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分子细胞。作者手稿；PMC 2011年3月15日发布。
以最终编辑形式发布为：
分子细胞。2000年12月；6(6): 1389–1399.
数字对象标识：2016年10月10日/s1097-2765（00）00136-2
预防性维修识别码：项目经理3057227
NIHMSID公司：美国国家卫生研究院272648
PMID：11163212

促凋亡Bcl-2家族成员Bak和Bax的联合功能对多组织的正常发育至关重要

图莉亚·林德斯滕,1 安德烈亚·罗斯,2 阿亚拉·金,1 宗维兴,1 杰弗里·拉思梅尔,1 海伦娜·谢尔斯,三 尤根·乌尔里奇,4 卡特里娜·G·韦米尔,5 帕特里斯·马哈尔,5 肯尼思·弗劳沃思,1 陈一峰,1 迈克尔·魏,8 Vicki M.工程,6 大卫·M·阿德尔曼,7 M.塞莱斯特·西蒙,7 艾薇儿·马,三 杰弗里·戈登,1 杰拉德·伊万,4 斯坦利·科尔斯迈尔,8 格兰特·麦格雷戈,5和克雷格·汤普森1,9
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

总结

促凋亡Bcl-2家族成员被认为在调节细胞凋亡中起着核心作用。然而，老鼠缺乏bax（巴克斯）表现出有限的表型异常。如图所示，烘烤–/–研究发现，小鼠发育正常，生育能力良好，没有出现任何与年龄相关的疾病。然而，当Bak缺乏的小鼠与Bax缺乏的小鼠交配，产生缺乏这两种基因的小鼠时bax（巴克斯）–/–烘烤–/–动物围产期死亡，存活到成年期的动物不到10%。bax（巴克斯）–/–烘烤–/–小鼠表现出多种发育缺陷，包括趾间网持续存在，阴道管闭锁，中枢神经和造血系统内多余细胞积聚。因此，Bax和Bak在哺乳动物发育和组织稳态期间的凋亡调节中具有重叠作用。

介绍

程序性细胞死亡（凋亡）在发育和组织稳态的调节中起着关键作用。此外，细胞凋亡在清除受损或感染细胞中起着重要作用(Vaux和Korsmeyer，1999年). 已经确定了两种主要的凋亡途径(Strasser等人，1995年;绿色，2000). 外源性细胞死亡途径为多细胞生物提供了一种通过指令消除细胞的方法。在外源性途径中，细胞凋亡是通过配体与细胞表面受体结合而启动的，细胞表面受体随后会死亡。相反，已经定义了细胞内启动凋亡的细胞内固有死亡途径。

参与外源性死亡途径的受体的最佳特征是TNF受体家族的成员，如Fas和TNF-R1(长田，1997年). 一旦与配体结合，这些受体就会启动死亡诱导信号复合物的形成，其中一个基本成分是衔接分子FADD。FADD反过来招募Caspase 8。在向信号复合体募集时，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8经历自蛋白水解激活。一旦被激活，胱天蛋白酶8可以启动额外胱天蛋白酶的激活和细胞内底物的降解。这些事件导致细胞内物质有序降解和细胞死亡。

当线粒体外膜失去完整性时，细胞内在凋亡途径启动，导致细胞色素c和其他凋亡调节蛋白释放到胞质溶胶中(绿色，2000). 在细胞溶质中，释放的细胞色素c与Apaf-1结合。在细胞色素c和dATP存在下，Apaf-1招募Caspase 9形成多元复合物。胱天蛋白酶9的蛋白水解激活反过来导致包括胱天蛋白酶3在内的胱天蛋白酶级联的启动，导致凋亡细胞死亡的形态学特征。

Bcl-2蛋白是细胞凋亡的进化保守调节因子(亚当斯和科里，1998年). Bcl-2家族由促凋亡和抗凋亡家族成员组成。最具特征的抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL（左），似乎直接或间接地保持线粒体外膜的完整性，从而通过细胞内死亡途径阻止细胞色素c的释放和细胞死亡的启动(Kluck等人，1997年;Vander Heiden等人，1997年;Yang等人，1997年). 相反，促凋亡家族成员Bax、Bid和Bak已被证明能促进细胞色素c的释放(Jurgensmeier等人，1998年;Li等人，1998年;Luo等人，1998年;Kluck等人，1999年;Wei等人，2000年). 缺乏Bcl-2、Bcl-x的小鼠L（左）已报告Bax或Bid(Nakayama等人，1993年;Veis等人，1993年;Knudson等人，1995年;Motoyama等人，1995年;Yin等人，1999年). 缺乏Bcl-2的小鼠表现出肾脏发育缺陷，淋巴细胞和黑素细胞过早丧失，分别导致免疫缺陷和头发色素沉着消失(Nakayama等人，1993年;Veis等人，1993年). 缺乏Bcl-x的动物L（左）在胚胎发育过程中死亡，显示胚胎脊髓、脑干和背根神经节发育中的有丝分裂后细胞凋亡大量增加(Motoyama等人，1995年). 肝脏和造血系统中也观察到广泛的细胞凋亡。

缺乏促凋亡家族成员Bax的动物是可以存活的，这表明发育不需要Bax(Knudson等人，1995年). 然而，男性bax（巴克斯）–/–小鼠由于精子发生的发育停滞而不育，这与精原细胞死亡的反常增加有关。Bax缺乏的动物也增加了交感和运动神经元的数量。在体外培养过程中，来自Bax缺陷动物的交感神经元对营养因子剥夺后的细胞死亡具有抵抗力。

虽然Bcl-2蛋白主要被认为是内在凋亡途径的调节器，但最近的证据表明，促凋亡的Bcl-2家族成员也可以在外在途径中促进细胞死亡。已证明Bid是Caspase 8的底物(Li等人，1998年;Luo等人，1998年). 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8对Bid的裂解导致截短的Bid移位到线粒体，促进细胞色素c的释放。令人惊讶的是，Bid-deficient小鼠能够存活，没有明显的发育异常(Yin等人，1999年). 然而，投标–/–体内注射抗Fas抗体后，小鼠肝细胞死亡减少。

Bak代表另一个与Bax密切相关的促凋亡Bcl-2家族成员，与体外系统检测的Bax大致相当(Chittenden等人，1995年;Orth和Dixit，1997年;Tao等人，1997年). 此外，Bak基本上在所有器官中表达，表明它可能是多种细胞类型中凋亡的调节器(Farrow等人，1995年;Kiefer等人，1995年;Krajewski等人，1996年). 为了研究这种可能性，我们通过基因靶向产生Bak缺乏小鼠。缺乏Bak的小鼠未能表现出明显的发育异常。雄性和雌性动物都能繁殖。Bak缺乏小鼠在衰老过程中没有出现任何可复制的异常，当通过细胞内或细胞外途径启动细胞凋亡时，从这些小鼠分离的细胞表现正常。这些数据表明，Bak不是凋亡的重要调节因子，或者Bak的功能与其他广泛表达的促凋亡Bcl-2家族成员的功能冗余。

由于Bax也显示出广泛的组织分布和bax（巴克斯）–/–小鼠的表型异常相对有限(Oltvai等人，1993年;Knudson等人，1995年)，我们承诺繁殖bax（巴克斯）–/–烘烤–/–老鼠。大多数bax（巴克斯）–/–烘烤–/–小鼠围产期死亡，只有不到10%的动物成年。bax（巴克斯）–/–烘烤–/–成年小鼠表现出多种表型异常。成人bax（巴克斯）–/–烘烤–/–小白鼠一生中都保持着趾间网，而雌性小白鼠的阴道无孔。这些动物表现出多种神经系统异常，包括耳聋、旋转行为以及脑室周围祖细胞区持续存在大量未分化细胞。造血系统也严重异常，造血祖细胞数量增加，粒细胞和淋巴细胞数量增加。成熟B细胞和T细胞的逐渐积累导致脾脏和淋巴结大量肿大，实质器官浸润。体外培养，来自bax（巴克斯）–/–烘烤–/–小鼠对忽视或辐射引起的死亡具有抵抗力，但对Fas交联反应可启动细胞凋亡。总之，这些数据表明Bax和Bak代表参与细胞凋亡调控的冗余蛋白。Bak和Bax同时缺乏会导致与细胞积累相关的异常，这些细胞通常在发育或组织内稳态调节期间死亡。

结果

生成烘烤–/–老鼠

制作了一个靶向结构，消除了外显子III–VI，该外显子编码Bcl-2同源（BH）结构域1–3烘烤基因(图1A). 将线性化的构建物电穿孔到R1 ES细胞中，并通过G418抗性筛选转染体。获得四个独立的同源重组体，经Southern印迹证实，并注射到C57BL/6囊胚中。鉴定嵌合小鼠并与C57BL/6小鼠杂交以产生杂合的Bak突变体。杂交杂合小鼠产生纯合Bak-deficient(烘烤–/–)老鼠。在最初杂合子交配的77个后代中，23个是野生型，30个是杂合子，24个是纯合子突变体。Western blot分析证实纯合子突变体中缺乏Bak表达(图1B). 这个烘烤–/–小鼠外观正常。对多个组织的尸检和显微镜评估没有发现任何明显的损伤。对各种凋亡刺激反应的细胞存活率的检测显示烘烤–/–与野生型对照组相比。两者都有烘烤–/–雄性和雌性都能生育，而且繁殖良好。经过一年多的观察，烘烤–/–动物没有出现任何可繁殖的年龄相关疾病。

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的生成烘烤–/–老鼠

（A） 基因组组织烘烤给出了基因、靶向策略和最终的靶向结构。所示的限制性内切酶位点为（Xb）、XbaI；（Bg），BglII；（S） ，SalI公司；和（Xh），XhoI。

（B） 小鼠脾脏和胸腺全细胞裂解物的Western blot分析烘烤+/+,烘烤+/–、和烘烤–/–老鼠。

的生成bax（巴克斯）–/–烘烤–/–老鼠

上述数据表明，Bak代表非必需基因，或者Bak的功能与其他促凋亡Bcl-2家族成员重复。为了研究后一种可能性，我们试图确定与在任何单一缺陷动物中观察到的相比，同时繁殖Bak和Bax突变是否会揭示更显著的表型异常。要生成bax（巴克斯）–/–烘烤–/–动物，烘烤+/–小鼠与bax（巴克斯）+/–老鼠。后代bax（巴克斯）+/–烘烤+/–鉴定并杂交。这些杂交后代断奶时的基因分型显示bax（巴克斯）–/–烘烤–/–获得动物的频率低于预期孟德尔频率的10%。此外，在断奶之前，在这些幼崽中发现了一些死亡的幼崽。对这些死亡动物的基因分型表明，许多是bax（巴克斯）–/–烘烤–/–。这表明bax（巴克斯）–/–烘烤–/–动物在围产期死亡。为了进一步评估这一点bax（巴克斯）+/–烘烤–/–建立动物模型，并在出生时处死六窝连续产仔的后代。杂交产生的37只小鼠bax（巴克斯）+/–烘烤–/–8只小鼠bax（巴克斯）+/+烘烤–/–，23个bax（巴克斯）+/–烘烤–/–、和6个bax（巴克斯）–/–烘烤–/–仔细观察这些交配产生的额外幼崽，发现个别动物未能适当哺乳，经常被发现与笼子里的兄弟姐妹和母亲隔离。这些动物的基因分型表明bax（巴克斯）–/–烘烤–/–老鼠。尽管频繁的观察使我们能够在死亡前对这些动物进行可复制的观察，但大多数动物在出生后48小时内死亡。

成人指间组织的持久性bax（巴克斯）–/–烘烤–/–老鼠

大量bax（巴克斯）–/–烘烤–/–小鼠存活至成年，这些成年动物在12-16周龄时被详细描述。成人bax（巴克斯）–/–烘烤–/–小鼠在大体检查时表现出几种表型异常，其中最引人注目的是bax（巴克斯）–/–烘烤–/–老鼠的前爪和后爪上都有叉指网，如所示图2A.bax（巴克斯）+/+烘烤+/–,bax（巴克斯）+/+烘烤–/–、和bax（巴克斯）–/–烘烤+/+小鼠没有趾间网。在图2B，来自bax（巴克斯）+/–烘烤–/–鼠标和来自bax（巴克斯）–/–烘烤–/–显示鼠标。仅存在一个野生型副本bax（巴克斯）完全消除了指间织带烘烤还消除了织带（数据未显示）。

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的大体解剖表型bax（巴克斯）–/–烘烤–/–老鼠

（A） 的照片bax（巴克斯）+/+烘烤+/–（a和e），bax（巴克斯）+/+烘烤–/–（b和f），bax（巴克斯）–/–烘烤+/+（c和g），以及bax（巴克斯）–/–烘烤–/–（d和h）小鼠。

（B） 爪子的背视图和腹视图bax（巴克斯）+/–烘烤–/–（a和c）和bax（巴克斯）–/–烘烤–/–（b和d）。

（C） 阴道开口照片bax（巴克斯）+/–烘烤–/–和bax（巴克斯）–/–烘烤–/–老鼠。箭头指向阴道外部区域。

未能开发外部阴道内脏

第二个可见异常bax（巴克斯）–/–烘烤–/–老鼠是所有成年雌性都有一个无孔阴道(图2C). 两组患者均未观察到阴道闭锁bax（巴克斯）–/–或烘烤–/–小鼠（数据未显示）。同样，这两种基因中都存在一个野生型等位基因bax（巴克斯）或烘烤足以消除这种解剖异常(图2C和数据未显示）。

神经异常

bax（巴克斯）–/–烘烤–/–小鼠对听觉刺激均无反应。此外，大多数双突变小鼠在暴露于外部压力时表现出循环行为。外部压力，如更换笼子，似乎也会在一些bax（巴克斯）–/–烘烤–/–老鼠。然而，出生时观察到的前脑和颅骨缺损半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9–/–和/或Apaf-1型–/–(Cecconi等人，1998年;Kuida等人，1998年;吉田等人，1998年;Honarpour等人，2000年)在bax（巴克斯）–/–烘烤–/–老鼠。

脑组织的组织学分析bax（巴克斯）–/–烘烤–/–老鼠

评估患者的中枢神经系统bax（巴克斯）–/–烘烤–/–从这些小鼠以及其他基因型的对照同窝小鼠的大脑中进行解剖。总的来说bax（巴克斯）–/–烘烤–/–突变小鼠比其他被检测基因型的小鼠大（数据未显示）。经过组织学分析，大脑多个区域的神经元数量似乎普遍增加。然而bax（巴克斯）–/–烘烤–/–大脑是脑室周围大量聚集的小神经元细胞，染色质染色致密(图3A). 在同一区域（相当于神经节隆起）的正常胚胎发生期间，也发现类似的细胞聚集。已知该区域由神经干细胞占据，在终末分裂期间，一些子细胞分化为有丝分裂后神经元，而其他子细胞经历程序性细胞死亡(拜耳和奥特曼，1991年;Clarke等人，2000年). 成人bax（巴克斯）–/–烘烤–/–在其他神经干细胞普遍存在的地方也发现了类似数量的小细胞，包括海马体、小脑和嗅球（数据未显示）。此外，在成年小鼠中不常见的含有神经干细胞的区域，如中脑背中线，也发现了类似的小细胞聚集(图3B). 这两种表型的基因剂量效应均为单基因bax（巴克斯）–/–和单身烘烤–/–大脑在脑室周围区显示出离散的小细胞聚集(图3A). 然而，bax（巴克斯）–/–烘烤–/–与缺乏Bax或Bak的动物相比，这些细胞的数量和分布都显著增加。

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脑内小神经细胞在脑室周围的积聚bax（巴克斯）–/–烘烤–/–老鼠

（A） 脑组织的组织切片bax（巴克斯）+/+烘烤+/–（a） ，bax（巴克斯）–/–烘烤+/+（b） ，bax（巴克斯）+/–烘烤–/–（c） 、和bax（巴克斯）–/–烘烤–/–（d） 小鼠25倍放大。每组位于大致相同的水平，包括前基底神经节和胼胝体。箭头指向所有截面的心室周围区域。

（B） 中脑背中线的组织切片bax（巴克斯）–/–烘烤–/–小鼠400倍放大，用抗CD45RB染色。箭头指向CD45+细胞。箭头指向小神经元细胞的异常聚集。

鉴于在其他地方发现的造血缺陷bax（巴克斯）–/–烘烤–/–小鼠（见下文），我们探索了中枢神经系统异位细胞来源于造血的可能性。组织切片来自bax（巴克斯）–/–烘烤–/–大脑被抗CD45染色，这是一种在广泛的造血细胞上表达的标记。而免疫反应性CD45+在血管内发现造血细胞，在神经实质内发现少量细胞bax（巴克斯）–/–烘烤–/–小鼠为CD45–(图3B).

其他实质器官无发育缺陷

尽管在中枢神经系统和生殖系统中观察到异常bax（巴克斯）–/–烘烤–/–小鼠的大多数其他器官在发育过程中似乎形成正常。两组患者的肾脏、肝脏、肺、心脏、胰腺或膀胱均未观察到大体解剖或组织学异常烘烤–/–或bax（巴克斯）–/–烘烤–/–动物。为了证实这些内脏器官也在生理水平上发挥作用，我们对以下器官进行了标准血液化学测定：bax（巴克斯）–/–烘烤–/–小鼠和适当的窝友对照。两组患者的电解质、血糖、肾功能或肝功能测试均未发现一致异常烘烤–/–或bax（巴克斯）–/–烘烤–/–动物（数据未显示）。bax（巴克斯）–/–小鼠表现出与精原细胞发育停滞相关的精子发生缺陷。睾丸组织学bax（巴克斯）–/–烘烤–/–雄性小鼠与bax（巴克斯）–/–室友（数据未显示）。

骨髓和淋巴细胞数量增加bax（巴克斯）–/–烘烤–/–动物

血细胞计数显示bax（巴克斯）–/–烘烤–/–老鼠(表1). 髓细胞和淋巴细胞均出现统计学上显著的增加。此外，bax（巴克斯）–/–烘烤–/–动物表现出轻度贫血和血小板减少症，这两种情况都没有观察到bax（巴克斯）–/–或烘烤–/–动物。造血集落分析显示，髓系集落形成单位（CFU）数量持续增加，且具有统计学意义/106骨髓细胞(表2). 随着CFU总数与突变体总数大致成比例增加，也出现了基因剂量效应烘烤和bax（巴克斯）存在等位基因。还观察到红细胞和巨核细胞CFU轻度升高。

表1

的血液学特征bax（巴克斯）-/-烘烤-/-和控制小鼠

基因型白细胞计数中性白细胞淋巴细胞加拿大皇家银行
bax（巴克斯）-/-烘烤-/-
    115.34.1107.4
    224.22.520.44.6
    328.72269.5
    439.25.131.98.8
bax（巴克斯）+/-烘烤-/-
    111.13.75.510.1
    28.61.36.59.5
bax（巴克斯）+/+烘烤-/-
    13.71.22.49.8
    24.60.73.69.8
bax（巴克斯）+/+烘烤+/-
    16.41.64.79.8
    25.71.34.28.8
bax（巴克斯）+/+烘烤+/+
    14.70.73.89.9
    24.80.549.3
    34.31.32.910.3

白细胞（WBC）、中性粒细胞、淋巴细胞（×10三/μl）和红细胞（RBC，×106/μl）使用Hemavet 1500仪器测定。

表2

骨髓造血祖细胞检测

基因型类髓细胞红色/梅格总计
bax（巴克斯）-/-烘烤-/-
    129798395
    225093343
    330288390
bax（巴克斯） +/- 烘烤 -/- 208111319
bax（巴克斯） +/+ 烘烤 -/- 154104258
bax（巴克斯）+/+烘烤+/- 17274246
bax（巴克斯）+/+烘烤+/+ 144 ± 1268 ± 5211 ± 7

骨髓细胞分离自bax（巴克斯）-/-烘烤-/-对照组小鼠在完全甲基纤维素培养基中培养5天。根据菌落形态和细胞学染色对CFU进行评分。髓样CFU是巨噬细胞、粒细胞-红细胞-巨噬细胞、粒细胞核-巨噬细胞和粒细胞CFU的组合。同样，红细胞系和巨核细胞CFU被合并。对于野生型组，数据表示为平均值±标准偏差。

大量淋巴积聚bax（巴克斯）–/–烘烤–/–老鼠

白细胞计数增加的大多数bax（巴克斯）–/–烘烤–/–动物是由于淋巴细胞数量的增加。bax（巴克斯）–/–烘烤–/–小鼠不仅在循环内，而且在外周淋巴器官内淋巴细胞数量增加。如前所述(Knudson等人，1995年)，Bax缺乏的动物的脾脏和淋巴结比野生型小鼠略大(图4A). 然而，bax（巴克斯）–/–烘烤–/–小鼠的外周淋巴器官进一步明显增大。所有患者均观察到显著的脾肿大bax（巴克斯）–/–烘烤–/–检测突变小鼠，以及图4B显示了来自bax（巴克斯）–/–烘烤–/–鼠标。这个bax（巴克斯）–/–烘烤–/–脾脏有一个扩大的红髓区域，组织学分析显示，该区域的浆细胞和组织细胞数量大幅增加。还观察到白髓明显增生。

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脾肿大、淋巴结病和外周器官的淋巴浸润bax（巴克斯）–/–烘烤–/–老鼠

（A） 脾脏和淋巴结的照片bax（巴克斯）–/–烘烤–/–和对照小鼠。

（B） 脾组织切片（a和B）2倍放大，肝脏组织切片（c和d）10倍放大，肾脏组织切片（e和f）10倍倍放大bax（巴克斯）+/+烘烤+/–（a、c和e）和bax（巴克斯）–/–烘烤–/–（b、d和f）小鼠。

除了外周淋巴器官中的淋巴细胞聚集外，还观察到实质器官的淋巴细胞浸润。肝脏中的淋巴细胞浸润为门脉周围和动脉周围(图4B). 肾脏也显示血管周围淋巴细胞浸润。几位老人bax（巴克斯）–/–烘烤–/–小鼠也表现出不同程度的以高细胞性为特征的肾小球疾病。

累积的淋巴细胞bax（巴克斯）–/–烘烤–/–小鼠出现记忆细胞表型

为了确定积聚在bax（巴克斯）–/–烘烤–/–用流式细胞术对小鼠、外周淋巴结和脾脏淋巴细胞进行表型分析。来自对照组和bax（巴克斯）–/–烘烤–/–动物的CD4和CD8 T细胞频率相似(图5A). 然而，积聚在bax（巴克斯）–/–烘烤–/–动物倾向于记忆细胞表型。通过前角光散射测量，T细胞体积较小，缺乏活化标记物如CD25的表达，记忆细胞标记物CD44的表达增加，外周寻址蛋白CD62L的表达减少(图5A). B细胞的百分比在bax（巴克斯）–/–烘烤–/–淋巴结与对照淋巴结比较。然而，B220+淋巴结中的B细胞向B220倾斜明亮的免疫球蛋白D–表型，表明类别转换或记忆B细胞数量增加(图5B). 在脾脏中获得了类似的数据（数据未显示）。从其中一个分离出的T和B细胞bax（巴克斯）–/–或烘烤–/–单一缺陷小鼠没有表现出具有记忆表型的细胞百分比增加。

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外周血淋巴细胞聚集bax（巴克斯）–/–烘烤–/–用流式细胞术分析小鼠记忆细胞丰富和因忽视而死亡的淋巴结细胞外周血淋巴细胞

（A和B）CD4和CD8表达（A）和Thy1.2和B220表达（B）。还分析了门控T细胞的CD44和CD62L表达。还分析了门控B细胞的IgD表达。

（C） 脾脏外周血淋巴细胞bax（巴克斯）–/–烘烤–/–（开放符号）和对照小鼠（封闭符号）培养4天。细胞用PI染色，并在指定时间进行FACS分析。样品分析一式三份。

淋巴细胞来自bax（巴克斯）–/–烘烤–/–老鼠因疏忽而对死亡具有抵抗力

成人中观察到的缺陷bax（巴克斯）–/–烘烤–/–在出生时处死的小鼠中，只观察到淋巴细胞的蓄积。因此，随着动物年龄的增长，Bax和Bak的联合缺乏导致淋巴细胞的积累。淋巴细胞数量的增加可能是生产增加或生存增加的结果。淋巴器官和非淋巴器官的淋巴细胞上的活化标记（如CD25）体积小且缺乏表达bax（巴克斯）–/–烘烤–/–动物们认为细胞的积累是凋亡缺陷的结果。为了解决这个问题bax（巴克斯）–/–烘烤–/–分离对照组小鼠，并在随后的4天内分析悬浮培养中的细胞存活率。图5C显示了通过碘化丙啶染色每天测定的活细胞百分比。脾细胞来自bax（巴克斯）–/–烘烤–/–小鼠的存活率显著提高，显示出疏忽导致死亡的缺陷。相反，Bak缺乏动物和表达Bax和Bak的动物的细胞在单细胞培养中发生凋亡。The ability ofbax（巴克斯）–/–此前曾对因疏忽而死亡的淋巴细胞进行过分析，发现其与野生型小鼠相似(Knudson等人，1995年和数据未显示）。

放射损伤和足叶乙甙诱导但正常Fas诱导的死亡bax（巴克斯）–/–烘烤–/–老鼠

凋亡的经典检测方法之一是胸腺细胞的辐射诱导死亡(威利，1980年). 辐射胸腺细胞已被证明以p53依赖的方式启动凋亡(Clarke等人，1993年;Lowe等人，1993年). 细胞死亡似乎是由涉及线粒体的细胞内在途径激活引起的(Kuida等人，1998年). 两者都不是bax（巴克斯）–/–也不是烘烤–/–动物在辐射诱导凋亡中表现出缺陷(图6A和Knudson等人，1995年). 胸腺细胞来自bax（巴克斯）–/–烘烤–/–与窝友对照组相比，受γ射线照射的动物存活率提高。据报道，化疗药物足叶乙甙治疗后胸腺细胞死亡与p53呈依赖性。胸腺细胞来自bax（巴克斯）–/–烘烤–/–发现对足叶乙甙治疗有耐药性(图6B)，而bax（巴克斯）–/–和烘烤–/–单一缺陷胸腺细胞对这种治疗敏感。相反，当来自bax（巴克斯）–/–烘烤–/–对照组小鼠进行Fas受体交联，bax（巴克斯）–/–烘烤–/–胸腺细胞表现出与对照胸腺细胞相似的敏感性(图6C). 这表明，至少在该组织中，细胞外途径不依赖于Bax或Bak的促凋亡活性。

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胸腺细胞死亡检测bax（巴克斯）–/–烘烤–/–老鼠

（A） 胸腺细胞来自bax（巴克斯）–/–烘烤–/–小鼠和对照小鼠接受500radγ射线照射（封闭栅）或不治疗（开放栅）。细胞在培养24小时后用PI染色并进行FACS分析。给出了每只小鼠三份样品的平均值和标准偏差。

（B） 胸腺细胞与指定量的足叶乙甙一起培养。细胞在培养24小时后用PI染色并进行FACS分析。给出了三份样品的平均值和标准偏差。

（C） 胸腺细胞与指定量的抗Fas抗体一起培养。细胞在培养24小时后用PI染色并进行FACS分析。给出了三份样品的平均值和标准偏差。

讨论

的表型bax（巴克斯）–/–烘烤–/–小鼠明确证明了促凋亡Bcl-2蛋白在哺乳动物发育和组织稳态调节中的重要性。Bax和Bak联合缺乏症的表型明显比两个基因单独缺乏症更为严重和多样。仅Bak缺乏症还没有我们迄今为止能够发现的明显表型。Bax缺乏动物是可以存活的，它们的主要发育缺陷是雄性不育，这与精原细胞室发育停滞有关，从而导致凋亡生殖细胞死亡增加(Knudson等人，1995年). 虽然在缺乏Bax的情况下交感神经元、运动神经元和淋巴细胞略有增加，bax（巴克斯）–/–小鼠行为正常，没有出现任何明显的淋巴增生并发症，雌性小鼠能够繁殖(Knudson等人，1995年;Deckwerth等人，1996年). 相反，bax（巴克斯）–/–烘烤–/–动物的手指、雌性生殖道和中枢神经系统的发育受到严重干扰。bax（巴克斯）–/–烘烤–/–小鼠的造血前体细胞数量增加，成熟淋巴细胞逐渐积累。积聚在体内的淋巴细胞bax（巴克斯）–/–烘烤–/–小鼠因疏忽而死亡，并且对辐射和足叶乙甙诱导的细胞凋亡具有抵抗力。然而bax（巴克斯）–/–烘烤–/–胸腺细胞对Fas信号转导的诱导凋亡作用与野生型胸腺细胞相当。总之，数据表明Bax和Bak在调节由固有细胞死亡途径激活物启动的细胞死亡方面有很大的重叠作用。然而，至少在某些组织中，在缺乏Bax和Bak的情况下，外源性细胞死亡途径可以启动凋亡。

The phenotype ofbax（巴克斯）–/–烘烤–/–小鼠与缺乏参与固有细胞死亡途径的单个基因的小鼠的表型重叠。事实上bax（巴克斯）–/–烘烤–/–在大多数方面，小鼠的表型比所描述的更严重Apaf-1型–/–或半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9–/–老鼠(Cecconi等人，1998年;Kuida等人，1998年;吉田等人，1998年;Honarpour等人，2000年). 淋巴组织积聚和阴道发育失败bax（巴克斯）–/–烘烤–/–尚未描述成年小鼠Apaf-1型–/–或半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9–/–老鼠。两种动物在胚胎发生期间完成了指间网的再吸收Apaf-1型–/–和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9–/–老鼠。此外，已分析的Caspase 9或Apaf-1缺陷的成年小鼠的中枢神经系统没有任何形态学异常。相比之下bax（巴克斯）–/–烘烤–/–我们分析的小鼠表明，脑室周围祖细胞区域的神经元细胞持续增加。

喜欢Apaf-1型–/–和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9–/–小鼠，大多数bax（巴克斯）–/–烘烤–/–小鼠围产期死亡。然而，与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9–/–和Apaf-1型–/–老鼠，我们没有在bax（巴克斯）–/–烘烤–/–动物，也没有颅骨形成缺陷的报告Apaf-1型–/–在bax（巴克斯）–/–烘烤–/–老鼠。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9–/–据报道，由于脑室周围祖细胞区的扩大，动物的心室受到了阻塞(Kuida等人，1998年). 尽管室周祖细胞区在成年后仍然存在bax（巴克斯）–/–烘烤–/–小鼠脑积水似乎不能解释bax（巴克斯）–/–烘烤–/–动物。在bax（巴克斯）–/–烘烤–/–老鼠的死亡似乎是因为新生动物未能哺乳。bax（巴克斯）–/–烘烤–/–人们经常发现幼崽仍然活着，但被它们的母亲忽视，并与其他幼崽分开。养育这些动物的尝试失败了，这表明bax（巴克斯）–/–烘烤–/–动物在哺乳或社交行为方面有缺陷。这可能是由神经元发育异常引起的，例如成年人对听觉刺激和循环行为失去反应。当神经上皮结构发育异常时，通常会出现这些异常(Alagramam等人，1999年). 年曾报道过视神经和内耳发育异常Apaf-1型–/–老鼠(Honarpour等人，2000年). 另外，颅骨形成的异常也会导致听力和行为异常，这可能是由于在Apaf-1型–/–老鼠(吉田等人，1998年). 无论如何，哺乳是一种复杂的行为特征bax（巴克斯）–/–烘烤–/–有效哺乳的小鼠似乎没有一个简单、明显的机械基础。

发育和体内平衡缺陷bax（巴克斯）–/–烘烤–/–小鼠表明Bax和Bak是固有细胞死亡途径的冗余调节器。在参与固有细胞死亡途径的其他基因中没有观察到这种功能冗余，包括Apaf-1、Caspase 9和Caspase 3。的失败bax（巴克斯）–/–烘烤–/–小鼠出现前脑畸形Apaf-1型–/–和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9–/–小鼠可能是由于发育中神经组织中促凋亡Bcl-2家族成员的额外冗余或中枢神经系统中抗凋亡Bcl_2家族成员表达的代偿性变化所致。另外，缺脑可能是由于Apaf-1和Caspase 9能够作为线粒体细胞色素c释放下游细胞死亡决定的放大器，并以某种方式补偿发育过程中过量神经细胞消除过程中Bax和Bak的缺乏。

一些人的能力Apaf-1型–/–和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9–/–小鼠要正常发育，就必须有多余的凋亡途径，这些途径可以消除叉指网，去除多余的神经祖细胞，防止淋巴细胞的积聚(Kuida等人，1998年;Honarpour等人，2000年). 事实上，这些过度积累的细胞持续存在bax（巴克斯）–/–烘烤–/–小鼠表明这些额外的细胞死亡介质依赖于Bax和/或Bak功能。最近有报道称，除了细胞色素c外，其他蛋白质也可以从线粒体中释放出来，从而促进细胞凋亡。其中包括AIF，它在释放后似乎会转移到细胞核并促进DNA降解(Susin等人，1999年)和Smac/DIABLO，它们可以阻断IAP蛋白作为caspase抑制剂的能力(Du等人，2000年;Verhagen等人，2000年). 在缺乏功能性细胞色素c/Apaf-1/Caspase 9复合物的情况下，线粒体释放额外的促凋亡蛋白（如AIF和Smac/DIABLO）的Bax和/或Bak依赖性释放可能导致细胞死亡。

Bax和Bak也被认为是细胞外死亡途径的重要介导物，作为与caspase底物Bid相互作用的分子，诱导线粒体释放细胞色素c(Eskes等人，2000年;Wei等人，2000年). 至少在发育中的胸腺细胞中，Fas诱导的死亡既不需要Bax也不需要Bak。Fas信号转导还诱导胸腺细胞死亡Apaf-1型–/–和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9–/–老鼠(Kuida等人，1998年;吉田等人，1998年). 因此，对于所有组织中的Fas介导的死亡来说，外在和内在途径之间的沟通并非必不可少。或者，额外的促凋亡Bcl-2相关蛋白也可能与Bid相互作用以执行此功能。

总之，这些数据表明促凋亡Bcl-2家族成员在指间网和脑室周围祖细胞区神经元细胞的发育退化中的重要性。女性生殖道发育异常和缺乏听力支持的先前研究表明，Bcl-2家族基因的功能可能在这些复杂组织的发育中起重要作用(石井等人，1996年;罗德里格斯等人，1997年). 最后，淋巴细胞的逐渐积累证明了这些基因在成人组织内稳态控制中的重要性。许多多余细胞的共同特征是在bax（巴克斯）–/–烘烤–/–小鼠认为这些细胞是正常动物中由于细胞生存信号丢失而被清除的细胞。通过靶向表达抗凋亡Bcl-2蛋白的转基因，可以在多个组织中抑制生长因子撤除诱导的细胞死亡（忽视导致的死亡）。这里提供的数据表明，两个促凋亡Bcl-2家族成员同时缺乏也会损害疏忽导致的死亡。与其他中枢凋亡蛋白不同，Bax和Bak在胚胎发育和组织稳态过程中调节多余细胞的消除方面似乎起着重叠的作用。

实验程序

敲除小鼠的产生

基因组组织烘烤小鼠基因已被描述(Ulrich等人，1997年). 制备了一种靶向构建体，用pMCIneo Poly（A）（Stratagene，La Jolla，CA）的1.2kb Xho I–Bam HI片段取代外显子III–VI。该删除从Bak的254 aa编码区中删除了235 aa，包括整个BH1、BH2和BH3域。靶向构建体的59个侧翼包含4.3 kb Bgl II–SalI片段，39个侧翼包含1.2 kb Bgl II–XhoI片段，如图1A. The烘烤靶向结构被电穿孔到R1 ES细胞(Nagy等人，1993年). ES细胞的电穿孔、选择和维持已经在前面进行了描述(Shiels等人，2000年). 通过Southern印迹法对扩增的ES细胞克隆进行同源重组筛选。鉴定出四个独立的ES细胞系，并按说明注射(Shiels等人，2000年). Bax突变小鼠的产生先前已有描述(Knudson等人，1995年).bax（巴克斯）–/–烘烤–/–小鼠是由bax（巴克斯）+/–烘烤+/–父母。这些亲代小鼠由B6.129X1（N9）的异交繁殖而成bax（巴克斯）+/–与（129S3×129X1）×C57BL/6的异交交配的小鼠烘烤+/–老鼠。后代进行基因分型bax（巴克斯）+/–烘烤+/–成对繁殖的老鼠。在最近的育种中，为了最大限度地提高双突变小鼠的产量，也用那些bax（巴克斯）+/–烘烤–/–.通过对剪尾鼠的DNA样本进行PCR，对小鼠进行基因分型。野生型烘烤用5′-GGTGTCACACTAGAGAACTACTC和5′-GAGCCATGAGAGACTTAGC反义引物鉴定等位基因。突变体烘烤使用新霉素基因敏感引物（5′-GCCGGTTTTTTTGTCAAGACCGA）鉴定等位基因。突变体的反义引物烘烤等位基因与野生型等位基因相同。野生型bax（巴克斯）用5′-TGATCAGAACCATCATG和5′-GTTGACCAGTGGTGGCGTAGG反义引物鉴定等位基因。要检测bax（巴克斯）零等位基因，新霉素基因特异性引物（5′-CCGCTCCATTGCTCAGCG）与野生型结合使用bax（巴克斯）上述防感底漆。

Western Blot分析

制备小鼠胸腺和脾脏的单细胞悬液，并在RIPA缓冲液（10 mM Tris[pH8]，140 mM NaCl，1%脱氧胆酸盐，0.1%十二烷基硫酸钠，1%Triton X-100，0.025%NaN）中溶解三添加蛋白酶抑制剂鸡尾酒[Roche，Indianapolis，IN]）。通过比色分析（BCA蛋白质分析，皮尔斯，罗克福德，IL）测定每种裂解液的蛋白质浓度，并在12%的预制SDS-聚丙烯酰胺凝胶（加利福尼亚州圣地亚哥诺维克斯）上溶解20 mg总蛋白质。在使用标准技术转移到硝酸细胞丢失后，用多克隆抗-Bak抗体（Upstate Biotechnology，Lake Placid，NY）检测Western blot。

大体和组织病理学分析

安乐死后，用Hemavet 1500仪器（美国康涅狄格州牛津市CDC Technologies Inc.）采集并分析心脏血液。采集各种组织，并将其固定在10%磷酸盐缓冲福尔马林中（新泽西州斯威德斯伯勒ACCRA实验室）。固定前，大脑从颅骨中取出。使用标准技术将组织包埋、切片、贴装并用苏木精-伊红染色。大脑冠状切片，甲酚紫染色。使用ES 800尼康显微镜和MicroMAX-5MHz-1300Y数码相机（Princeton Instruments，Inc.Trenton NJ）拍摄载玻片的照片，并使用MetaMorph成像系统（Universal Imaging Corporation，West Chester，PA）进行分析。还从淋巴组织中制备了单细胞悬液，用于进一步分析。对于免疫组织化学，对10μm厚的切片进行脱蜡，并使用标准方案进行免疫组织化学(肯德勒和戈尔登，1996年). 主要抗体是抗CD45RB（加州圣地亚哥PharMinen），以1μg/ml的剂量使用，可识别B细胞、大多数T细胞亚群、巨噬细胞和树突状细胞。

流式细胞术

在FACS Calibur上进行流式细胞术，并使用Cell Quest软件（Becton Dickinson；Mountain View，CA）分析数据。使用的抗体包括：CD4 CyChrome（克隆H129.19；加利福尼亚州圣地亚哥Phar Mingen）；CD8-APC（克隆53–6.7；PharMinen）；CD44-CyChrome（克隆IM7；PharMinen）；CD62L-APC（克隆MEL-14；PharMinen）；B220-APC（克隆RA3–6B2；PharMinen）；Thy1.2-PE（克隆OX-7；PharMinen）；和IgD-FITC（克隆11–26c.2a；Phar-Mingen）。通过碘化丙啶排除法（PI；Molecular Probes，Eugene，OR）测定细胞活性。

淋巴细胞死亡检测

从不同基因型的小鼠中分离脾细胞。1 × 105细胞被放置在96周的微孔板上。细胞在添加有10%FBS、100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、4 mM L-谷氨酰胺、5.5×10–5Mβ-巯基乙醇和10 mM Hepes溶液。胸腺细胞死亡分析按所述进行(Kuida等人，1998年). 简而言之，从不同基因型的小鼠中分离出胸腺细胞。用抗Fas抗体（Jo2，PharMinen）加上30μg/ml环己酰亚胺（Sigma）、γ射线（500 rad，Gammacell）、指定剂量的依托泊苷（Clontech，Palo Alto，CA）或完全培养基处理100万个细胞。通过PI排除法测定细胞存活率。

骨髓造血祖细胞检测

骨髓采集如前所述(阿德尔曼等人，1999年). 简单地说，股骨和胫骨与周围肌肉和肌腱分离。骨髓用PBS清除（不含Ca2+或镁2+)补充2%FBS和1%pen/strep。溶解红细胞，并使用Coulter Z2计数器对剩余细胞进行计数。2 × 104将细胞置于含有15%FBS、50 ng/ml rmSCF、10 ng/ml rmIL-3、10 ng/ml rhIL-6、3 U/ml rhEPO、10μg/ml牛胰岛素、200μg/ml人转铁蛋白、1%BSA和10–4Mβ-ME（干细胞技术）。培养物一式三份，在37°C的空气和5%CO中培养2持续5天。根据菌落形态和细胞学染色对菌落形成单位（CFU）进行评分。CFU-GEMM、CFU-M、CFU-GM和CFU-G作为髓系集落进行评分；CFU-E作为红系菌落进行评分；CFU-Meg作为巨核细胞集落进行评分。

致谢

我们感谢实验室的其他成员对手稿进行了有益的讨论和批评。我们感谢Barbi Judd提供的专家技术援助和Susan Kerns提供的专家编辑援助。这项工作得到了美国国立卫生研究院、霍华德·休斯医学研究所和艾布拉姆森家庭癌症研究所的资助。

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