Exportin-5介导前微小RNA和短发夹RNA的核输出

摘要

MicroRNAs（miRNAs）是在许多真核生物中观察到的～22-核苷酸（nt）非编码RNA。在几个不同的物种中已经鉴定出200多个基因组编码的miRNAs(安布罗斯2003). 尽管迄今为止很少有动物miRNAs被赋予功能秀丽隐杆线虫let-7和lin-4 miRNA以及miR-14和bantam miRNA发现于果蝇属均抑制含有部分互补靶点的mRNA的表达(安布罗斯2003). 在秀丽线虫let-7和lin-4的表达受发育调控，let-7或lin-4功能的丧失由于其mRNA靶点的不当表达导致幼虫正常发育的中断(Lee等人，1993年;Reinhart等人，2000年). 与miRNA在脊椎动物发育中的类似作用一致，许多小鼠miRNA也以发育调节或组织特异性的方式表达(Lagos-Quintana等人，2002年;Houbavey等人，2003年).

miRNA最初表达为长度为～80 nt的不完美RNA发夹的一部分，而发夹又是称为初级miRNA（pri-miRNA；Lee等人，2002年). miRNA生物发生的第一步是对该RNA发夹的上部进行核切除，产生~65nt的前miRNA中间体(Lee等人，2002年;曾和卡伦2003). 该处理步骤由人类RNA酶III（也称为“Drosha”）执行(Lee等人，2003年). 在人类miR-30的情况下，前miRNA中间产物由一个63-nt发夹组成，发夹上有一个2-nt-3′外伸部分，然后通过一种目前未知的机制输出到细胞质。一旦到达目的地，前miRNA由第二个RNAse III家族成员“Dicer”处理，得到成熟的～22-nt miRNA(Grishok等人，2001年;Hutvágner等人，2001年;Ketting等人，2001年). 然后将miRNA并入RNA诱导沉默复合物（RISC）中，在RISC中，miRNA起到引导RISC找到合适的mRNA靶点的作用(Hammond等人，2000年;Martinez等人，2002年;Mouralatos等人，2002年;Schwarz等人，2002年).

除了miRNAs，细胞还可以通过Dicer处理长双链RNA（dsRNAs；Zamore等人，2000年;Bernstein等人，2001年). siRNA，也可以通过转染合成的siRNA双工体引入细胞(Elbashir等人，2001年)，可以对RISC进行编程，以切割具有完美互补靶点的mRNA。这个过程称为RNA干扰（RNAi；Fire等人，1998年)已成为无脊椎动物和脊椎动物细胞中基因功能分析的强大技术。然而，由于人工siRNA双工体诱导的RNAi只对靶基因产生短暂的抑制作用，因此已经努力寻找能够合成siRNA的载体。最流行的稳定siRNA表达技术包括使用RNA聚合酶III（pol III）依赖的启动子转录短发夹RNA（shRNA）(Brummelkamp等人，2002年;Paddison等人，2002年). 所描述的shRNAs通常具有完美的19-29碱基对（bp）茎，具有小的末端环和2-nt 3′外伸，由pol III转录终止引起的两个“U”残基组成。因此，shRNA的结构与miR-30前miRNA的结构非常相似，miR-30前miRNA也形成了带有2-nt3′悬垂的RNA发夹。

核质转运因子核黄素家族的几个成员已被证明在非编码RNA的核输出中发挥作用，包括tRNAs、snRNAs和rRNAs(雷和银2002). 在核输出中起作用的核蛋白的一个决定性特征是，核货物结合需要Ran GTPase的GTP结合形式，而Ran-GTP到Ran-GDP的细胞质水解诱导货物释放。核蛋白Exportin-5（Exp5；Brownawell和Macara 2002)调节腺病毒VA1（一种高度结构的160-nt非编码RNA）的核输出，也可以作为tRNA核输出的次级受体(Gwizdek等人，2003年;Bohnsack等人，2002年;Calado等人，2002年). 在VA1的情况下，Exp5结合需要>14bp的末端dsRNA“小螺旋”，带有碱基配对的5′端和≥3 nt的3′延伸(Gwizdek等人，2003年). 由于这些结构决定因素与前miRNAs和shRNAs都是相同的，我们询问这些小的非编码RNA的核输出是否也需要Exp5。在这里，我们证明Exp5确实是前miRNAs和shRNAs的核输出和生物活性所必需的，但不是合成siRNA功能所必需的。此外，我们发现Exp5在体外特异性结合miR-30前miRNA前体，但仅在Ran-GTP存在下。这些结果确定了Exp5的主要细胞输出货物，并定义了miRNA生物发生和功能的新辅助因子。

结果和讨论

为了测试Exp5是否真的参与了前miRNA的核输出，我们首先确定了一种能够有效抑制人类细胞中Exp5表达的合成siRNA。靶向人类339-360残基的siRNA双链实验5开放阅读框（ORF）转染293T细胞，转染时间分别为0、36h和60h。36小时后再分析Exp5基因表达。如所示图1，这种治疗显著且特异性地降低了Exp5 mRNA和蛋白质的内源性表达水平。

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图1。

通过RNA干扰抑制内源性人类Exp5 mRNA和蛋白质表达。(A类)在0、36和60小时用siExp5 RNA双链转染293T细胞，以siTat双链作为阴性对照，或模拟转染。96小时时，通过Northern分析测定Exp5 mRNA的表达水平。核糖体RNA作为负荷控制。(B类)与面板类似A类除293T细胞与表达HA标记的Ran蛋白的pBC12/MS-HA-Ran共转染外，其余细胞均在60 h时转染。96 h时，使用兔多克隆抗Exp5抗血清或HA特异性小鼠单克隆抗体进行Western分析。

我们之前描述了一种基于萤火虫荧光素酶（luc）的指示质粒，称为pCMV-luc-miR-30（P），该质粒包含插入3′非翻译区的人类miR-30 miRNA的8个靶位点(图2A;Zeng等人，2003年). 因此，miR-30的表达可以有效降低该质粒中luc的表达。我们之前还描述了一种质粒，pCMV-miR-30，它以类似于pri-miRNA的长mRNA的形式表达真正的人类miR-30(图2A;Zeng等人，2002年). 与内源性miR-30一样，pCMV-miR-30表达miR-30需要对前miRNA中间产物进行核切除，然后进行核输出和Dicer处理(曾和卡伦2003). 第二个miR-30表达质粒，称为pSuper-miR-30，使用pol-III依赖的H1启动子表达63-nt RNA发夹，该发夹与真正的前miR-30中间产物相同，只是2-nt 3′悬挑已从5′-GC-3′变为5′-UU-3′(图2A). 最后，我们还可以通过直接转染合成的～22-nt RNA双链将miR-30引入细胞，该双链由退火到miR-30反义miRNA的miR-30 miRNA组成(图2A).

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图2。

Exp5表达的缺失特异性地减轻了由前miRNA或shRNA引起的基因表达的抑制。(A类)pCMV-luc-miR-30（P）指示质粒和所用不同miR-30 RNA变体的示意图。(B类)在第三次siExp5或模拟转染的60 h，293T细胞与pCMV-luc-miR-30（P）指示质粒、Renilla荧光素酶内部控制质粒、指示的pBC12/CMV-或pSuper-derived控制或miRNA表达质粒或合成的miR-30。在96小时时测定萤火虫和Renilla荧光素酶的表达水平，并根据Renila内部对照的微小变化进行调整。Pos（阳性对照）是指与pCMV-luc-miR-30（P）、Renilla和pBC12/CMV对照质粒共同转染的模拟或siExp5转染培养物。数据显示了在模拟转染阳性对照培养物中检测到的萤火虫荧光素酶活性，该培养物设置为100。显示标准偏差的三个实验的平均值。(C类)这些数据是按照面板中的描述生成的B类除了使用了指示质粒pCMV-luc-miR-21（P）和pCMV-luc-随机。此外，该小组使用用siTat双链体转染的细胞作为siExp5的对照。(D类)这些数据是按照B类，使用pCMV-luc-miR-30（P）指示质粒，和如所示B类.

如果Exp5对前miRNA的输出是必需的，但对miRNA的功能本身不是必需的，那么Exp5的RNAi应减轻由pCMV-miR-30和pSuper-miR-30引起的pCMV-luc-miR-30（P）衍生luc酶表达的抑制，这两者都产生核前miR-30中间产物，但不应解除合成miR-30 RNA双链引起的抑制。如所示图2B，这正是我们所观察到的。具体而言，在没有miR-30的情况下，或当miR-30作为合成RNA双链的一部分引入时，Exp5表达下调对luc表达水平没有增强作用，但它显著提高了与pCMV-luc-miR-30共转染细胞中的luc表达量（P）指示器和pCMV-miR-30或pSuper-miR-30。

pCMV-luc-miR-21（P）指示质粒(Zeng等人，2003年)与pCMV-luc-miR-30（P）相同(图2A)但它包含8个人类miR-21 miRNA的靶位点。而控制指示质粒pCMV-luc-random包含8个大小相似的随机序列插入。如所示图2CmiR-21的过度表达、pCMV-miR-21表达质粒的共转染或细胞与siExp5的转染均未显著影响对照pCMV-luc-随机指示质粒的luc表达。如前所述(Zeng等人，2003年)与pCMV-luc-random相比，pCMV-lucmiR-21（P）指示质粒在转染的293T细胞中的luc活性显著降低，这是由于内源性miR-21的作用。与miR-30不同，miR-21 miRNA在293T细胞中以易于检测的水平表达(Zeng等人，2003年). 通过共转染pCMV-miR-21，miR-21的过度表达导致luc表达的进一步深度抑制。重要的是，在siExp5转染细胞中，无论是否存在过表达miR-21，pCMV-luc-miR-21（P）编码的luc活性水平都显著增加。这些数据表明，外源性和内源性miR-21的抑制作用取决于Exp5核输出因子的生物活性。

最后，我们询问是否需要Exp5来进行shRNA的RNA干扰。事实上，敲低Exp5的表达并没有拯救被合成的luc特异性siRNA抑制的luc表达，但确实增强了当相同的siRNA最初转录为shRNA时被抑制的luc表达(图2D).

鉴于最近的数据表明RNA干扰有时会产生非特异性抑制作用(Bridge等人，2003年)，我们希望确认miRNA或shRNA功能的抑制图2是具体的。因此，我们构建了编码流感血凝素（HA）标记形式的野生型人类Exp5或Exp5突变体（Exp5M）的表达质粒，该突变体在siRNA靶的中心含有3-nt突变(图3A). 据预测，该突变会抑制该siRNA产生的RNAi，但不会改变Exp5氨基酸序列。用Exp5-specific siRNA共同转染293T细胞，在野生型Exp5序列转染的细胞中没有检测到Exp5蛋白表达，但在转染突变的Exp5M基因的细胞中容易检测到Exp5M蛋白表达水平(图3B). 野生型Exp5表达的敲除是特异性的，因为HA标记的对照蛋白的表达不受影响。

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图3。

Exp5的RNAi具有特定的表型。(A类)Exp5 siRNA的序列(降低链）和mRNA靶(上面的链）在野生型Exp5和Exp5M突变体中。(B类)与第三次siRNA转染相一致，这里使用siExp5或siLuc作为对照，细胞与表达野生型或突变型Exp5或Ran的HA标记版本的质粒共同转染。再过36小时，通过Western分析测定HA标记蛋白水平。(C类)该转染实验按照图2B类除了在60小时时293T细胞也与表达野生型Exp5或Exp5M突变体的质粒共转染。所有培养物均用siExp5 RNA双链处理。Pos（阳性对照）培养物是指转染pCMV-luc-miR-30（P）指示剂、Renilla和pBC12/CMV对照质粒以及siExp5 RNA双链的细胞。给出了与野生型Exp5表达质粒共转染的Pos培养物相关的数据，该表达质粒设置为100。

如果Exp5-specific siRNA确实通过敲低Exp5的表达来阻断前miRNAs和shRNAs的生物活性，那么用表达Exp5M突变体的载体共同转染细胞可以挽救这种活性。事实上，Exp5M的表达确实恢复了pCMV-miR-30、pSuper-miR-30和pSuper-luc诱导的luc表达抑制(图3C). 相反，pCMV-Exp5M并没有降低在没有任何过度表达的前miRNA或shRNA的情况下所观察到的luc活性水平，也没有进一步降低与合成miR-30或luc-siRNA双重转染的细胞中所看到的luc活动水平。同样，Exportin-t或Crm1的过度表达也没有显著影响（数据未显示），这两种核蛋白参与其他非编码RNA的输出。我们得出结论，Exp5特异性siRNA逆转前miRNA和shRNA表达质粒抑制靶mRNA表达的能力(图2)通过选择性抑制Exp5表达。

如果前miRNA核输出和加工需要Exp5，那么Exp5表达的下调会导致成熟miRNA的表达水平显著下降，也可能导致前miRNA中间产物的表达水平增加。如所示图4根据Northern对细胞总RNA的分析评估，敲除Exp5表达对初始pri-miR-30转录物或前miR-30中间产物的表达水平几乎没有影响，但显著降低了成熟miR-30 miRNA的表达水平(图4，参见车道1和2）。在细胞质RNA分析中观察到更显著的Exp5表型。具体而言，在表达Exp5水平降低的细胞胞质中，前miR-30和成熟miR-30的表达明显减少(图4，参见车道3和4）。无论Exp5的表达水平如何，pCMV-miR-30转染细胞的细胞质中均未检测到pri-miR-30。尽管这些数据与Exp5对前miRNA的核输出和细胞质加工至关重要的假设明显一致，但有趣的是，没有检测到前miRNA中间产物的积累。我们注意到，与VA1非编码RNA结合的Exp5对末端RNA螺旋底部的微小变化高度敏感，例如被5′突起破坏(Gwizdek等人，2003年; 数据未显示）。因此，我们假设Exp5可能与VA1和前miRNAs中发现的RNA小螺旋的碱基结合，从而不仅激活其核输出，还保护这些短的非编码RNA免受外核裂解。因此，Exp5表达缺失不仅可能导致前miRNAs的核保留，也可能导致其核降解。

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图4。

miR-30 RNA表达分析。293T细胞转染siExp5或模拟转染。在第三次siExp5或模拟转染的第60小时，细胞也被pCMV-miR-30共转染；36小时后，分离总RNA和细胞质RNA组分并进行Northern分析。显示了pri-miR-30、pre-miR-30-和成熟miR-30 RNA的位置。5S rRNA作为负荷控制。

Exp5是核质因子的核球蛋白家族的成员。核蛋白在核出口中起作用的一个决定性特征是，货物绑定需要GTP绑定形式的Ran GTPase(雷和银2002). 为了测试Exp5是否真的能够以Ran-GTP依赖的方式结合63-nt前miR-30 RNA，我们使用T7 RNA聚合酶转录一个放射性标记的63-nt RNA探针，该探针与前miR-30RNA相同，只是第一个核苷酸从U变为G以适应该聚合酶的要求。为了保持前miR-30 RNA干的完整性，这也需要将前miRNA干3′端的残基61从a改变为C。该RNA探针与纯化的重组His-tagged人Exp5和/或重组Ran-GTP孵育。通过凝胶位移分析确定，前miR-30探针没有单独与Exp5或Ran-GTP结合，但在与这两种蛋白质同时孵育时形成了易于检测的复合物(图5).

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图5。

Exp5在Ran-GTP存在下对前miR-30进行特异性结合。A类³²P标记的前miR-30 RNA探针与重组Exp5-His和/或重组Ran-GTP在存在或不存在各种未标记竞争RNA的指示倍过剩的情况下孵育。蛋白质：RNA复合物通过非变性凝胶电泳和放射自显影进行检测。

为了证明这种RNA-蛋白质复合物的形成是特异性的，我们接下来询问，如果过量添加，未标记的RNA竞争对手是否会阻断复合物的形成。如所示图5，当使用的未标记竞争物是前miR-30 RNA本身或VARdm时，前miR-30/Exp5/Ran-GTP复合物的形成确实受到抑制，VARdm是腺病毒VA1 RNA的衍生物，先前显示与Exp5具有高亲和力(Gwizdek等人，2003年). 相比之下，一种不相关的RNA竞争物，即结构适度的104-nt U6 snRNA，未能影响复合物的形成。因此，我们得出结论，Exp5以Ran-GTP依赖的方式特异性结合前miR-30 miRNA前体。

在本文中，我们证明了人类miR-30前miRNA的核输出及其生物活性依赖于Exp5核输出因子。miR-30前miRNA是目前已知结构的唯一前miRNA，它由一个不完美的63-nt RNA发夹组成，发夹带有Drosha核加工产生的2-nt3′延伸(Lee等人，2003年). 正如其他前miRNA也需要Drosha从同源的pri-miRNA中进行核切除一样(Lee等人，2003年)，似乎其他前miRNAs也可能由带有2-nt 3′末端的小RNA发夹组成，因此也能够特异性结合Exp5。发现内源性和过度表达的人miR-21的抑制活性也依赖于Exp5(图2C)与这个假设是一致的。

虽然最近才有证据证明前miR-30的结构，但我们注意到，人工小分子RNA最流行的设计也包括一个带有2 nt悬垂的RNA发夹(Brummelkamp等人，2002年;Paddison等人，2002年). 我们的数据表明，这种与前miRNAs的结构相似性允许人工shRNAs也招募Exp5进行核输出(图2D). 用腺病毒VA1 RNA获得的证据表明，Exp5结合需要一个碱基对5′末端和短3′外伸的14-bp以上的RNA茎(Gwizdek等人，2003年). 因此，前miR-30和luc-shRNA似乎都是Exp5结合的良好底物。然而，我们注意到Kawasaki和Taira（2003）报告称，与miRNAs衍生的shRNAs携带末端环路相比，携带人工末端环路的shRNA从细胞核中输出的效率较低，因此可能存在优化shRNA设计以增强Exp5招募的空间。我们还注意到，有两组科学家报告了果蝇和海胆发育过程中不同阶段前let-7 miRNA前体的积累(Pasquinelli等人，2000年;Hutvágner等人，2001年). 虽然这可能代表RNA加工本身的缺陷，但也有可能是前体-7 miRNA前体的核输出，从而获得发育调控的细胞质Dicer。

除了定义在miRNA生物发生和功能中起关键作用的细胞因子外，本研究还确定了第一批依赖Exp5进行核输出的细胞来源RNA载体。有证据表明，在某些生物体中，单个miRNAs的表达量可能高达50000拷贝/细胞(Lim等人，2003年)，前miRNA可能代表Exp5的主要细胞输出货物。我们还注意到最近有报道称HASTY、拟南芥Exp5的同源基因，严重干扰了该植物的正常发育(Bollman等人，2003年). 虽然该表型的机制尚未确定，但我们的数据表明，这可能是由于植物miRNA核输出和功能受到全球抑制所致。

材料和方法

致谢

笔记

文章在印刷前在线发布。文章和发布日期为http://www.genesdev.org/cgi/doi/10.1101/gad.1158803。

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