细胞周期。2010年10月15日；9(20): 4153–4163.
乳腺癌RB途径阻断
与疾病亚型、疾病特异性预后和治疗反应的差异相关性
,
1 ,1 ,1 ,1 ,2 ,1,三，4和1 亚当·埃特尔
1Kimmel癌症中心；美国宾夕法尼亚州费城托马斯杰斐逊大学癌症生物学系
杰弗里·迪恩
1Kimmel癌症中心；美国宾夕法尼亚州费城托马斯杰斐逊大学癌症生物学系
Hallgeir Rui公司
1Kimmel癌症中心；美国宾夕法尼亚州费城托马斯杰斐逊大学癌症生物学系
刘成宝
1Kimmel癌症中心；美国宾夕法尼亚州费城托马斯杰斐逊大学癌症生物学系
艾格尼丝·威特基维奇
2病理学，美国宾夕法尼亚州费城托马斯杰斐逊大学
凯伦·克努森
1Kimmel癌症中心；美国宾夕法尼亚州费城托马斯杰斐逊大学癌症生物学系
三美国宾夕法尼亚州费城托马斯·杰斐逊大学泌尿外科
4放射肿瘤学；美国宾夕法尼亚州费城托马斯·杰斐逊大学
埃里克·克努森
1Kimmel癌症中心；美国宾夕法尼亚州费城托马斯杰斐逊大学癌症生物学系
1Kimmel癌症中心；美国宾夕法尼亚州费城托马斯杰斐逊大学癌症生物学系
2病理学，美国宾夕法尼亚州费城托马斯杰斐逊大学
三美国宾夕法尼亚州费城托马斯杰斐逊大学泌尿科
4放射肿瘤学；美国宾夕法尼亚州费城托马斯·杰斐逊大学
通讯作者。 2010年8月6日收到；2010年8月27日接受。
- 补充资料
补充材料
GUID:7D6A7DD7-5532-4D53-9162-2D9602C99B09
摘要
在乳腺癌中，RB抑癌基因的失活被认为是通过多种机制促进肿瘤发生的。然而，RB状态在疾病特异性临床结果中的预后和预测价值仍不确定。我们使用包含900多个乳腺癌患者样本的组合微阵列数据集，在ER阳性和ER阴性疾病的背景下研究RB通路的失调。通过评估通路基因之间的相关性以及由ER状态定义的患者肿瘤人群之间的差异表达，在该数据集中研究了RB通路解除调控的疾病特异性特征。对这些乳腺癌样本的生存分析表明，RB缺失特征与几个独立队列中的不良疾病结局相关。在ER阴性亚群中，RB缺失特征与化疗反应改善和无复发生存期延长相关。此外，虽然RB靶点标记中的单个基因密切再现其预后价值，但它们也用于预测和监测对治疗性化合物的反应，例如细胞抑制剂PD-0332991。这些结果表明，RB-loss标志性表达与乳腺癌的不良预后相关，但根据ER阴性人群的数据预测化疗反应改善。虽然RB缺失特征总体上证明了预后和预测效用，但一小部分标记物可能足以根据RB功能对患者进行分层，并告知选择合适的治疗方案。
关键词：RB、乳腺癌、微阵列、增殖、细胞抑制剂
介绍
乳腺癌是一个主要的健康问题，大约八分之一的女性在一生中会被诊断出患有乳腺癌。1与大多数癌症不同，乳腺癌的预后和治疗在很大程度上取决于生物标志物。2,三例如，雌激素受体α（ER）阳性乳腺癌约占70%的病例，其预后一般较好，可以通过内分泌治疗成功治疗。2相反，ER阴性癌症通常更具侵袭性，治疗选择也更为有限。三,4生物标记物在患者分层中的使用对指导数百万女性的适当治疗具有极大的帮助。不幸的是，在以最佳目标治疗干预的能力方面仍然存在重大缺陷。例如，尽管芳香化酶抑制剂（如来曲唑）和选择性内质网拮抗剂（如三苯氧胺）的目标都是抑制内质网活性，但大量内质网阳性肿瘤将无法通过初级内分泌治疗。2因此，已经做出了重大努力来确定那些有助于对内分泌治疗产生耐药性的途径，以及更有效地识别和治疗这些患者的方法。
广泛的分析表明，在乳腺癌中观察到的许多致癌病变可能有助于在ER阳性疾病中绕过内分泌治疗。2例如，在临床前模型中，ERBB2、EGFR、PTEN/AKT和MAPK/ERK通路的放松调节都可能导致内分泌治疗的旁路。5–8相应地，当直接在临床标本中分析时，有丝分裂信号中的这种损伤与不良的疾病结局相关。重要的是，有丝分裂信号通路通常会结合起来影响细胞周期机制，从而影响肿瘤的增殖状态和内分泌治疗的细胞抑制作用。2具体而言，这些途径已被证明集中于视网膜母细胞瘤抑癌基因（RB）和调节G1-S细胞周期转换。
视网膜母细胞瘤肿瘤抑制物（RB）最初是基于视网膜母细胞癌中的双等位基因失活而定义的，但在许多成人实体癌中通过多种不同的机制失活。9,10在正常静止组织中，RB是活跃的，可以直接介导由转录因子E2F家族调节的明确基因程序的抑制。9,11有丝分裂或致癌信号分子通过诱导D型细胞周期蛋白的表达而影响RB，从而增加CDK活性。12,13这些激酶复合物磷酸化RB蛋白，从而减轻RB介导的转录抑制。14因此，DNA复制、有丝分裂和胞质分裂相关基因的表达被诱导。15因此，RB在协调细胞周期进展和细胞增殖所需基因的表达方面发挥着关键作用。
在乳腺癌中，RB-pathway被认为是通过几种相互排斥的机制失活的。最重要的是，cyclin D1基因的过度表达或扩增(CCND1号机组)在多达50%的乳腺癌中观察到，据信它会导致RB蛋白异常磷酸化/失活。16同样，CDK抑制剂p16的失活墨水4a(CDKN2A型)有助于RB磷酸化的放松调节，并在部分乳腺癌病例中被沉默。17–19最后，RB基因杂合性缺失(RB1型)该位点在20-30%的乳腺癌中被定义，RB蛋白在组织学上的丢失频率不同。10,20尽管进行了这些分析，但研究尚未对乳腺癌RB途径失调的影响形成一致的描述。
结果
为了确定RB通路失调在乳腺癌中的影响，在一个庞大而多样的乳腺癌病例队列中研究了RB协调的基因表达程序的行为和影响(补充表1). RB-签名由159个基因组成(补充表2)在以下三个模型系统中至少有两个系统中发现了共同点：成纤维细胞模型中RB缺失上调，15被RB激活所抑制，21或通过小鼠肝脏中急性RB缺失上调（Bourgo等人正在准备中）。该基因表达程序与E2F调节的基因集高度一致，包括涉及DNA复制、有丝分裂和胞质分裂的因素。
为了分析该基因表达程序在乳腺癌背景下的调控和影响，从公共微阵列数据库中汇编了2254例乳腺癌病例的队列。其中，1740例为ER阳性，514例为ER阴性。936个独特样本的无复发生存数据可用，其中790个被鉴定为ER阳性，146个被鉴定为ER阴性。对这些样本中RB缺失特征的分析产生了三个重要发现。首先，ER阴性肿瘤通常在RB缺失信号中表现出最高的表达值(补充图1). 这些发现表明，RB功能最严重的破坏发生在ER阴性疾病中，这与研究结果一致，研究表明组织学RB丢失在ER阴性肿瘤中更为普遍。19,22,23其次，人类数据集中的大多数RB缺失特征基因是正相关的。这一发现表明，在简单模型系统中定义的RB损失特征在很大程度上保持在人类肿瘤标本的背景下。第三，这些分析表明，与正常对照组相比，肿瘤样本中RB-loss标志性表达升高。然而，ER-阳性和ER-阴性疾病都存在显著的异质性，其中一部分肿瘤样本的水平与正常组织一致。综上所述，这些发现为定义那些与RB-gene表达程序放松调控特别相关的分子因素和临床结果提供了大量机会。
最初，我们利用基因表达数据来确定RB靶点特征与RB主要成员表达水平的关系（例如。，RB1、CCND1和CDKN2A型)这将直接有助于乳腺癌基因表达的病理性放松调控。最初在所有正常乳腺样本和所有肿瘤样本的简化子集中比较这些通路成员之间的相关性(和B). 在这种情况下，RB签名和RB1型和CDKN2A型在健康和肿瘤样本中均观察到基因，而与CCND1号机组在健康样本中，但不在肿瘤样本中。为了确定这种矛盾的关联是否是乳腺癌标本异质性的表现，我们分析了ER阳性和ER阴性乳腺癌亚群中的这些关系(). 结果表明CCND1号机组成绩单，但不是CDKN2A型与ER阳性疾病中的RB信号适度相关(). 差异表达分析显示，在ER阳性乳腺癌中，CCND1号机组水平普遍高于ER阴性疾病()，但情况正好相反CDKN2A型(). RB转录水平通常在肿瘤之间变化不大()尽管在ER阳性疾病中，RB转录物实际上与RB缺失信号升高相关。这一发现大体上与以下概念一致：RB仅在ER阳性乳腺癌中很少丢失，并且转录物随着E2F活性的放松而受到积极调节。24相反，在ER阴性的癌症中CCND1号机组或RB1型带有RB缺失签名的抄本，相当高CDKN2A型与RB缺失信号升高相关的转录本(). 这一发现表明，ER-阴性肿瘤具有遗传损伤，在高表达的情况下可以解除RB介导的转录调控CDKN2A型表达式。这种发现与组织学评估一致，其中RB阴性肿瘤表现出p16升高墨水4a表达式。17
正常和肿瘤样本中RB靶点特征和相关基因的相对表达。RB/CCND1通路中的基因与RB缺失信号量之间的相关性显示在（A）正常乳腺，（B）所有肿瘤样本和（C）ER阳性和（D）ER阴性样本的子集的表达水平热图上。箱线图显示RB靶信号和RB/CCND1通路基因的（E–H）相对转录表达水平。（I） 用RB途径成员的指示抗体对ER阳性和ER阴性的人乳腺癌细胞裂解物进行免疫印迹。（J） 肿瘤标本的AQUA免疫组化联合染色显示蛋白。细胞角蛋白（绿色）用于检测上皮细胞。Dapi（蓝色）染色检测切片中的所有细胞核。靶蛋白染色为红色。健康乳腺、所有肿瘤样本和肿瘤样本的RB靶信号和RB/CCND1通路基因的相对蛋白水平按ER状态分层。
为了确定核心RB通路转录物和不同形式乳腺癌之间的关联是否代表了蛋白表达的改变，RB、cyclin D1和p16的蛋白水平墨迹4a在细胞培养模型系统中进行初步评估(). 这些数据表明，高水平的p16墨水4a与未检测到的RB蛋白水平相关。对一个包含120个人类乳腺癌样本的独立肿瘤标本进行蛋白质分析。具体而言，采用基于荧光的AQUA免疫染色定量测定Ki67、Cyclin D1、p16的水平墨水4a乳腺癌标本中的RB蛋白。回顾了典型肿瘤病例的AQUA免疫组化染色()比较了正常乳腺、所有肿瘤以及ER阳性和ER阴性亚组的蛋白质水平(). 这些数据表明，在RNA水平上观察到的关系实际上是通过临床样本中蛋白质表达的变化来概括的。
功能富集分析用于通过评估与RB缺失特征呈正相关或负相关的基因集来确定与RB靶基因相关的生物功能(补充表3和4). 与RB丢失信号负相关的生物过程包括细胞通讯和信号转导。与正相关基因相关的术语表明增殖是一个主要主题，包括细胞分裂和DNA复制的GO生物过程。除了RB缺失特征外，还有许多基因特征与癌症的增殖和不良预后有关。以前乳腺癌研究中使用的这些基因集包括“增殖特征”和“基因组等级指数”。有趣的是，尽管每个基因集都高度富集了细胞周期调控基因，但三个基因列表中只有32个基因是共同的(). 这一发现表明，不同的实验方法定义了功能相似但基本上是独特的基因集。尽管有此发现，但无论ER状态如何，正常乳腺组织和乳腺癌患者的平均基因表达特征几乎相同(). 因此，尽管特异性基因在很大程度上是不同的，ER-阳性和ER-阴性乳腺癌中细胞周期放松调控的近端机制很可能不同，但在参与的增殖程序中存在广泛的共性。
RB靶点特征与代表细胞增殖和组织学肿瘤分级的特征之间的相关性。（A） 维恩图表示RB靶信号、增殖信号和GGI信号之间的重叠。（B–E）RB丢失、增殖和GGI信号的表达高度相关。
为了确定RB的致病影响，评估了RB缺失特征与疾病结局的相关性。在我们的整个肿瘤标本队列中，RB信号高表达时明显的RB通路失调与疾病预后不良相关(). 对ER-阳性和ER-阴性病例的分析显示，RB-途径放松管制的影响显著不一致。在ER阳性疾病中，高RB丢失特征表达与不良疾病结局之间存在高度显著的相关性()，而在ER阴性疾病中，相反的趋势是明显的(和D). 这些发现表明，RB途径放松管制并不是普遍与不良疾病结局相关，并且可能在疾病亚型中发生改变。
RB-loss特征表达定义的亚群无复发生存率。对于（A）所有肿瘤样本，（B）ER-阳性子集和（C）ER-阴性子集，显示了低、中、高RB-丢失特征量的生存曲线。使用在ER阴性人群中建立的截止值，对ER阳性和ER阴性生存曲线进行了比较，如（D）所示。
考虑到ER阳性与ER阴性疾病中RB通路行为的明显差异，这些差异可能反映了这些亚群中使用的不同治疗方案。在ER阳性患者中，评估RB丢失信号调节与单独手术或手术加辅助三苯氧胺治疗的反应之间的关系。在没有辅助治疗的情况下接受手术治疗的ER阳性患者中，RB丢失标志是不良疾病预后的预后(). 这一发现表明，RB丢失的肿瘤具有更大的转移潜能，并且有证据表明，在ER阳性病例中，临床肿瘤样本显示RB信号过度表达与远处转移事件显著相关（p=8.6×10−4). 对接受三苯氧胺治疗的ER阳性患者的分析表明，这些患者中RB-loss标志物的高表达与治疗反应不良有关，而RB-loss-signature表达低的患者如果接受三苯二甲胺治疗，通常预后良好(). 在几个独立的患者队列中，仅手术患者组和接受辅助三苯氧胺治疗的患者组的生存分析表明预后与RB丢失信号量呈负相关(补充图2). 这些发现表明，RB功能是高危侵袭性ER阳性乳腺癌的一般指标，有术后复发的倾向。
ER阳性人群的无复发生存率，按治疗状态和RB丢失特征分层。（A） 在仅进行手术的ER阳性样本中，不良预后与高RB丢失特征[51%的10年无复发生存率（rfs）]和低RB丢失标记（95%的10年rfs）相关。（B） 在接受他莫昔芬治疗的ER阳性患者中，与低RB缺失特征样本（92%的10年rfs）相比，高RB缺失标志样本的结果有所改善（66%的10岁rfs）。
随后在已知化疗治疗状态的患者中探讨了ER阴性病例中高RB丢失特征的影响。在ER阴性化疗治疗人群中进行的生存分析不包括低RB表达特征组，因为该组已知化疗状态的样本数量不足（仅包括三次复发事件）。因此，与ER阴性疾病化疗相关的生存曲线仅限于具有高RB丢失特征的样本。一般来说，ER阴性样本中高RB缺失特征表达的结果似乎比ER阳性样本中的高RB丢失特征表达的效果更好(). 然而，一旦将接受化疗的患者从比较中剔除，RB-loss信号高表达的ER阴性患者五年生存率为50%，与ER阳性人群相似(). 此外，在未接受化疗的ER阴性患者中，低RB丢失信号表达与高RB丢失标记表达的生存情况之间没有明显差异(). 虽然已知化疗治疗的ER阴性病例数量有限，并且在该数据集中的功效较低，但当RB高表达患者接受阿霉素和环磷酰胺（AC）化疗方案时，无复发生存率显著提高(). 为了扩大这一发现，我们使用病理反应作为疾病结局的衡量标准，评估了额外样本中高RB丢失信号与低RB丢失特征对化疗的反应。在接受阿霉素联合氟尿嘧啶和环磷酰胺（FAC）治疗的患者组中，发现ER-阳性和ER-阴性疾病的高RB-丢失特征组中病理完全缓解（pCR）患者的百分比增加(和E). 在ER阴性患者中，大多数RB缺失特征表达高的患者经历了pCR，而在RB缺失标记表达低的大多数患者中发生了进展性疾病（PD）。这一结果支持了这样一种观点，即高RB损失特征表达与化疗反应的更好结果相关。然而，在接受顺铂治疗的ER阴性患者队列中，高RB丢失标志组的反应是异质的，而低RB丢失标记组的所有患者都达到了pCR(). AC和FAC治疗组的研究结果一致表明，尽管与RB丢失相关的高增殖程度与ER阳性病例的不良预后相关，但ER阴性病例的高RB丢失特征与对一组化疗方案的反应相关。
ER阴性人群中与RB丢失特征和治疗方案相关的疾病结局。（A） 高RB-loss信号表达与ER阳性与ER阴性的不同结果相关。（B） 在ER阳性和未经治疗的ER阴性样本中，高RB缺失特征表达与相似的生存情况相关。（C） 在具有高RB-loss特征表达的ER阴性样本中，化疗与更好的结果相关。（D） 接受FAC治疗的ER阳性患者的高与低RB丢失特征组中pCR和PD的比例。（E） 接受FAC治疗的ER阴性患者的高与低RB丢失特征组中pCR和PD的比例。（F） 接受顺铂治疗的ER阴性患者的高与低RB损失特征组中pCR、pPR和PD的比例。
由于本文的研究结果表明，通过RB途径调节基因表达可能对细胞抑制治疗反应很重要，因此在乳腺癌细胞系的背景下评估了CDK4/6抑制剂PD-0332991的疗效。这种药物通过RB途径发挥作用，并被假定在乳腺癌标本中具有疗效。与这些发现一致，PD-0332991治疗对MCF-7和MD-MB-231细胞具有深刻的细胞抑制作用，但对BT-549细胞没有影响(). 在这些情况下，PD-0332991对生长抑制有效，与RB签名相关的基因产物显著减弱。例如，在保留功能性RB的细胞系中，EZH2、胸苷酸合成酶和Topo IIα在PD-0332991的上下文中均受到抑制(). 因此，这些标志物的稳态水平不仅对预测治疗反应很重要，而且可以用作治疗反应的生物监测器。在微阵列数据集中还评估了RB信号中这些单个基因预测疾病结果的潜力(). 有趣的是EZH2、TYMS和TOP2A公司在预测疾病结果方面是有效的。此外，一些原型基因，如MKI67、CCNB1、TOP2A、BIRC5和FOXM1型在ER阳性样本中显示出显著的预后价值，并且在多个独立患者群体中具有统计学意义(补充图3和4). 因此，一小部分基因可以提供高度显著的预测能力，作为ER-阳性乳腺癌RB/E2F通路放松调控的替代物。
靶向治疗的候选标记物。（A） 用500 nM PD-0332991或DMSO对照品处理人乳腺癌细胞株24小时。显示BrdU阳性百分比（占总数）。（B） 用500 nM PD-0332991或DMSO对照品处理人乳腺癌细胞株24小时。对细胞裂解液进行免疫印迹分析，以获得指示的蛋白质。（C） 乳腺癌人群无复发生存曲线按个体基因转录水平分层。
讨论
RB通路在癌症中经常被破坏，据信在疾病进展中起着内在作用。20然而，RB功能与乳腺癌治疗的预测和预后意义尚不明确。在这里，我们证明乳腺癌的RB-通路调节存在内在异质性，这种异质性与疾病发病机制中的显著分子畸变和整体改变有关。
先前的研究通过组织学分析对RB通路的病变进行了研究。这些研究在乳腺癌RB改变的频率以及对疾病结局的相对影响方面产生了高度不一致的数据。在这里，我们利用基因表达谱方法来研究RB通路失调的下游影响。RB丢失或E2F解除调控的模型系统已经产生了RB下游的高度可重复的基因谱。10,15,21,25–27无论疾病亚型如何，这些靶基因的表达谱在乳腺癌病例中高度相关。然而，RB靶基因解除调控的程度在乳腺癌亚型之间存在差异。具体而言，在ER阴性乳腺癌病例中，观察到RB靶基因表达的最大放松调节。这一发现表明，RB功能的直接异常发生在这种形式的乳腺癌中。有趣的是，在ER阴性疾病中CDKN2A型这与RB签名有关。CDKN2A/p16墨水4a与RB基因的完全失活协同上调，如通过基因缺失或用病毒癌蛋白沉默而发生的。17,28,29因此，这些综合结果表明，在ER阴性疾病中，RB功能受损的机制类似于RB基因缺失。令人惊讶的是，虽然在ER阴性疾病中经常观察到LOH和RB的组织学丢失，22,30在这些肿瘤中RB转录表达仅略有下降。这一发现表明，RB失调要么是由于突变，要么是由于翻译后机制，而这些机制在我们的数据集中并没有被质疑。与ER阴性疾病的观察结果相比，ER阳性疾病中RB重建调节的分子基础与异常的有丝分裂信号更加一致。具体来说，与细胞周期蛋白D1呈正相关，但与CDKN2A型相应地，RB的组织学丢失在ER阳性疾病中相对少见。22通过研究正相关/反相关基因，我们试图确定在ER阳性疾病中驱动RB激活的途径。有趣的是，唯一的正相关基因是额外的增殖相关基因，而负相关基因属于细胞通讯和信号转导类别。虽然尚不清楚在疾病状态下是什么导致RB功能失活，但增殖增加和信号转导减少的相关后果是癌症进展的标志。
总的来说，有人假设RB通路功能的放松调节与快速生长的肿瘤相关，而这些肿瘤本身预后较差。令人惊讶的是，情况并非如此。在ER阴性疾病中，RB功能状态对未接受化疗的患者的疾病结局影响不大。然而，在接受化疗的ER阴性患者中，RB功能状态的丧失与更长的无复发生存期相关，这与之前的研究结果一致，即RB丧失可以增加对常规化疗的敏感性，而常规化疗广泛用于治疗ER阴性疾病。10,20,22,23,30–32在ER阳性疾病中，RB通路中断与所有患者的不良疾病结局相关。这反映了单纯手术治疗预后特别差。据推测，这种对生存率的影响可能是由于存在逃避手术干预的微转移。与这一概念一致，RB缺乏与分析的患者样本中转移风险显著增加相关。由于目前大多数ER阳性疾病都是通过内分泌疗法治疗的，我们评估了RB功能与持久治疗反应的关系。这些研究结果表明，RB-途径的失调与三苯氧胺治疗的不良反应密切相关，尽管RB-丢失高表达的患者似乎受益于三苯氧芬治疗，10年生存率为66%，而单纯手术的10年存活率为52%（p=0.064）。即使如此，那些存在这种失调的肿瘤也可以从更积极的治疗干预中受益。当然，这种理性的决策将取决于前瞻性地监测RB-横向放松管制的能力。具体而言，在RB丢失特征高且保留功能性RB蛋白的情况下（如ER阳性乳腺癌的情况），PD-0332991等化合物可能被证明是一种有效的干预措施。在经PD-0332991治疗的乳腺癌细胞系中，RB靶点的表达减少与该化合物的细胞抑制作用有关，这表明RB缺失信号可能作为治疗反应的标志。33这些结果表明，虽然RB-loss标志性表达与乳腺癌的不良预后相关，但它表明化疗有良好的反应，并可能提供细胞抑制治疗反应的读数。在临床环境中应用RB缺失特征的一个重要警告是，RB靶基因的一小部分将提供更实用的临床检测。如图所示，单个基因具有相对较强的预测能力，这表明利用相对较小的一组标记足以根据RB通路对患者进行分层，并告知治疗利用情况。
总之，这些发现强调了RB通路在乳腺癌发病机制中的重要性，也是治疗反应的关键决定因素。此外，RB缺失信号中单个基因谱的强大预测能力表明，基于一小部分RB通路基因的预测性测试在指导当前和发展中的治疗策略治疗乳腺癌方面具有重要意义。
材料和方法
微阵列数据集选择和规范化。
乳腺癌微阵列数据集和临床无病生存数据从基因表达总览（GEO，网址：www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)34和ArrayExpress(网址：www.ebi.ac.uk/microarray-as/aer/).35用于分析的公开微阵列数据集和样本的完整列表见补充表1.来自Affymetrix U133A、U133Av2、U133plus2和U133plus 2HT基因芯片的微阵列样本CEL文件在Matlab版本2009b（the MathWorks，Natick，MA）中使用36并使用所有这些平台中通用的22768个探针集合并到一个组合数据集。使用的归一化过程是一种改进的鲁棒多芯片平均（RMA），它对每个CEL文件应用背景调整，然后分别使用预计算的分位数和来自大型训练集的行效果应用分位数归一化和摘要。37,38标准化数据集中22768个问题的注释来自HGU133A注释文件版本na29，日期为7月6日第个，2009年，从Affymetrix网站下载(网址：www.affmetrix.com/). 根据基因符号，在22768个探针中鉴定出13004个独特基因。映射到一个共同基因的多个探针通过将它们的行平均并按最大标准偏差的探针缩放来合并。
预测ER状态。
在我们的组合微阵列数据集中，68%的用于生存分析的样本具有临床ER状态。我们评估了ER基因的转录表达(ESR1系列)作为临床ER状态的替代物，以最大化我们数据集中可用样本的数量。两者之间相关性高ESR1系列通过免疫组织化学染色观察到的转录水平和临床状态已经得到证实。39我们观察到ESR1系列转录水平在乳腺癌数据集中有双峰表达，并与数据拟合出一个双组分正常混合物，并在RMA表达值为7.5时确定了高/低表达截止值。根据该表达截止值将样本分为ER阳性和ER阴性，并根据可用的临床数据验证预测的ER状态，其准确率为91%。预测的ER状态基于ESR1系列转录表达阈值用于表示完整数据集的ER状态。
RB-loss签名。
RB缺失特征是使用在模型系统中确定的以下三个基因集中的任意两个中出现的基因定义的：在纤维瘤模型中RB缺失上调的基因，15受RB激活抑制的基因，21或基因因小鼠肝脏中急性RB缺失而上调（Bourgo等人正在准备中）。通过基因符号将包含159个基因的RB-loss签名映射到HGU133平台，在阵列上的22768个常见探针中有138个基因。通过将每个基因的表达谱中位数居中，然后对签名中的所有138个基因进行平均，计算出平均RB丢失特征量。
聚类和相关分析。
在所有乳腺组织样本以及健康和肿瘤亚群中，计算平均RB丢失特征与HGU133阵列上每个基因之间的Pearson相关性。皮尔逊相关系数，R（右），用于定义四个基因集：具有R（右）肿瘤中≥0.75，基因R（右）肿瘤中≥−0.5，基因R（右）健康乳房和基因≥0.75R（右）健康乳房≤−0.5。对这些基因集中的每一个进行过表达基因本体（GO）评估40使用注释、可视化和集成发现在线数据库（DAVID）的生物过程。41
细胞培养和PD-0332991治疗。
本研究中使用的所有细胞系均来自美国型培养物收集中心（ATCC，Manassas，VA）。MCF10A细胞在含有5%马血清的DMEM/F12培养基中培养，补充20 ng/mL EGF、0.5 mg/mL氢化可的松、10µg/mL胰岛素、100 U/mL青霉素/链霉素和2 mM L-谷氨酰胺。BT-549细胞在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素/链霉素和2 mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640中增殖。所有其他乳腺癌细胞系均保存在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素/链霉素和2 mM L-谷氨酰胺的DMEM中。所有细胞在37°C和5%CO下培养2用台盼蓝排除法对所有细胞进行计数以进行实验接种。对于所有处理实验，细胞以5×10的密度接种5放入10厘米的盘子中，并让其粘附过夜。PD-0332991处理在500 nM浓度下进行，在二甲基亚砜中重新配制，持续24小时。使用等量的二甲基亚砜作为治疗对照。
BrdU掺入和流式细胞术分析。
细胞在收获前用BrdU脉冲标记一小时。收获细胞并在4°C下在70%EtOH中固定过夜。如前所述，为流式细胞术制备细胞。42BrdU数据表示为总人口的百分比。所有实验均由至少两个独立实验中的三个实验组成。
免疫印迹分析。
细胞裂解物通过SDS-PAGE溶解并转移到Immobilon-P膜上。使用抗体检测以下蛋白质：Lamin B（Santa Cruz；M-20）、Cyclin A（Santa Cruz；H-432）、p16墨水4a（圣克鲁斯；H-156）、Beta-tubulin（圣克鲁兹；D-10）、拓扑异构酶II-alpha（圣克鲁茨；S-18）、RB（Becton-Dickson；G3-245）、Cyclin D1（新标记物；Ab-3）；EZH2（Invitrogen；49–1043），胸苷酸合成酶（Abcam；TS-106）。
RB蛋白表达。
使用单独的180个样本乳腺癌数据集评估乳腺癌与健康组织中RB通路蛋白的表达。这个180个样本的数据集包含40个健康样本、20个DCIS样本、100个IDC样本和20个转移样本。43免疫组织化学标记用于蛋白质染色，包括ER（Dako；1D5）、p16（mtm laboratories；E6H4™）、cyclin-D1a（NeoMarkers；Ab-3）、Ki67（达科；MIB1）和RB（Labvision；1F8）。使用AQUA/PM2000平台（HistorRx，纽黑文，CT）对基于荧光的免疫染色进行成像，并生成每个目标蛋白的强度得分。缺失值使用十个最近邻样本的平均值进行插补。在IDC和转移性样本中，ER-AQUA评分用于定义ER-阳性样本，高于30第个低于30的百分位和ER-阴性样本第个百分位数，基于估计30%的乳腺癌病例为ER阴性。
RB-loss特征基因和功能相关基因之间的比较。
根据RB/p16/cyclin-D1通路的关键成员（包括p16）评估RB缺失信号(CDKN2A型)，细胞周期蛋白-D1(CCND1号机组)，Ki67(MKI67型)和RB(RB1型). 在正常组织、肿瘤组织以及ER阳性和阴性亚群中，计算每个基因相对于RB丢失特征的Pearson相关系数。ANOVA用于测试RB-loss特征和这些关键通路基因在肿瘤与正常乳腺癌以及ER阴性与ER阳性乳腺癌的比较中的差异表达。另一个包含180个乳腺癌样本的数据集用于在蛋白质水平上比较RB-RB/p16/cyclin-D1通路的关键成员。基于log，ANOVA用于检测cyclin-D1、p16、Ki67和RB蛋白的差异表达2肿瘤与正常乳腺癌、ER阴性与ER阳性乳腺癌的AQUA评分比较。
将RB-loss特征与代表肿瘤增殖和分化的基因特征进行比较，以确定其基因组成和表达谱之间的相似性。从多项研究中汇编了一组增殖基因30,44–46包括具有预后意义的基因。已经使用基因组分级指数（GGI）描述了代表肿瘤分化和组织学分级的基因，并且也证明了其预后意义。47基于基因符号识别三个签名之间的重叠。除了ER阳性和ER阴性亚群外，还计算了健康乳腺样本和所有肿瘤样本中增殖和GGI表达特征与RB缺失特征的Pearson相关系数。为了进一步确定RB-loss标志的增殖能力，使用Pearson’s chi-square检验对具有高RB-loss标志表达的样本中的转移事件比例进行显著性检验。
生存分析。
使用Kaplan-Meier曲线对所有肿瘤样本以及ER阳性和ER阴性亚群的无复发生存率进行生存分析。X-Tile软件48根据每个亚组的10年无复发生存率，确定低、中、高表达的最佳切割点。基于十年生存数据生成对数-秩和检验p值。通过比较基于ER阴性分析中定义的低切点和高切点的亚群，比较ER阳性和ER阴性疾病的Kaplan-Meier生存曲线，其中，低于0.25个表达切点的样本被归类为低，高于0.73个表达切点的样本被分类为高。还对已知治疗方案的亚群进行了生存分析。在ER阳性样本中，使用Kaplan-Meier曲线评估RB-loss特征表达高的亚群与RB-loss-signature表达低的亚群对内分泌（三苯氧胺）治疗的反应。在ER阴性样本中，使用Kaplan-Meier曲线评估依赖于RB丢失特征的亚群生存率，包括化疗和未化疗。在统一的微阵列数据集中，只有一个ER阴性队列（ArrayExpress加入E-TABM-158）的复发间隔可用。由于具有可用治疗数据的ER阴性样本数量有限，低RB缺失特征表达群体被扩展为包括0.73表达切点以下的样本，而高于该切点的样本仍被视为高RB缺失标志表达。对这些亚群进行生存分析，以评估未治疗患者的预后以及依赖RB-loss标志的化疗反应。为了进一步加强对ER阴性样本中RB缺失特征的分析，两个独立的队列数据集，以登录号MDA133进行了识别，49和GSE18864，50其中包括对接受化疗的ER阴性患者的病理反应进行单独分析。这两个数据集用于评估高RB丢失与低RB丢失特征患者的病理反应程度。在每个数据集中，平均RB丢失特征被用于将患者分为下四分位、四分位间和上四分位范围。比较上四分位和下四分位表达组中出现病理完全反应（pCR）、病理部分反应（pPR）和复发或进展性疾病（PD）的患者比例。上四分位和下四分位组之间观察到的差异的p值是使用皮尔逊二次方检验计算的。
致谢
国家癌症研究所拨款CA129134（E.S.Knudsen）、CA118740（H.Rui）和Komen用于治疗承诺拨款KG091116（H.Rai）。
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