斑马鱼的背钯，达尼奥雷里奥（鲤科，真骨鱼类）

端脑罗斯特拉极的NADPHd-活性

我们通过分析成年斑马鱼嘴极的连续切片，追踪这些起源的拓扑位置。在这里，我们利用了这样一个事实，即在大脑皮层的头端，所有主要区域都可以通过NADPHd-活性的染色很容易地辨别出来(图3A-E). 我们发现端脑头极的苍白带位置（如图2A-C)与中等水平的患者明显不同(图3A-E). 在大多数前部(图3A+B)蓝色NADPHd-阳性Dl区不面向内侧（Dm）区，而是位于稀疏的NADPHd阳性中央（Dc）区的侧面。Dc位于这些前部，垂直夹在内侧（Dm）和外侧（Dl）区之间。最重要的是，中央（Dc）区——我们的背侧皮质分裂候选区——延伸到背侧增殖基质（用箭头标记图3A+B). 因此，Dc在背侧增殖区有自己的生发区。

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图3

斑马鱼大脑皮层连续切片中的NADPHd活性。(一个和B类)在这些最前面的部分中，中央（Dc）区垂直夹在内侧（Dm）区和外侧（Dl）区之间。图中，中央（Dc）区包括增殖基质中的生发区（如箭头所示图1A和B). 小硅片沟（Y）表现为一个小凹陷(图1B)中间（Dm）区和中央（Dc）区之间。(C类和D类)深蓝色染色的外侧（Dl）区越来越多地覆盖在更多后部的中央（Dc）区。在这一层面上，中央（Dc）区出现腹侧移位，可见小硅片沟，即内侧（Dm）区和外侧（Dl）区之间的大间隙（Y）。注意，在腹侧移位的中央（Dc）区顶部可以看到Dc的生发区（如箭头所示图2C、D). (E类)外侧（Dl）区在随后的后部完全覆盖中央（Dc）区。我们假设，小硅片沟（Y图3B-E)Dc的中心位置是复杂的向外向内折叠的结果（比较图7 A). 厚厚的黑色箭头表示在这个假设的折叠过程中内侧（Dm）和外侧（Dl）区域的突出物。

在更后面的水平(图3C)外侧（Dl）区开始覆盖中央（Dc）区，包括其背侧增殖基质（用箭头标记）。此外，在Dl和Dm之间开始出现一个大凹痕。更靠后的是，这个凹痕扩大了(图3D)并形成了下硅沟（Y）(图3E). 在更多的尾部切片上，Dc的背侧增殖区（起源的萌芽片）是一条独特的红细胞线（如箭头所示图3B+C)将边界划分为相邻的内侧（Dm）和外侧（Dl）区域。在更多的尾部切片中，NADPHd-强阳性的外侧（Dl）区完全覆盖了这张生发片（箭头指向图3C+D)和整个标记稀疏的中央（Dc）区(图3C-E). 总之，这些发现表明，在发育过程中，中央（Dc）区从腹侧沉入大脑皮层中心。我们称此过程为内陷在我们的内外折叠假设中图7A这一过程的主要力量可能是发育过程中内侧（Dm）和外侧（Dl）区域的差异生长过程。我们假设，在发育过程中，内侧（Dm）区和外侧（Dl）区分别向外侧和内侧生长。我们称之为这个过程突起(图7A).

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图7

斑马鱼大脑皮层的复杂外翻模型和拓扑结构。(一个)硬骨膜由哺乳动物的四个相同的大脑皮层组成。成人的位置和拓扑起源被三个主要的发育事件所掩盖。首先，如前所述，后（Dp）区（外侧大脑皮层，LP）是整个大脑皮层放射状迁移的结果(Wullimann和Mueller，2004年). 其次，大脑皮层核心的中央（Dc）区是从背侧位置向内凹陷的背侧大脑皮层（DP）。第三，外侧（Dl）区是在发育过程中向内侧突出的内侧大脑皮层（MP）。注意，这个模型解释了作为内陷的必然结果的小硅质沟的起源。(B类)带有拓扑命名的示意图部分。与小鼠相比，斑马鱼大脑皮层及其四个大脑皮层分区。斑马鱼端脑具有一个腹侧苍白球（VP），其拓扑对应于哺乳动物基底外侧杏仁核，一个外侧苍白细胞（LP）对应于哺乳动物梨状皮质，一个背侧苍皮细胞（DP）对应于（iso-）皮质，以及一个内侧苍白血球（MP）对应于海马。注意，斑马鱼的侧嗅道（批次）与小鼠中同名的嗅道同源。(C类)小鼠端脑简化后(Medina等人，2004年;Puelles等人，2000年).

Dc被Dl移位也改变了我们对小硅片沟（Y）的理解(图3B). 小硅片沟（Y）被解释为Dm和Dl之间的一个独立且稳定的解剖标志。然而，我们的结果表明，这只适用于端脑后部。在最前面的水平，小硅片沟（Y）标志着内侧（Dm）区和中央（Dc）区之间的边界(图3B). 这是因为在这里，中央（Dc）区，包括其生发增殖层，到达端脑的背侧顶部。斑马鱼没有背部（Dd）区。

Parvalbumin免疫反应证实四个Palli单位

为了证实斑马鱼大脑皮层仅包含四个组织发生单位，我们检测了小白蛋白的分布。事实上，在成年斑马鱼中，parvalbumin与NADPHd标记了相同的四个大脑皮层区(图4A-D). 例如，外侧（Dl）区显示出许多与背侧增殖层腹侧相邻的微小阳性细胞，微小阳性细胞位于Dl周围，以及强标记的微小阳性纤维（在图5E). 相反，中央（Dc）区与上覆的外侧（Dl）区明显不同，因为在其增殖层和周围均无小白蛋白阳性细胞。Dc中存在许多小白球蛋白纤维，这使该苍白球单位与相邻的内侧（Dm）区和后侧（Dp）区分开，后者均缺乏小白球素的表达。请注意，也包括外侧嗅束（lot），它将嗅觉投射到后（Dp）区和带核(莱文和德蒂尔，1985年;诺思卡特，2008)定义为缺乏细小白蛋白阳性纤维(图4A).

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图4

斑马鱼端脑的冠状切片被小黄素染色。(A-D公司)小白蛋白阳性细胞和纤维的差异分布揭示了斑马鱼端脑前部的所有四个苍白球分裂。大脑皮层外侧（Dl）区显示许多小白蛋白阳性细胞，位于背侧增殖区及其周边的腹侧（4C+D），并显示许多小红蛋白阳性纤维（A-D）。相反，中央（Dc）区也显示出许多微小阳性纤维，但定义为缺乏微小阳性细胞。在所有这些水平上，内侧（Dm）区基本上没有小淋巴结阳性结构。外侧嗅道（lot；图A）及其主要投射区域，即后（Dp）区（图C+D），均不含细小白蛋白。在小叶下的腹侧（Vv）核和背侧（Vd）核中发现稀疏的小叶蛋白阳性神经元（图B-D）。大脑皮层-丘脑下边界处的小叶蛋白阳性纤维束可以从这些前部（B中的箭头）追踪，这些前部向中央（Dc）和外侧（Dl）区发送投影。请注意，在这些前部水平（C+D），小硅片沟（Y）是一个大凹痕，Dc到达由其形成的心室表面。根据我们的结果，其他硬骨鱼类中描述的背侧（Dd）区缺失。

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图5

斑马鱼大脑皮层连续切片中Parvalbumin的分布。(A-E公司)Parvalbumin是第二个标记，可以识别斑马鱼大脑皮层中所有四个真正的组织发生单位。中央（Dc）区由许多细小阳性纤维定义，而外侧（Dl）区也有许多细小阳性细胞，这些细胞位于增殖区的腹侧及其周围。内侧（Dm）和后部（Dp）区域很大，没有小黄素。(一个和B类)在前面，Dc延伸至背侧增殖，因此在增殖基质中包括其同源区（图A和图B中的白色箭头）。在这个水平上，中央（Dc）区垂直夹在内侧（Dm）区和外侧（Dl）区之间，证实了NADPHd-活性染色的结果。注意，在这种情况下，小硅片沟（Y）在内侧（Dm）区和中央（Dc）区之间没有出现间隙（图D）。(B-D公司)在随后的更多后部切片中，标记强烈的外侧（Dl）区逐渐覆盖中央（Dc）区。(E类)侧（Dl）区完全覆盖端脑中层的中央（Dc）区。粗大的黑色箭头表示在假设的向外折叠过程中内侧（Dm）和外侧（Dl）区域的突出物（比较图7A).

中央（Dc）区和外侧（Dl）区的大部分细小阳性纤维可能来自两个主要来源：前部和后部。前部，小叶蛋白阳性纤维在大脑皮层-丘脑下边界形成纤维束（黑色箭头，图4C+D)可以追溯到端脑的头极；这些纤维束来自丘脑下部的背核（Vd）和腹核（Vv）。这里许多细小白蛋白阳性细胞显示出投射神经元的形态（黑色箭头，图4C+D). 在后部水平，Dc和Dl似乎通过部分标记的前脑外侧束接收到少量阳性投射。这些投射可能来自肾小球前复合体的细胞核，已知其投射到金鱼的外侧（Dl）区和中央（Dc）区(诺思卡特，2006年).

Parvalbumin免疫反应证实组织发生单位Dc

为了证实中央（Dc）区是一个真正的组织遗传学单位，我们检测了钯最前端的细小白蛋白反应性分布。事实上，中心（Dc）区在心室周围增殖部位达到了自己的萌芽区（白色箭头图5A)夹在内侧（Dm）和外侧（Dl）区域之间。外侧（Dl）区由位于背侧增殖区腹面的强标记小白蛋白阳性细胞所界定，似乎向中间突出。在随后的章节中，它越来越多地涵盖了中部（Dc）地区(图5B-D). 注意，神经上皮前面覆盖中央（Dc）区（白色图5A)，在更靠后的部分水平夹在Dc和Dl之间（中的箭头图5B-D). 在大脑皮层中层，中央（Dc）区和外侧（Dl）区之间的神经上皮片不再可见(图4D,​，5E）。第五版). 图中，以许多微小阳性细胞为标志的外侧（Dl）区完全覆盖了Dc，并附着在内侧（Dm）区。同样，开放的小硅质沟仅在更前面的部分可见（Y在图4CD). 再次，在这些染色中没有发现背部（Dd）区，证实斑马鱼中没有这一区域。

总之，我们的结果表明斑马鱼大脑皮层和哺乳动物大脑皮层一样，具有四个真正的组织发生分裂。斑马鱼的这四个区域是内侧（Dm）、外侧（Dl）、后部（Dp）和中央（Dc）区域。中央（Dc）区是一个独特的发育实体（即组织发生单位），它在背侧增殖基质中拥有自己的起源域。我们假设Dc在发育过程中腹侧移位，其最初的背侧位置转移到大脑皮层中心。这种内陷过程的主要力量可能是由于侧向（Dl）区的向内突出。与早期报告相比，斑马鱼没有背部（Dd）区(Wullimann等人，1996年). Dl的过度生长部分被误解为与Dd相对应的区域。

NADPHd-活性组织化学

根据Giraldez-Perez及其同事的研究，我们对成年斑马鱼大脑中的NADPHd活性进行了组织化学检测(Giraldez-Perez等人，2008年). 我们在37℃的0.1 M Tris缓冲液（pH 8.0）、0.05%Triton-X-100（Sigma-Aldrich）、1 mM beta-NADPH（Sigma-Aldrich。然后，我们用脑切片在磷酸盐缓冲液（PB）中冲洗玻片三次，并在4%PFA中固定1小时。随后，我们用一系列分级的乙醇将其脱水，并用Entellan（Merck）将其覆盖。

小白蛋白免疫染色

我们将抗小白蛋白的单克隆小鼠抗体（MAB15721:2000，Millipore）应用于冰冻切片脑切片（厚度18-35μm）。如其他地方所述，我们使用了与辣根过氧化物酶（Elite ABC试剂盒，Vectastain PK-6102）和二氨基联苯胺（DAB）偶联的二抗（兔IgG）作为发色剂(Mueller等人，2004年). 载玻片与脑切片的DAB培养涉及重金属强化（50 mg DAB加上3 ml 1%硫酸镍加上3 ml1%氯化钴于200 ml PBS中）。预培养20分钟后，我们添加了600μm的0.3%H₂哦₂.DAB被允许对H作出反应₂哦₂持续20分钟。随后，我们在PB中冲洗载玻片三次，在一系列分级的乙醇中脱水，并用Entellan（默克公司）盖玻片。

我们感谢Steffi Dippold和Mimi Zeiger的编辑工作，感谢Glenn Northcutt对手稿的评论。这项工作得到了NIH AA016021、NS042626、UCSF拜尔斯奖和桑德勒家庭基金会的支持。