). 此外，在PH之后，标识1^−/−小鼠有丝分裂BrdU显著减少⁺HNF4A型⁺肝细胞数量，功能性VE-cadherin的形成受到干扰⁺异凝集素⁺血管，VEGFR3增殖减弱⁺CD34型⁻血浆胆红素水平升高证明LSEC和肝功能异常(图3b，c,补充图7). 因此，通过上调Id1来激活VEGF-A/VEGFR2通路可驱动肝脏再生。

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图3

标识1LSEC的上调对肝脏再生至关重要

a）与它们的野生型窝友（WT）相比，标识1^−/−小鼠肝组织再生受损，VEGF-A无法挽救₁₆₄管理(n个= 5).b、 c）肝细胞增殖受损（b）和VE-cadherin的组装⁺异凝集素⁺船舶（c）标识1^−/−PH后的小鼠(n个= 5).d、 e）肝细胞增殖的LSEC依赖性刺激被标识1基因敲除。Scr，打乱了。CM、LSEC调节介质(n个= 4).f）GFP标记的LSEC脾内移植并入VEGFR3的管腔⁺窦性脉管系统同上^−/−肝脏²⁵.

g、 h）移植标识1^+/+LSEC可恢复肝细胞的质量再生（g）和肝细胞增殖（h）标识1^−/−肝脏(n个= 4). 虚线，级别标识1^−/−无EC移植的肝脏。k个)细胞邻近性在移植GFP刺激肝细胞有丝分裂中至关重要⁺标识1^+/+脉管系统*P（P）<0.05，与同上^−/−（a） #P（P）<0.01，与标识1^−/−含VEGF₁₆₄（a） ，对比WT（b，c）。比例尺，50（d，f）和20（h）μm。误差线，s.e.m。

通过LSEC-肝细胞共培养系统检测Id1上调在介导LSEC对肝细胞增殖的血管分泌功能中的作用。分离的肝细胞与原代LSEC共培养导致肝细胞数量增加9倍，通过敲除标识1在LSEC中(图3d，e,补充图8). 来自LSEC的条件培养基（CM）未能支持肝细胞生长，突显了细胞间接触在LSEC衍生血管分泌功能中的重要性。因此，缺乏标识1导致LSEC诱导功能缺陷，损害肝细胞再生。

确定是否体内血管分泌效应标识1^+/+LSEC可在标识1^−/−小鼠，我们在PH后第2天采用脾内移植方法将LSEC植入标识1^−/−肝血管(图3f)²⁵.GFP标记标识1^+/+LSEC选择性纳入VEGFR3⁺正弦血管腔，恢复肝块再生和LSEC扩张(图3g,补充图9). 相反，移植的标识1^−/−LSEC无法恢复标识1^−/−肝脏。此外，在同上^−/−肝脏，GFP移植⁺标识1^+/+PH后第2天的LSEC启动了紧邻肝细胞的增殖(图3h，i). 因此，通过掺入标识1-有活性的LSEC产生足够的EC-衍生诱导信号，以启动肝细胞增殖标识1^−/−肝脏。

为了鉴定诱导肝再生的内皮细胞衍生血管分泌因子，我们分析了从野生型和标识1^−/−PH后48小时的小鼠^10,18,26-28Wnt2和HGF的表达，但LSEC表达的其他滋养因子，如Wnt9B和血栓调节蛋白，在标识1^−/−LSEC公司(图4a,补充图10). 这些结果表明，LSEC中Id1的上调通过诱导Wnt2和HGF的表达来启动肝细胞增殖。为了验证这个假设，在PH后第2天，我们植入标识1^−/−将含Wnt2、HGF或Wnt2和HGF的LSEC转化为标识1^−/−经脾内移植的肝血管。仅限标识1^−/−携带Wnt2和HGF的LSEC(标识1^−/−重量2⁺HGF公司⁺)在标识1^−/−肝脏(图4b)，表明HGF和Wnt2之间存在协同效应。值得注意的是，移植标识1^−/−重量2⁺HGF公司⁺LSEC进入标识1^−/−小鼠有丝分裂的BrdU增加⁺HNF4A型⁺肝细胞数量达到类似程度标识1^+/+LSEC移植(图4c). 有丝分裂的肝细胞也被发现位于移植肝附近标识1^−/−重量2⁺HGF公司⁺GFP公司⁺LSEC公司(图4d). 因此，Id1通过Wnt2和HGF的表达激活LSEC，诱导并列肝细胞增殖(图4e).

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图4

Id1介导的诱导LSEC中Wnt2和HGF刺激肝再生

a）HGF和Wnt2的上调在标识1^−/−PH后的LSEC(n个= 5).b）GFP标记的脾内移植标识1^−/−携带Wnt2和HGF的LSEC(标识1^−/−重量2⁺HGF公司⁺GFP公司⁺)拯救再生标识1^−/−肝脏肿块(n个= 4).c）移植标识1^−/−重量2⁺HGF公司⁺LSEC恢复受损的肝细胞增殖标识1^−/−肝脏。(n个= 4).d）有丝分裂肝细胞与标识1^−/−重量2⁺HGF公司⁺GFP公司⁺中的LSEC同上^−/−肝脏。e）LSEC介导的肝再生对VEGFR2-Id1通路的需求。脾内移植标识1^+/+LSEC进入标识1^−/−肝窦恢复肝血管再生。已移植标识1^+/+或标识1^−/−重量2⁺HGF公司⁺GFP公司⁺LSEC定位于肝细胞附近，促进诱导和增殖血管生成，从而维持生理性肝再生*P（P）< 0.05; #P（P）< 0.01. 比例尺，20μm。误差线，s.e.m。

这里我们采用了有条件的VEGFR2敲除，标识1^−/−小鼠和EC移植模型，以确定一种特殊器官特异性血管龛细胞（在操作上定义为VEGFR3）的基本血管分泌作用⁺CD34型⁻血管内皮生长因子2⁺VE-卡德林⁺因子VIII⁺探头1⁻CD45型⁻LSEC参与PH诱导的生理性肝再生。类似于血管生成性肿瘤血管中Id1的上调²³，Id1在正常LSEC中表达最低，但在血管生成性LSEC中，VEGFR2的PH激活诱导Id1的排他性上调。我们证明，在PH后的前3天，VEGFR2-Id1通路的激活启动了非增殖性VEGFR3中的诱导血管生成程序⁺CD34型⁻血管内皮生长因子2⁺标识1⁺LSEC通过产生血管分泌因子Wnt2和HGF，刺激肝脏增殖。随后，由于再生肝脏需要额外的血液供应，VEGFR2-Id1介导的LSEC增殖性血管生成重建肝血管团。因此，我们引入了LSEC通过双相机制支持肝再生的概念：在PH后的早期，诱导的血管生成性LSEC通过释放血管分泌因子促进器官生成，而增殖的血管生成的LSEC血管化并维持扩张的肝脏肿块。

我们展示了移植标识1^−/−重量2⁺HGF公司⁺LSEC进入同上^−/−小鼠启动并恢复肝脏再生。这一发现以及观察到的肝脏增殖在血管内皮生长因子2和标识1-缺陷小鼠表明，LSEC具有建立诱导性血管龛的责任，通过阐述血管分泌因子来启动肝脏增殖。由于分离用于治疗性肝再生的内皮祖细胞可能会遇到技术困难，因此从非肝组织中提取内皮祖细胞（EPCs）可以替代内皮祖细胞来启动和恢复肝再生²⁹值得注意的是，血管内皮生长因子2⁺标识1⁺内皮祖细胞可以通过释放血管分泌因子而不是在结构上并入血管壁来启动血管生成²⁹因此，内皮祖细胞的肝内移植将开辟促进肝再生的细胞治疗新途径。

在我们研究中使用的PH模型中，残留肝叶的血管完整性保持在最小的炎症反应(补充图2)从而建立了研究内皮细胞依赖性肝再生的理想模型。然而，在化学（CCl₄)-诱导的肝损伤模型、严重的血管损伤和细胞死亡可能需要募集其他非EC细胞，包括星状细胞¹⁹和促血管生成造血细胞，如CXCR4⁺血管内皮生长因子受体1⁺血管细胞³⁰，以支持肝脏再生。

然而，这里有一个尚未解决的谜团：LSEC如何在残留肝脏中检测到70%的肝脏被切除，从而点燃肝脏增殖^14-17可以想象，肝脏的质量是通过持续释放尚未识别的抑制因子来维持的。肝脏的切除将平衡转移到血管兴奋因子的主导地位，血管兴奋因子激活LSEC。同样，PH后4天肝脏质量的增加促使刺激LSEC新生血管生成的因子释放。随后，肝脏恢复到其发育预先确定的基线质量可能会重新建立终止再生过程的尚未识别的抑制信号。PH后肝脏的快速再生需要大量肝细胞的集体和全局增殖。事实上，由于每个肝细胞都与LSEC非常接近，通过启动血管分泌依赖性再生程序，诱导成熟肝细胞在PH后的整个残肝中增殖，可以实现肝细胞的这种非常和谐的激活，血管分泌因子也能促进肝祖细胞的增殖¹⁴除了成熟的肝细胞外，还有待研究。

在我们的研究中，Wnt2和HGF代表了驱动肝脏再生的主要肝脏特异性血管分泌因子。由于LSEC和肝细胞之间的直接细胞接触对肝细胞的增殖至关重要，可以想象，其他血管分泌因子可能与Wnt2和HGF协同调节肝再生。例如，EC特异性细胞外基质成分、蛋白酶、粘附分子和趋化因子也可能参与肝发生。我们的在体外EC-肝细胞共培养模型和体内脾内移植模型为评估这些未知的血管分泌因子在化学或创伤恢复过程中调节肝脏稳态的作用提供了理想的模型。

越来越多的证据表明，除了LSEC外，其他器官特异性血管生态位在器官修复和肿瘤发生中起着重要作用^5-7例如，骨髓SECs的应激诱导Notch-ligands表达被证明对造血干细胞重建至关重要⁵此外，肿瘤血管产生的特定原型血管分泌因子，如BMP2、一氧化氮、FGF2和PDGFβ，也直接刺激肿瘤的进展和转移⁷总之，这些数据表明，特定血管分泌因子的组织特异性表达可能决定了血管系统在调节发育和成体器官发生中的异质性。

到目前为止，通过肝细胞移植进行肝脏再生的尝试以有限的成功告终²⁵我们的研究表明，肝细胞或其祖细胞的联合移植¹⁴具有血管内皮生长因子2⁺标识1⁺LSEC或EPC可能允许设计有效的策略，以挽救创伤或感染性肝损伤患者的肝血管功能。此外，生理性肝再生依赖于LSEC的适当诱导和增殖功能，这一事实也要求在涉及肝再生的临床试验中评估抗血管生成治疗的潜在增加风险。

补充材料

致谢

附录

脚注

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