G中需要裂变酵母γ-微管蛋白复合物₁阶段，并且是主轴装配检查点的一个组件

碱性磷酸酶4⁺和alp6⁺编码γ-微管蛋白复合物的保守组分

使用裂变酵母基因组文库来分离与ts互补的基因碱性磷酸酶4和阿尔卑斯6突变。分离出两种不同的质粒（pLV4-1和pLV6-1）阿尔普4-1891和阿尔普6-719分别是。遗传连锁分析表明，pLV4-1中的基因是碱性磷酸酶4⁺而pLV6-1中的阿尔普6⁺（见材料和方法）。核苷酸测序表明碱性磷酸酶4⁺和阿尔普6⁺编码γ-微管蛋白复合物通用成分的裂变酵母同源物，分别为Gcp2（人类）/Spc97（芽殖酵母）和Gcp3/Spc98(希贝尔，2000). Alp4与Gcp2或Spc97的同源性分别为22%（如果考虑保守变化，则为32%）和11%（22%），而Alp6与Gcp3或Spc98的同源性则分别为25%（39%）和18%（32%），这表明裂变酵母蛋白在进化上比芽殖酵母更接近脊椎动物（表我). 以与脊椎动物蛋白质相似的方式(Martin等人，1998年;Murphy等人，1998年;Tassin等人，1998年)，Alp4和Alp6显示了彼此之间遥远的进化关系（数据未显示），可能是从一个共同的祖先进化而来的。

Alp4和Alp6在MTOC的细胞定位

为了检测Alp4和Alp6的细胞定位，将绿色荧光蛋白（GFP）基因融合到染色体的C末端碱性磷酸酶4⁺和阿尔普6⁺基因。当含有Alp4–GFP或Alp6–GFP的菌株与野生型菌株一样生长时，GFP标签不会干扰蛋白质功能，并且没有明显的形态或有丝分裂缺陷。来自Alp4–GFP和Alp6–GFP的信号基本相同（尽管来自Alp4-GFP的信息比来自Alp6-GFP的强）。在呈指数增长的Alp4–GFP细胞中，信号被视为核外围的单个或双点，和/或细胞中心的点状结构（图中左侧的面板1B） ●●●●。由于这种定位与SPB的定位相似，因此使用Alp4-GFP和抗Sad1抗体进行双重染色（Sad1是SPB成分；Hagan和Yanagida，1995年). 如图所示1C、 在间期（第1行）和有丝分裂细胞（第2行和第3行）中，Alp4–GFP与Sad1以单点（第1列）或双点（第2和第3列）的形式精确共存。特别令人感兴趣的是后期细胞（第4行），其中Alp4-GFP的定位与Sad1的定位不同。在这个阶段，除了位于每个核侧面的SPB外，还可以清楚地看到Alp4–GFP而非anti-Sad1的赤道点（第4行箭头）。隔膜形成完成后，该中心点消失（第5行）。这些圆点似乎与抗Gtb1抗体的圆点相同，后者被称为赤道MTOC，并在胞质分裂期间产生后期序列(Hagan和Hyams，1988年;Horio等人，1991年;哈根，1998年).

为了观察赤道MTOC的三维结构，共聚焦图像绕垂直轴旋转。研究发现，这些中央信号实际上不是“点”，而是在胞质分裂早期形成的“环”结构（箭头，图1D） ●●●●。此前有报道称，细胞质微管在细胞后期和末期的中心也以“赤道环”的形式存在(皮乔娃等., 1995). 这些结果表明，Alp4和Alp6不仅在氨基酸序列上与MTOC的成分同源，而且是在有丝分裂细胞周期中起作用的两个分裂酵母MTOC不可分割的一部分。

Alp4、Alp6和γ-微管蛋白之间的物理和遗传相互作用

通过免疫沉淀实验探讨Alp4、Alp6和Gtb1之间的物理相互作用。血凝素（HA）表位标记菌株（Alp4-3HA和Alp6-3HA）的构建方式类似于GFP标记。在SDS–聚丙烯酰胺凝胶上使用抗HA抗体鉴定的Alp4-3HA和Alp6-3HA进行免疫印迹（图2A） ●●●●。这些基因融合还用于确认Alp4和Alp6定位于MTOC。使用抗HA抗体的免疫荧光显微镜显示出与GFP标记的蛋白质相同的定位模式（见图中的右侧两个面板1B） ●●●●。免疫沉淀实验表明，Alp4-3HA和Alp6-3HA与Gtb1共沉淀（图2B、 泳道4和5）。共沉淀的Gtb1的量似乎没有总蛋白多（将通道1和2与通道3和4进行比较）。可能与Gtb1形成复合物的Alp4-3HA和Alp6-3HA在与抗-HA抗体沉淀时的效率低于游离蛋白，或者Gtbl的亚群可能独立于Alp4和Alp6存在。

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图2。Alp4/Alp6和γ-微管蛋白之间的物理和遗传相互作用。(A类)的标识碱性磷酸酶4⁺和阿尔普6⁺基因产品。用抗HA抗体对从Alp4-3HA（1区，LV15）或Alp6-3HA菌株（2区，LV16）制备的细胞提取物进行免疫印迹。Gtb1（γ-微管蛋白）作为负荷控制。(B类)Alp4/Alp6和γ-微管蛋白之间的物理相互作用。细胞提取物是从Alp4-3HA菌株（1和4道，LV15）、Alp6-3HA株（2和5道，LV16）或未标记野生型（3和6道）制备的，并用抗HA抗体进行免疫沉淀（4–6道）。用抗HA或抗Gtb1抗体检测沉淀蛋白。还运行了总细胞提取物（相当于用于免疫沉淀的1/50量）（1-3道）。(C类)凝胶过滤色谱法。可溶性细胞提取物用抗HA或抗Gtb1抗体进行免疫印迹分析。在最左侧面板中运行总提取物（10µg）。将两株菌株（Alp4-3HA和Alp6-3HA）的蛋白提取物加载到单独的柱上，并使用抗Gtb1抗体根据对照模式叠加分离图谱。还显示了尺寸标记（2000、669和232 kDa）的位置。(D类)多拷贝质粒抑制分析。ts秒碱性磷酸酶4或阿尔普6用含有以下成分的空载体或多拷贝质粒转化突变体碱性磷酸酶4⁺或阿尔普6⁺（分别为pUR-Alp4或pUR-Aal6），将转化子在富平板上划线并在36°C下培养3天。

为了确定裂变酵母中γ-微管蛋白复合物的大小，进行了凝胶过滤分析。如图所示2C、 Alp4、Alp6和Gtb1主要在大型杂岩中进行共分馏（>2000 kDa）。值得注意的是，这种大的尺寸与高等真核生物（如果蝇属和哺乳动物细胞(Martin等人，1998年;Murphy等人，1998年). 我们观察到，在较小的分数（分数13-22）中也发现少量Gtb1，其中一些仍与Alp4和Alp6（13-16）重叠。与其他真核生物一样，裂变酵母中可能存在多种形式的复合物，其大小不同(Akashi等人，1997年;Moritz等人，1998年).

我们寻求遗传相互作用来证实Alp4、Alp6和Gtb1物理相互作用的生化数据。如图所示2D、 含有碱性磷酸酶4⁺基因抑制ts缺陷阿尔普6-719突变体。综上所述，这些结果表明Alp4和Alp6定位于MTOC并构成γ-微管蛋白复合物的一部分，并且碱性磷酸酶4⁺和阿尔普6⁺基因与全球技术基础1⁺也和对方在一起。

alp4突变体在形成双极有丝分裂纺锤体和维持细胞质微管长度方面存在缺陷

为了表征ts碱性磷酸酶4表型更仔细，培养碱性磷酸酶4通过离心淘洗使细胞与细胞周期进程同步，并转移到限制温度。小型早期G₂ 阿尔普4-1891通过淘析收集26℃下生长的细胞，并将培养物分为两半。一半在26°C下孵育以监测细胞周期进程的同步程度，另一半在36°C下培养以检查在限制条件下孵育时产生的表型。每隔20分钟采集一次样品，以测量存活率，并用于微管和SPB的免疫荧光分析。

同步性很高，因为间隔指数在0分钟时＜0.5%，在120分钟时达到62%（第一次有丝分裂），在200分钟时降至1%，在26°C时在300分钟时再次达到峰值，达到47%（第二次有丝分裂）（图三A） ●●●●。在限制温度下，缺陷表型，包括异常有丝分裂DNA（图1A） 只有在第二次有丝分裂时才变得明显；第一次有丝分裂似乎正常发生（图三B类；在200分钟前注意正常的有丝分裂模式）。当间隔指数（相当于通过有丝分裂的细胞数量）达到峰值时，细胞活力在第一个100分钟内保持较高，然后随着第二个周期的进行，细胞活力开始下降。值得注意的是，在裂变酵母中，G₁相位很短，S相位几乎与核分裂和间隔同时发生(Moreno等人，1991年). 因此，这一结果表明碱性磷酸酶4突变体在第二个M期之前死亡。

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图3。Alp4对有丝分裂双极纺锤体的形成和间期细胞质微管的完整性都是必需的。（A和B）离心淘析。小型早期G₂的单元格阿尔卑斯4-1891通过离心淘析收集菌株（DH1891），并将培养物分为两部分，一部分在26°C下培养(A类)另一个温度为36°C(B类). 每隔20分钟采集一次样品，测量细胞数量（深蓝色的开口钻石）、间隔指数（黑色的开口方块）和存活率（红色的开口钻石，活菌落的百分比）。用抗微管蛋白、抗Sad1抗体和DAPI免疫荧光显微镜检查含有后期B核（绿色开环）和异常有丝分裂DNA（蓝色开三角形）的细胞百分比。(C类)中异常长的间期微管阿尔普4-1891突变体。使用同步间期样品（在36°C下220分钟）和抗微管蛋白（红色）和抗Sad1（绿色）抗体进行共聚焦显微镜检查。将显示合并的图像。(D类)异常的有丝分裂纺锤体。给出了显示单极轴（320分钟）的特征细胞。(E类)移位的长间期微管。异常有丝分裂（420分钟）后，显示具有较长细胞质微管的相间样细胞。(F类)Tea1在阿尔普4-1891突变体。碱性磷酸酶4突变体在26°C和10 mM HU存在下孵育3 h，洗脱HU后移到36°C。孵育2.5 h后，固定细胞，并使用抗管蛋白（左）和抗Tea1（中）抗体处理免疫荧光显微镜。合并的图像显示在右侧。(G公司)微管缺陷的过度表达碱性磷酸酶4⁺.包含集成nmt1-alp4基因⁺在没有硫胺素的情况下生长，并使用抗微管蛋白抗体进行免疫荧光显微镜检查。图像来自共焦显微镜。来自野生型控件的单元格（左）和碱性磷酸酶4⁺显示了16h后的过度表达（右）。条形图显示10µm。

每个时间点的免疫荧光显微镜使我们能够暂时跟踪碱性磷酸酶4突变并描绘微管变化的动力学。首先出现的表型是异常长的细胞质微管。在野生型细胞中，间期微管细胞骨架由几种丝状形式组成，沿细胞长轴延伸，长度不同，但从不围绕细胞尖端卷曲(哈根，1998年). 相反，在碱性磷酸酶4突变体，大多数间期细胞具有较长的微管，微管在细胞末端弯曲（220分钟，图三C） ●●●●。虽然野生型细胞中的大多数微管似乎独立于SPB(哈根，1998年)这些较长的微管通常与SPB相关或通过SPB。在进入第二次有丝分裂时，染色体经常分离，尽管只是部分分离，SPB分为两个小体。然而，很少观察到双极纺锤波，相反，形成了异常的“单极”样纺锤波（320分钟，图三D） ●●●●。在这些细胞中，纺锤体通常只来自两个SPB中的一个。

尽管存在这些有丝分裂缺陷，但细胞周期仍在继续，随着单极纺锤体消失，细胞退出有丝分裂，隔膜分裂未分裂的细胞核，产生“切割”表型。在此阶段，间期微管再次出现（420分钟，图三E） ●●●●。同样，就像早期的相间时间点（图三C） ，细胞质微管长度异常，生长在细胞末端附近。这些细胞质微管通常只在细胞的一半形成，与移位细胞核的一侧相对应（见图1A） ●●●●。综上所述，该分析确立了Alp4是细胞周期依赖性微管结构形成所必需的概念。在间期，它需要维持细胞质微管的长度，在有丝分裂中，它对双极纺锤体的形成至关重要。

alp4突变体中末端标记Tea1的定位没有缺陷

以前曾报道过异常长的间期微管茶水1生长极性控制细胞末端标记缺陷的突变体(马塔和护士，1997年). 如果没有Tea1（通常位于细胞末端，以及沿着微管和微管尖端），细胞质微管不会终止于细胞末端；相反，它们围绕着细胞皮层弯曲。为了检查是否在碱性磷酸酶4突变体可归因于Tea1功能异常，用抗Tea1和抗管蛋白抗体进行双重免疫荧光显微镜检查。使用羟基脲（HU）封闭和释放方法制备同步培养物。HU洗脱并释放到限制温度后，观察到细长和弯曲的微管（图三F） ●●●●。与抗Tea1抗体共培养表明，Tea1定位没有受到干扰。Tea1定位于微管的细胞末端和尖端。因此，较长的细胞质微管不是Tea1定位错误的原因，而可能是SPB功能缺陷所致。

在细胞中也可以看到更长的间期微管，其中碱性磷酸酶4⁺或阿尔普6⁺在外周过度表达。硫胺素可抑制性强nmt1（纳米1）⁺启动子整合到染色体中碱性磷酸酶4⁺和阿尔普6⁺就在起始密码子之前的基因座。研究发现碱性磷酸酶4⁺有毒，在不含硫胺的情况下抑制平板上的菌落形成（数据未显示）。在过度诱导24小时后，观察到极少数有丝分裂纺锤体（<0.5%，而在指数增长的野生型培养中为2-4%）。相反，在ts突变体中，可以看到细长的间期微管（诱导后16小时，图三G） ●●●●。这些结果表明，必须在细胞周期中正确调节Alp4和Alp6的蛋白水平或活性，以确保功能性间期微管和有丝分裂纺锤体的形成。

Alp4功能在S期之前执行，而不管该突变在随后的M期表现出有丝分裂异常

我们对Alp4执行其基本功能的细胞周期阶段感兴趣。先前淘析分析的结果有些出乎意料，尽管碱性磷酸酶4突变体表现出多种有丝分裂缺陷，这些表型仅在第二次有丝分裂时出现。为了解决Alp4何时发挥其重要作用的问题，对离心淘析实验进行了以下修改；淘析后，培养物在26°C下保持不同时间（0、40、80、100、120、140和160 min；图4A） 然后将温度升高至36°C，观察每个样本中出现的异常有丝分裂。结果如图所示4从这些操作中可以看出，执行Alp4功能时有一个关键时间。直到突变株完成第一次有丝分裂的100分钟（图4A） 缺陷出现在第二次有丝分裂时，如培养物在0分钟时向上移位时（图4B） ●●●●。另一方面，如果在第一次有丝分裂完成后140分钟或之后将培养物上移，则在进入第三次有丝裂时，缺陷表型开始出现。因此，似乎执行Alp4功能的关键阶段发生在120到140分钟之间，这可能对应于G₁阶段。这些结果表明，Alp4功能在S、G之前已经完成₂和M相，而不考虑碱性磷酸酶4突变体仅在随后的有丝分裂中表现出缺陷的表型。

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图4。基本Alp4功能在G中执行₁阶段。(A类)淘析离心和不同时间的转移。进行离心淘析以收集小G₂指数增长的细胞碱性磷酸酶4突变体在26℃下生长，同步细胞在26℃继续生长。在26°C下经过不同的培养时间（如箭头所示，0、40、80、100、120、140和160分钟）后，培养物被移至36°C。显示26°C时的间隔指数（直到第三次有丝分裂）。(B类)细胞在不同时间点出现有丝分裂缺陷。绘制第一次（黑色柱）、第二次（灰色）或第三次有丝分裂（阴影）后出现异常有丝分裂的细胞百分比。(C类)HU阻断和释放实验。的文化碱性磷酸酶4在26°C下，在含有10mM HU的富培养基中生长3小时的突变体，在冲洗掉HU后，移到36°C。在36°C下检查间隔指数（黑色的开放正方形）、活力（红色的开放菱形）、后期B核（绿色的开放圆形）和异常有丝分裂DNA（蓝色的开放三角形），如图所示三A和B(D类)脱氮和增氮实验。碱性磷酸酶4（LV6）细胞在26°C下饥饿7小时，分为两部分：一部分是添加新鲜的富氮培养基并在36°C下向上移动，另一部分保存在脱氮培养基中并在36℃下向上转移。符号与（C）中的相同，但也显示了在36°C脱氮条件下的存活率（淡蓝色交叉）。

为了更精确地检查Alp4功能需求的细胞周期计时，碱性磷酸酶4通过淘析以外的方法，在26°C下同步不同阶段的突变细胞。这些包括HU阻断和释放（S早期），以及氮剥夺和添加（G₁)实验。同步后，将培养物移至36°C，并监测有缺陷有丝分裂的外观和细胞活力。在限制温度下从HU块释放后，碱性磷酸酶4细胞正常分裂一次，然后在第二次有丝分裂中死亡（图4C） ，其动力学与之前的淘析实验非常相似，即细胞在G早期转移到36°C₂（图三B） ●●●●。另一方面，在氮缺乏和添加后，细胞在第一次有丝分裂时死亡，同时出现异常染色体分离（图4D） ●●●●。此外碱性磷酸酶4当细胞在36°C的脱氮培养基中持续培养7小时后，突变只有在细胞周期继续进行时才是致命的（图4D） ●●●●。由此，我们得出结论，Alp4的执行点发生在G₁细胞周期的阶段。

alp4突变体在进入M期之前失去生存能力

我们对哪个阶段感兴趣碱性磷酸酶4突变体在限制条件下不可逆转地导致有丝分裂缺陷和活性丧失。所解决的问题是G后是否继续孵化₁限制温度下有丝分裂进入前的阶段是异常有丝分裂表型和活性丧失所必需的。为了回答这个问题，在允许温度（26°C）下使用氮气饥饿重复同步培养分析，并在添加氮气后释放到36°C。在每个时间点取下培养物的等分样品，分为四部分：第一部分用流式细胞仪（FACS）测定DNA含量；第二组用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）和钙氟观察有丝分裂表型；第三种方法是在26°C的温度下直接将其摊铺在富饶的平板上，以测量存活率；第四个在液体培养中降低到26°C，以监测从限制条件转移到允许条件后的有丝分裂进程。

如图所示5A和B，该分析表明，在36°C下2.5小时后，生存能力已经开始丧失（图5A、 封闭箱），此时S阶段已经完成（图5B） ●●●●。只有在4小时后才进入随后的有丝分裂（图5A、 闭合圆）。因此，在进入M期之前，存在1.5小时的生存能力开始下降的时期。这一结果表明碱性磷酸酶4突变株在限制温度下进入M期之前具有致死性。此外，在允许条件下孵育后对这些细胞随后的致死表型的观察表明，突变细胞在26°C时表现出异常的有丝分裂，就像在36°C下继续孵育一样（图5A和见下文）。

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图5。 碱性磷酸酶4突变体在进入有丝分裂之前就具有不可逆转的致命性。(A类)致命的时机。氮保护，G₁-已同步碱性磷酸酶4在添加氮后，26°C下的突变体被转移到36°C。每隔30分钟取样一次，测量存活率损失（阴影框）和分隔细胞百分比（闭合圈）。在每个时间点，将等分样品降低到26°C，并计算通过异常有丝分裂（孵化）的细胞百分比。(B类)添加氮气后的DNA含量。固定并处理（A）中使用的样品，以进行FACS分析。(C类)在允许条件下出现单极轴。碱性磷酸酶4将在26℃下生长的突变细胞移到36℃，同时添加HU（10 mM）。培养4小时后，洗去HU，并将培养物恢复到26°C。然后在不同时间点用抗微管蛋白抗体（红色）和Cut12–GFP（绿色，一种完整的SPB蛋白；Bridge等人，1998年). 该图（共焦显微镜）显示了具有单极纺锤体的典型异常有丝分裂细胞（26°C下2小时）。条形图显示5µm。

G期间对Alp4功能要求的进一步支持₁来自使用HU的实验。在这种情况下，HU被添加到碱性磷酸酶4突变体在培养的同时从允许温度转移到限制温度。在36°C下4小时后，洗去HU，并将培养物恢复到26°C。如果在G期间执行基本的Alp4功能₁，在26°C的允许条件下观察一次有丝分裂异常碱性磷酸酶4突变体通过G₁如预期的那样，在HU洗脱后的26°C下培养2小时后，观察到具有单极纺锤体的异常有丝分裂细胞（图5C） ●●●●。这些结果确立了以下概念：碱性磷酸酶4突变体，当G中的基本功能₁如果没有完成，即使在进入有丝分裂之前向下移动到允许的条件下，细胞也会不可逆地通过单极纺锤体进行致命的有丝分裂。

alp4突变不影响γ-微管蛋白复合物的形成，但缺乏对SPB的细胞定位

我们试图澄清碱性磷酸酶4突变体。作为解决这个问题的第一步，γ-微管蛋白复合物的大小在阿尔普4-1891突变体。可溶性提取物是从野生型和阿尔普4-1891突变体，在限制温度下培养6h，然后进行凝胶过滤。如图所示6A、 大多数γ-微管蛋白仍然存在于一个大的复合物中，尽管与野生型相比，在较小的组分中似乎有更多的γ-微管蛋白。这一结果表明，γ-微管蛋白复合物在碱性磷酸酶4突变体。

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图6。 碱性磷酸酶4突变体在γ-微管蛋白定位到SPB时有缺陷，但不影响与γ-微管蛋白形成复合物的能力。(A类)凝胶过滤色谱法碱性磷酸酶4突变体。可溶性细胞提取物是从野生型和阿尔普4-1891突变体在36°C下培养6小时，通过Superose-6柱分离并免疫印迹，如图所示2C、(B类)SPB（Cut12-GFP）和γ-微管蛋白的细胞定位。碱性磷酸酶4突变体，其中剪切12⁺用GFP标记（LV25，表二)在HU存在下于26°C下生长，HU洗脱后温度升高至36°C。使用亲和纯化的抗Gtb1抗体进行免疫荧光显微镜检查。同时，通过GFP确定Cut12的位置。条形图显示10µm。

为了进一步解决碱性磷酸酶4突变体，检测γ-微管蛋白的细胞定位。使用HU块制备同步培养物，并在洗去HU后将培养物释放至36°C。亲和纯化的抗Gtb1抗体在26°C下对SPB和赤道MTOC进行染色（图6B、 左），如前所述(Horio等人，1991年). 相反，在碱性磷酸酶4在36°C温度下突变，γ-微管蛋白在活性高的第一次有丝分裂中正常定位（90分钟）；然而，在第二个循环（300min）中，它几乎没有完全定位。因此阿尔卑斯4-1891突变体似乎能够组装γ-微管蛋白复合物，但在定位到SPB时存在缺陷。

主轴检查点控制需要Alp4和Alp6

如前所示（见图三B–E），碱性磷酸酶4和阿尔普6在限制温度下培养的突变体，尽管经历了异常的有丝分裂和微管缺陷，但没有表现出典型的cdc阻滞；相反，它们经历了分裂和胞质分裂等有丝分裂后期。Alp4/Alp6和主轴组件检查点路径之间是否存在功能联系？为了回答这个问题，我们在碱性磷酸酶4突变体：（i）对微管稳定药物的敏感性；（ii）碱性磷酸酶4突变体激活主轴装配检查点；（iii）Alp4参与纺锤体检查点通路本身。如图所示7A、 发现两者都碱性磷酸酶4和阿尔普6突变株即使在允许的温度下也对TBZ过敏。对TBZ的超敏反应似乎不是由于微管的简单结构缺陷所致碱性磷酸酶4突变体导致活力急剧下降，细胞在26°C时表现出“切割”表型，而不是有丝分裂停滞（图7B） ●●●●。此外，在26°C的HU块释放到36°C后碱性磷酸酶4在TBZ存在的情况下，突变体在进入第一次有丝分裂时也立即丧失了生存能力（图7C） ●●●●。这与在没有该药物的情况下将该菌株释放到36°C的情况形成了鲜明对比（第二个循环中的生存能力丧失）。因此，碱性磷酸酶4（和阿尔普6)在纺锤体/微管完整性监测机制的某些方面存在缺陷。

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图7。主轴检查点路径需要Alp4和Alp6。(A类)过敏性碱性磷酸酶4和阿尔普6噻菌灵突变体。这个阿尔卑斯4-1891携带质粒的突变体碱性磷酸酶4⁺（野生型等效），mad2（mad2）删除，阿尔普4-225,阿尔普4-1891,阿尔卑斯山-1891mad2，的阿尔普6-719携带质粒的突变体阿尔普6⁺（野生型等效），阿尔普6-719和阿尔普6-719mad2将菌株放置在富含噻菌灵的平板上（右侧为–TBZ）或含有20µg/ml噻菌灵（左侧为+TBZ）的平板上，作为连续稀释液（10⁶顶部一行的细胞，然后在下面的每个点稀释10倍），并在30°C下培养。(B类)在允许温度下，TBZ存在时，活性丧失。碱性磷酸酶4突变体在26℃的富培养基中生长，并添加TBZ（50µg/ml）。测量“切割”细胞的百分比（闭合方块）和存活率（开放方块）。(C类)在限制温度下，TBZ存在时活性丧失。碱性磷酸酶4突变体在26°C的HU存在下在富培养基中生长3小时，并在冲洗HU和加入TBZ（50µg/ml）后转移到36°C。此外，还显示了添加TBZ后（开口正方形）或不添加TBZ时（开口圆圈）的存活率百分比。

裂变酵母中的一个大γ-微管蛋白复合体：大小很重要

凝胶过滤色谱显示，裂变酵母复合物的大小很大，与后生动物中的几乎无法区分，并且很可能复合物以多种形式存在，大小不一(阿卡西等., 1997;莫里茨等., 1998;Oegema公司等., 1999). 高等系统中的生物化学工作检测到除γ-微管蛋白、Gcp2和Gcp3外，还含有γTuRC的其他几个蛋白质(郑等., 1995;马丁等., 1998;墨菲等., 1998;法瓦等., 1999). 鉴于裂变酵母和动物之间γ-微管蛋白复合体的大小相似，裂变酵母应该是一种合适的生物体，可以在其中鉴定这些新因子。

Alp4和Alp6的重要作用在G期间完成₁：时机很重要

使用ts对各种同步文化进行仔细分析碱性磷酸酶4突变体使我们得出结论，Alp4在S期已经发挥了其重要作用，并且在进入随后的有丝分裂之前很久就失去了活性。G期间发生的基本Alp4相关事件是什么₁? 一种可能性是γ-微管蛋白复合物在SPB上的募集，可能与SPB的复制相结合，发生在G期₁在野生型细胞中。在ts中碱性磷酸酶4突变体，这个过程可能有缺陷，而不是不能在微管成核中发挥作用就其本身而言。如果Alp4突变体蛋白在G中的某个时候被招募到SPB中，那么它可以保持功能₁在允许的温度下。事实上，γ-微管蛋白复合物本身的组装在ts中没有受损碱性磷酸酶4突变体表明，SPB的招募可能有缺陷。

关于裂变酵母SPB复制（而非分离）时间的报告尚未定论(麦卡利和罗比诺，1971年;King and Hyams，1982年;Kanbe等人，1990年;丁等人，1997年). 然而，最近的仔细分析表明，SPB复制发生在G₁（S.Uzawa和W.Z.Cande，个人通信）。事实上碱性磷酸酶4突变体仍然能够使一个SPB的有丝分裂纺锤体成核，这可以用前一周期保留的γ-微管蛋白复合物来解释，尽管它们无法通过免疫荧光显微镜检测到。有证据表明这两种SPB是不等价的，例如在ts中出现单极有丝分裂纺锤体剪切12SPB组件中有缺陷的突变体(Bridge等人，1998年)以及GTP酶激活蛋白（Cdc16和Byr4）和Spg1–GTP结合蛋白的效应物（Cdc7）仅在一个复制的SPB上的不对称定位(Cerutti和Simanis，2000年). 应该注意的是，这些蛋白质都参与了SPB介导的纺锤体检查点途径（见下文）。

γ-微管蛋白复合体在间期微管形成中的作用：长度很重要

在野生型中，细胞质微管以几种不同的细丝存在，其中大多数与SPB无关(Hagan和Hyams，1988年). 相反，碱性磷酸酶4突变细胞表现出以下两种异常。首先，可以看到一两个极为细长的微管束。其次，这些长微管通常与SPB相连或穿过SPB。我们表明，在碱性磷酸酶4突变体。这表明较长的细胞质微管可能是由于SPB微管组织缺陷而产生的，而不是Tea1依赖性生长极性控制的失败。

可能在碱性磷酸酶4突变体，通过与SPB相互作用，这些间期微管变得比野生型形式更稳定。因此，Alp4和Alp6可能在维持细胞质微管的长度和方向方面发挥重要作用。在芽殖酵母中的γ-微管蛋白基因突变中观察到一种类似的表型，表现为更长的微管(Marschall等人，1996年;Spang等人，1996年)最近在裂变酵母中(Paluh等人，2000年). 由Alp4异位过度生产引起的缺陷表型在间期微管形态方面与突变体相似。这支持了这些蛋白质在维持相间微管完整性中的作用。

相间微管是如何产生和组织的还有待确定。它们可能起源于MTOC（SPB和/或赤道MTOC），然后释放到细胞质中。或者，细胞质微管的成核可能独立于MTOC，但仍需要与之进行一些相互作用。Alp4和Alp6可能是通过微管覆盖反应等生化过程从MTOC中释放细胞质微管所必需的。裂变酵母中微管成核活性受细胞周期控制(Masuda和Shibata，1996年)现在，重要的是要解决细胞周期依赖性调节MTOC功能的分子机制。

alp4基因的克隆⁺和alp6⁺基因

A类葡萄裂殖酵母pUR19中的基因组文库(Barbet等人，1992年)用于分离补充ts的基因阿尔普4-1891和阿尔普6-719突变体（分别为LV1和LV3，表二). 三十（适用于阿尔普4-1891)和七（适用于阿尔普6-719)质粒是独立分离的。限制性内切酶图谱显示，它们分别被分为两个（pLV4-1和-2）和三个不同的质粒（pLV6-1、-2和-3）。pLV4-1和pLV4-2包含重叠的插入DNA，pLV6-1、pLV6-2和pLV6-3也包含重叠插入DNA。两个克隆基因的身份碱性磷酸酶4⁺和阿尔普6⁺分别通过标记菌株和原始突变体之间的遗传杂交证实如下。Alp4-3HA菌株之间的随机孢子分析（LV15，卡那霉素抗性作为标记，表二)和一个ts阿尔普4-1891菌株，或在Alp6-3HA菌株之间（LV16，表二)和一个ts阿尔普6-719菌株，表明在pLV4-1和pLV6-1中分离的基因最有可能来自碱性磷酸酶4⁺和阿尔普6⁺基因座（无重组体，即Kan^第页T型^–或Kan^秒T型⁺，从>10获得^三单倍体分离物）。

核酸的制备和操作

按照供应商（新英格兰生物实验室）的建议使用酶。本文报告的核苷酸序列数据位于DDBJ/EMBL/Genbank数据库中，登录号为｛“type”：“entrez核苷酸”，“attrs”：｛“text”：“AB026664”，“term_id”：“4757364”，“term_text”：“AB026664”｝AB026664号(碱性磷酸酶4⁺)和{“type”：“entrez-notide”，“attrs”：{“text”：”AB040811“，”term_id“：”7649807“，”term_text“：”AB0.40811“}}AB040811号(阿尔普6⁺).

基因破坏

这个阿尔普6⁺使用PCR生成的片段删除基因(巴勒等人，1998年). 杂合二倍体细胞的asci解剖显示阿尔普6⁺该基因对细胞存活至关重要，因为从20个四分体中分离出两个活孢子和两个不活孢子，活菌落为Ura^–.单倍体细胞从删除的孢子中发芽的显微镜观察阿尔普6⁺表现出与ts突变体相似的形态缺陷。

染色体整合的过度表达和C末端表位标记

硫胺素可抑制性强nmt1（纳米1）启动子整合在基因组中的启动子ATG之前碱性磷酸酶4⁺和阿尔普6⁺通过基于PCR的基因靶向方法的基因（LV21和LV22，表二;巴勒等人，1998年). 还使用PCR生成的片段对GFP或HA表位进行C末端标记。

同步文化

如前所述，使用淘析器转子（JE-5.0，Beckman Instruments）进行离心淘析(莫雷诺等., 1991). 对于HU块释放实验，将HU（10 mM）添加到26°C下呈指数增长的细胞中，孵育3 h，过滤，再悬浮在无HU的富培养基中，并在36°C下培养。利用一株原营养菌株（LV6）进行了氮剥夺和释放实验。使用缺乏氮的EMM2液体培养基（EMM2-N），在26°C的条件下，细胞在该培养基中饥饿7小时。然后冲洗培养基，用新鲜的完整培养基替换，并将培养物移至36°C。在每个时间点采集样本进行免疫荧光显微镜检查、间隔指数测量和核染色。

凝胶过滤色谱法

在缓冲液A中制备可溶性蛋白质提取物（20 mM Tris–HCl pH 7.5，20%甘油，0.1 mM EDTA，1 mM巯基乙醇，5 mM ATP加抑制剂混合物；Sigma）。通过FPLC（法玛西亚生物技术公司）在Superose-6柱上进行凝胶过滤色谱。用含有100 mM NaCl的缓冲液A的两个柱体积使柱平衡。为了测定分子量，用葡聚糖（2000 kDa）、甲状腺球蛋白（669 kDa）和α-淀粉酶（232 kDa）组成的标准品进行平行柱。用SDS–PAGE在10%凝胶上分离组分（每个50µl），并用单个抗体检测分馏蛋白。

免疫化学分析

亲和纯化的兔多克隆抗Gtb1和抗Tea1抗体是Hirohisa Masuda博士的礼物(Masuda和Shibata，1996年)和曼努埃尔·阿雷拉诺(马塔和护士，1997年)分别是。兔多克隆抗Sad1抗体从Iain Hagan博士处获得(Hagan和Yanagida，1995年). 小鼠抗α-微管蛋白单克隆抗体（TAT-1）由Keith Gull博士提供。小鼠单克隆抗HA抗体（16B12）和抗γ-微管蛋白抗体分别购自BAbCO Ltd和Sigma。采用辣根过氧化物酶偶联山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG（Bio-Rad Laboratories）和化学发光系统（ECL，Amersham）检测结合抗体。如前所述，使用玻璃珠制备裂变酵母全细胞提取物以破坏细胞(拉德克利夫等., 1999). 对于免疫沉淀，使用2 mg总蛋白提取物。