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胃肠病学。作者手稿；PMC 2012年3月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
胃肠病学。2011年3月；140(3): 1052–1062.
2010年12月4日在线发布。 数字对象标识：10.1053/j.gastro.2010.11.053
预防性维修识别码：项目经理3049833
NIHMSID公司：美国国家卫生研究院258177
PMID：21134374

肝X受体信号转导是星状细胞活化和纤维化肝病易感性的决定因素

西蒙·比文,1,2 凯文·沃布列夫斯基,1 王娇红,三，4 辛西娅·洪,1 史蒂文·本辛格,5 隐藏冢本,三，4和彼得·通托诺兹1
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

背景和目标

肝X受体（LXRs）是脂质激活的核受体，在胆固醇转运、脂肪生成和抗炎信号传导中发挥重要作用。肝星状细胞（HSC）在慢性肝损伤期间激活并介导纤维化反应。这些细胞也是脂质的主要储存库，但脂质代谢在星状细胞活化过程中的作用尚不清楚。在这里，我们表明LXR信号是星状细胞激活和纤维化肝病易感性的重要决定因素。

方法

用高度特异的LXR配体处理从小鼠纯化的永生化和原代星状细胞。四氯化碳（CCl4)以蛋氨酸胆碱缺乏症（MCD）为慢性肝损伤模型。进行相互骨髓移植以测试造血衍生细胞对纤维化反应的重要性。

结果

LXR配体抑制原代小鼠星状细胞的纤维化和星状细胞活化标记物。Lxr公司αβ−/−星状细胞产生水平增加的炎症介质和条件培养基Lxr公司αβ−/−细胞增加野生型细胞的成纤维程序。此外，Lxr公司αβ−/−星状细胞表现出脂质形态的改变和纤维化基因的表达增加，表明它们已被激活。体内,Lxr公司在两种损伤模型中，αβ−/−小鼠对纤维化具有显著敏感性。骨髓移植指出星状细胞功能改变而非造血细胞炎症是骨髓移植的主要基础Lxr公司αβ−/−表型。

结论

这些结果揭示了LXR信号和脂质代谢在肝星状细胞功能调节中的意外作用。

关键词：核受体、LXR、肝星状细胞、肝纤维化

简介

肝纤维化是慢性损伤后细胞外基质（ECM）在肝脏中的可逆积聚。未经检查的纤维化可发展为肝硬化，这是一种具有显著发病率和死亡率的终末期病变。纤维化主要由肝星状细胞介导，即位于Diss内皮下间隙的常驻间充质细胞1,2这些细胞以前被称为肝“脂肪细胞”三因为含有视黄酯（维生素A）、甘油三酯和胆固醇酯的特征性脂滴4,5.星状细胞对肝纤维化的重要性已明确6–8肝损伤后，星状细胞发生主要的细胞转化-“活化”-在此过程中，它们失去脂质含量，增殖并表达成纤维程序1虽然没有已知的静止星状细胞特异性标记物，但胶原蛋白α1（I）和α-平滑肌肌动蛋白的产生是活化星状细胞的特异性标记9长期以来，人们一直认为星状细胞是维生素A（视黄醇和视黄醇酯）的主要储存库，但目前尚不清楚是否需要脂质/类视黄醇的损失来激活，或者仅仅与激活同时发生1,2,4星状细胞活化受炎症信号和与多种造血衍生细胞（包括Kupffer、NKT、B和T细胞）的相互作用的严重影响7,8,10–13。

LXR位于脂质代谢和炎症的支点。这些核受体作为全身胆固醇传感器发挥作用，促进胆固醇逆向转运和胆固醇排入胆汁14。他们是从头开始肝脏中的脂肪生成和Lxr公司αβ−/−小鼠脂肪生成基因表达减少，包括固醇调节元件结合蛋白1c(Srebp-1c型)和硬脂酰辅酶A去饱和酶1(Scd1号机组)15,16LXRs也是巨噬细胞炎症基因表达的负调控因子17作为对炎症刺激的反应，LXR信号抑制几种炎症介质的产生，包括白细胞介素6（IL-6）和单核细胞趋化蛋白（MCP-1）。LXR调节免疫反应的能力也很明显体内.LXR配体可减轻动脉粥样硬化和接触性皮炎小鼠模型的炎症反应，并限制抗原刺激T细胞的增殖18–20。

先前的研究表明肝细胞LXR的表达对胆固醇和胆汁酸毒性的保护作用21但LXRs在星状细胞活化或纤维形成中的作用尚未阐明。在这里，我们研究了LXR在星形细胞脂质代谢和炎症信号传导中的作用，发现Lxr公司在两种肝损伤模型中，αβ−/-小鼠更容易发生慢性纤维化。纯化的星状细胞在纤维生成和炎症程序方面存在内在差异Lxr公司αβ−/−小鼠。令人惊讶的是，通过相互骨髓移植研究确定，造血来源的细胞不会影响这种对纤维化的易感性。我们的数据表明，LXR信号影响肝星状细胞的激活，并参与肝纤维化的发病机制。我们认为，调节这些细胞中的LXR或脂质代谢可能有治疗肝纤维化疾病的潜力。

结果

LXR在活化的星状细胞中具有抗炎和脂质代谢相互作用

为了表征肝星状细胞中核受体的表达，我们对两种永生化、完全激活的星状细胞系：大鼠HSC-T6细胞进行了定量实时PCR22和人类LX-2细胞23这些细胞系被认为是星形细胞在其完全激活的肌纤维母细胞样状态下的模型。补充表1列出了在LX-2细胞中发现的RXR异二聚体的相对丰度，其中LXRβ、维生素D、甲状腺、维甲酸（RARα）和维甲酸X（RXRα）受体占主导地位。LXRα、PPARα和PPARδ弱表达。我们没有观察到PPARγ或FXR的显著表达，也没有观察到选择性激动剂对其特定靶基因的明显诱导(补充图1A)。相比之下，在塑料激活的原代星状细胞中，LXRβ的表达是稳定的，并且不会随着时间的推移而减少(补充图1B)。我们的数据与先前的工作一致，表明PPARγ表达随着激活而减少24,25但与FXR可能在星状细胞活化中起作用的研究不同26。

LXR在LX-2细胞中起作用，诱导典型靶基因的表达(ABCA1、SREBP-1c)合成（GW3965）和内源性（22R-羟基胆固醇）配体呈剂量反应性(图1A)。虽然配体对胶原α1（I）的表达没有影响(COL1AI公司)或α-平滑肌肌动蛋白(ACTA2公司) (图1B)在永生化细胞中，它们对LPS诱导的TNFα、MCP-1和IL-6的表达具有显著抑制作用(图1C)。在大鼠HSC-T6细胞系中也获得了类似的结果（数据未显示）。不幸的是，没有可靠的抗体可用于检测小鼠LXRα或LXRβ。然而，这些数据证明LXR在活化的星状细胞系中丰富且有功能。虽然LXR激动剂似乎并未影响永生化细胞中典型的纤维化相关基因，但我们认为永生化细胞系可能无法充分模拟星状细胞激活过程中脂质信号的重要性。原代星状细胞具有LXR的稳健表达(补充图1B)，因此我们专注于从小鼠或体内所有后续实验的响应。

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LXRs在永生化星状细胞中的相互成脂/抗炎作用

qPCR在人LX-2星状细胞中的基因表达。（A–B）LX-2细胞培养至接近汇合处，并用越来越多的配体处理12–18小时：GW3965（0→ 1µM），22R-羟基胆固醇（0→ 5µM）。（C）用1µM GW3965或载体（DMSO）预处理LX-2星状细胞12小时，然后暴露于LPS（0→ 5纳克/毫升）。

LXR阴性小鼠的原代星状细胞表现出脂质分布改变和活化标记物增加

为了测试LXR信号在原代培养模型中的作用，我们通过就地用蛋白酶和胶原酶顺序消化6,27,28当非实质部分在LXR配体存在的情况下简单地在塑料上培养时，胶原α1（I）和α-平滑肌肌动蛋白在WT细胞中的表达受到抑制，而这些转录物在Lxr公司αβ−/−细胞(图2A)。ABCA1的基础表达增加是巨噬细胞LXR缺失的预期结果，可能是由于制剂中存在巨噬细胞29,30在整个治疗过程中，配体处理的细胞看起来很健康，没有任何毒性迹象。WT中的LXR配体也抑制了非实质部分的增殖，但没有Lxr公司αβ−/−，星状细胞(补充图2)。这些发现很可能反映了星状细胞中LXR的直接作用，但仍有可能是污染Kupffer细胞产生的继发性抗炎作用所致。

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LXR激动剂抑制肌纤维母细胞基因表达并促进星状细胞中性脂质积聚

（A）WT和WT肝非实质部分的基因表达Lxr公司用1µM GW3965或载体（DMSO）治疗αβ−/−小鼠7天。（B）在相位对比图中，显示了从WT小鼠中分离的高纯度初级星状细胞，其上覆盖着每个细胞中维甲酸含量200×的自体荧光（蓝色DAPI激发）。（C）用FITC-偶联的α-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体（绿色）对WT星状细胞（培养激活的第5天）进行50×和100×染色。（D）用BODIPY（绿色）对WT初级星状细胞进行中性脂质染色（第5天），用1µM GW3965或DMSO孵育36小时，400×。细胞核用DAPI染色(C&D公司).

因此，我们通过不连续密度梯度超速离心进一步纯化小鼠星状细胞。这种方法根据非实质细胞的相对浮力来分离非实质细胞，这一特性主要取决于星状细胞中脂质/维甲酸滴的存在6,27这些组分的纯度通过形态学、其他细胞类型的缺失、基因表达和DAPI激发后迅速消失的星状细胞的特征性自体荧光来评估(图2B)。在早期培养激活期间，LXR配体抑制WT星状细胞中的α-平滑肌肌动蛋白(图2C)。同时，它们促进BODIPY染色检测到的中性脂质的积累(图2D)与我们在永生化细胞中观察到的成脂基因表达增加相关(图1A).

LXR缺乏的星状细胞表现出增加的纤维化和炎症能力

令人惊讶的是，我们发现来自Lxr公司αβ−/−小鼠主要含有一个大的脂滴，与WT星状细胞有显著差异(图3A)。此外，Lxr公司在超速离心过程中，αβ−/−星状细胞的迁移率略低，表明质量增加。纯化Lxr公司αβ−/−星状细胞比WT细胞表达更多的胶原α1（I），并增加了其他几个激活相关基因的表达：Pdgfβ，学报2、和Mcp1基因(图3B)。初级WT星状细胞中LXR激动剂抑制肌纤维母细胞基因(Col1aI和Acta2)而靶点与胆固醇转运有关(Abca1、Abcg1)和从头开始脂肪生成(Srebp1c，Scd1)被诱导(图3C和补充图3,4)。LXR刺激负调节Mcp1基因和伊尔6原代星状细胞的表达(补充图3,4)而LXRs的缺失会增加炎症基因的表达(图3B)。正如预期的那样，配体调控在Lxr公司αβ−/−细胞（数据未显示）。这些结果表明，LXR信号在原代星状细胞中建立成纤维程序方面具有直接作用，与成纤维细胞因子无关，Tgfβ1在敲除细胞中没有增加(图3B和补充图4)。氧甾醇似乎抑制Klf公司6 (补充图4)之前已经证明，该因子的促生长亚型在星状细胞的早期培养激活中上调1总之，这些观察结果表明，LXR是星形细胞激活的生理抑制因子，对通过炎症级联反应的转抑制或脂质通路的调节来维持平静至关重要。

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LXR阴性星状细胞在脂质/视黄醇分布方面有显著改变，纤维化和炎症基因表达增加

（A）来自WT和Lxr公司αβ−/−小鼠。来自野生型小鼠的星状细胞具有特征性的多个小液滴，而Lxr公司αβ−/−细胞通常有一个特别大的液滴，几乎与细胞核大小相同（蓝色DAPI）。维甲酸自身荧光与脂滴完全重叠（未显示）。（B）原发性WT和Lxr公司αβ−/−星状细胞在培养激活早期（第3天）。（C）在整个培养激活过程中，连续使用1µM T0901117（缩写为T1317）或载体（DMSO）处理的初级WT星状细胞中的基因表达。

为了进一步探讨WT和Lxr公司αβ−/−星状细胞在培养激活期间，我们从每个基因型中纯化星状细胞，并进行介质交换分析（如图所示图4A)。我们假设LXR缺陷细胞产生的介质增加可能以旁分泌方式改变邻近细胞的成纤维能力。来自的条件培养基Lxr公司αβ−/−星状细胞增加肌纤维母细胞的表达(Acta2、Col1aI)和炎症基因(Mcp1基因)WT单元中(图4B、4C)。相反，来自WT星状细胞的条件培养基抑制了这些基因在Lxr公司αβ−/−细胞。总之，这些数据表明Lxr公司αβ−/−细胞至少部分来自分泌性炎症介质的诱导。

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来自LXR阴性星状细胞的条件培养基增加WT细胞的纤维化和炎症程序

将每个基因型的纯化原代星状细胞平行分离（参见方法），并将其放置在塑料上进行自发培养激活。（A）实验设计。（B、C）第5天培养活化细胞的qPCR基因表达显示成肌纤维细胞（B）和炎症（C）基因。

LXR阴性小鼠易受急性和慢性肝损伤

LXR信号调节星状细胞活化的观察结果表明，LXR表达缺失可能使小鼠易受肝损伤和纤维化的影响。为了测试这种可能性，我们通过腹腔注射四氯化碳（CCl）诱导肝脏损伤4)。CCl公司4是一种特性良好的肝毒素，在肝细胞中代谢为不稳定的三氯甲基自由基。其下游作用包括脂质过氧化、细胞内蛋白质损伤和钙稳态的改变，这些改变导致肝细胞坏死和星状细胞和库普弗细胞的活化31最初的坏死炎症活性之后是由星状细胞介导的纤维化反应。我们在单剂量CCl治疗72小时后通过α-平滑肌肌动蛋白染色评估急性损伤和星状细胞激活4。与WT相比，Lxr公司αβ−/−肝脏显示出密集的α-平滑肌肌动蛋白表达量增加，即使在单一损伤刺激后，也更容易形成桥隔(图5A).

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LXR阴性小鼠易受CCl肝损伤4

（A）单剂量CCl 72小时后α-平滑肌肌动蛋白表达（深棕色）4每个基因型N=10，100×。（B）WT和Lxr公司αβ−/−小鼠每两周接受一次腹腔CCl攻击，持续一个月4或车辆（cf方法）。慢性CCl后实质内纤维化间隔（蓝色Masson三色）的肝脏切片4显示损伤，100×。（C）CCl的ALT水平4-治疗小鼠。（D）CCl胶原α1（I）基因的qPCR表达4-治疗小鼠。(电子)通过全肝切片数字扫描量化肝纤维化（参考方法）。N=每组6-8只小鼠，重复2次。

为了评估LXR表达对慢性肝损伤的影响，我们每两周进行一次CCl腹腔注射4一个月。采集血清和肝脏，分析血清转氨酶、基因表达，并用Masson三色染色法检测纤维化间隔。WT和Lxr公司αβ−/−肝脏受到溶媒注射的影响(图5B)。CCl治疗的WT小鼠4出现了预期的轻度桥接性肝纤维化。相对而言，CCl4-处理过的Lxr公司通过测量肝酶释放、胶原α1（I）基因表达和纤维化组织的数字评估，αβ−/−小鼠的肝脏显示出更大的损伤(图5C-E)。有趣的是，我们还发现Lxr公司与WT对照组相比，αβ−/−肝脏显示的基底纤维组织数量几乎是WT对照的两倍(补充图5)。在表达塞浦路斯2e1，代谢CCl4，基因型之间(补充图6A).

我们还测试了LXR缺乏小鼠在第二种肝损伤模型甲硫氨酸胆碱缺乏症中的反应，并发现在缺乏LXR的情况下纤维化加剧(图6A)。我们发现两种基因型中丙氨酸氨基转移酶（ALT）的升高相似，但胶原α1（I）转录物的表达显著增加，只有在Lxr公司αβ−/−小鼠(图6B-D)。这些结果表明，LXRs基因的缺失使小鼠易患由不同机制触发的纤维化肝病。

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LXR阴性小鼠在MCD饮食中发生更多纤维化

（A）WT和WT肝切片的Masson三色染色Lxr公司αβ−/−小鼠在MCD或对照饮食一个月后，100×。（B）喂食MCD饮食的小鼠的ALT水平。（C）通过qPCR检测喂食MCD饮食的小鼠的胶原蛋白α1（I）基因表达。（D）MCD饮食后定量肝纤维化（对照方法）。N=每组6–10人。

造血室不能赋予LXR阴性小鼠对CCl的敏感性4损伤

造血室是肝纤维化重要免疫细胞的来源，包括巨噬细胞（库普弗细胞）、NKT细胞以及B和T淋巴细胞1,2,10–13因此，LXR抑制骨髓源性细胞（如Kupffer细胞）炎症信号的能力可能解释了LXR阴性小鼠对纤维化的敏感性增强。大多数权威人士认为，肝星状细胞是肝损伤期间激活的肌成纤维细胞的主要前体，这些细胞主要来源于肝脏本身，而不是骨髓1,2虽然尚未制定星状细胞选择性基因失活的策略，但消除骨髓表达是解决骨髓源细胞和星状细胞对LXR阴性小鼠纤维化表型相对贡献的另一种策略。我们在WT和Lxr公司αβ−/−受体，然后对其进行慢性CCl治疗4肝损伤。与我们对全球缺乏LXR的小鼠的研究结果相反Lxr公司αβ−/−骨髓未加重WT受者的肝纤维化(图7A、C)。相反，将WT骨髓移植到Lxr公司αβ−/-受体不能减轻纤维化(图7B、D)。重要的是，骨髓基因型并不影响肝细胞损伤程度（ALT水平）或周期2e1，代谢CCl4(补充图6B，C)。与纤维化相关的是，野生型和LXR缺陷型供体的胶原α1（I）表达水平也没有显著差异(图7C、D)。这些数据强烈表明，星形细胞功能的改变，而不是造血细胞炎症的增加，是肿瘤表型的主要基础Lxr公司αβ−/−小鼠。

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WT和LXR阴性小鼠之间的骨髓移植

致命辐照WT或Lxr公司用WT或KO供体的骨髓重建αβ−/−（KO）受体小鼠（对照方法）。移植后8周，用CCl腹腔注射攻击小鼠4和以前一样注射。（A）载体和CCl肝切片的Masson三色染色4-治疗嵌合动物。每组N=8-10，放大100倍。（B）如中所示（A），除了所有受体小鼠Lxr公司αβ−/−，每组N=4–7，放大100倍。（C） 第1列α我慢性CCl后WT受者qPCR基因表达和定量纤维化4管理。（D） 第1列α我qPCR基因表达和定量纤维化Lxr公司慢性CCl后αβ−/-受体4管理。

讨论

LXR是胆固醇稳态和肝脏脂肪生成的关键调节器16，但它们也能反抑制巨噬细胞中的炎症基因17并在适应性免疫反应期间介导T细胞的抗增殖作用20我们在这里已经表明，LXR是星状细胞中表达最高的核受体之一，并且LXR信号调节原代细胞中与代谢、炎症和纤维化相关的基因的表达。与LXR影响星状细胞功能的能力一致，Lxr公司在两种不同的肝损伤模型中，αβ−/-小鼠容易发生纤维化。我们认为这种表型可能是由于星状细胞或肝巨噬细胞（Kupffer细胞）的改变所致，因为LXR的抗动脉粥样硬化作用是由血管巨噬细胞介导的32然而，双向骨髓移植到WT和Lxr公司αβ−/-受体没有改变肝纤维化的易感性，这与非造血细胞类型（如星状细胞）的参与一致。星状细胞和免疫细胞对肝纤维化的相对重要性备受争议1,2，但我们的结果明确支持了这样的论点，即负责纤维化的主要细胞仅来自肝脏。

与肝细胞和巨噬细胞（LXRα在其中发挥主要作用）相反，星状细胞仅表达恒定、高水平的LXRβ。归因于体内因此，LXRα的缺失可归因于其他细胞类型的影响，如肝细胞和枯否细胞。LXR信号通路意外抑制炎症基因表达和原代小鼠星状细胞的成纤维能力。相反，Lxr公司当在塑料上培养时，αβ−/−星状细胞显示几种激活标记的表达增加。LXR缺乏的星状细胞产生增加的可溶性炎症介质，以旁分泌方式促进邻近细胞的纤维化能力。我们尚未确定哪些因素（如MCP1、IL-6或其他）可能与这些旁分泌效应有关(图4)。在确定哪些因素是关键因素时，单个细胞因子的抗体中和及其受体的敲除应该是有益的。

有趣的是，并非所有激活相关基因在Lxr公司αβ−/−细胞。例如，我们没有检测到TGFβ1的增加，这是一种与星状细胞激活的启动和持续相关的促成纤维细胞因子1,2尽管我们没有发现转化生长因子βmRNA的表达发生变化，但在未来的实验中，确定是否Lxr公司αβ−/−星状细胞在TGFβ蛋白的产生或TGFβ信号通路成分的活性方面发生变化。值得注意的是，永生化星状细胞系是研究LXR信号传导的较差模型系统，因为尽管对代谢基因表达的影响得以保留，但这些细胞对LXR的抗纤维化作用并不敏感。一旦建立，活化的星状细胞就有一个纤维化的自主程序，这可能解释了为什么永生化细胞系不能完全忠实地模拟活化程序。我们的工作强调了使用纯化的原代星状细胞和体内尽可能建立模型。需要进一步的工作来确定LXR信号的哪些方面对星状细胞激活至关重要，以及这些方面如何与TGFβ信号相互作用。

另一个有趣的观察结果是，LXR阴性星状细胞在维甲酸/脂质分布及其活化倾向方面存在显著差异。Lxr公司αβ−/−星状细胞主要含有一个大的脂滴，而野生型细胞则含有多个较小的脂滴(图3A)。液滴大小与星状细胞激活状态之间没有明确的关系，尽管之前已经确定了脂滴的亚群4维甲酸在星状细胞中的功能作用仍存在争议，有几份报告称维甲酸会加剧纤维化，其他报告则称其具有抑制作用33–35.重要的是要确定Lxr公司αβ−/−星状细胞和视黄醇代谢是否也有改变。

很少有影响星状细胞活化的转录途径被详细描述。同源异型盒基因缺失，长x2据报道，在小鼠体内产生自发纤维化和星状细胞活化36。类似于Lxr公司αβ−/−动物，长x2−/−小鼠肝星状细胞中胶原α1（I）和α-平滑肌肌动蛋白的基础表达增加。但这种发育缺陷也与肝脏的结构畸变有关，这一特征在Lxr公司αβ−/−小鼠。我们和其他人21，未观察到WT和Lxr公司αβ−/−肝脏，我们也没有观察到肝细胞损伤、死亡或更替的组织学证据增加。鉴于肝细胞损伤/死亡是公认的肝纤维化刺激因素，这一点很重要1LXR信号在肝再生和肝细胞更替中的影响有待进一步研究。是否长x2−/−小鼠肝细胞损伤/死亡的基础差异增加，未见报道36然而，值得注意的是，肝纤维化的基础水平在Lxr公司αβ−/−小鼠(补充图5)，与我们的假设一致Lxr公司αβ−/−星状细胞处于激活状态。这是否存在于产前状态尚待确定。

我们的数据与以下假设相一致：星形细胞内炎症基因表达的增加导致纤维生成潜能的增加Lxr公司αβ−/−细胞。我们可以预测，炎症基因的LXR依赖性转表达缺失是其主要机制。通过使用LXR突变体将反式表达与反式激活功能分开37，应该可以直接测试炎症基因抑制对星状细胞激活的重要性。星状细胞内的脂质感应（甾醇、甘油三酯和/或维甲酸）也可能与活化和增殖有机械联系，但需要进一步研究来阐明这一点。LXR配体对星状细胞的抗增殖作用(补充图2)可能通过抑制KLF6的促生长剪接亚型介导1(补充图4)，但这种影响可能是间接的，因为我们不怀疑KLF6是一个直接的LXR靶基因。不幸的是，我们目前还不能明确地确定星状细胞中LXR信号对体内对纤维化的易感性，因为目前还没有已知的方法专门删除星状细胞中的基因。LXRβ的肝脏特异性敲除可能有助于分离这一点，因为星状细胞只表达这种LXR同型。

由于LXR激活抑制星状细胞中与激活和纤维化相关的基因，一个明显的问题是用合成的LXR活化剂治疗小鼠是否会对纤维化肝病模型产生有益的影响。不幸的是，初步研究表明，这个问题的答案是“否”。目前可用的pan-LXR激动剂（激活LXRα和LXRβ）的主要副作用是肝毒性。使用LXR激动剂治疗的小鼠由于诱导从头开始脂肪生成15在我们的研究中，尽管LXR激动剂可能对星状细胞有任何有益的影响（数据未显示），但这种损伤与纤维化刺激相结合会导致整体肝脏病理学恶化。LXR活性特异性靶向星状细胞的方法可能体内需要将星状细胞效应与肝细胞中的不良效应分开。

材料和方法

（请参见补充材料和方法更多详细信息）

小鼠和肝损伤模型

男性Lxr公司αβ−/−小鼠（12-24周龄）通过在纯C57/Bl6背景上回交≥10代获得。动物住房是温度控制的，有12小时的光/暗循环，无病原体条件，以及即兴演奏获得水和标准食物。以下特殊饮食（研究饮食）用于图6：控制=A02082003B；MCD=A02082002B。这两种饮食仅在DL-甲硫氨酸（3克）和酒石酸胆碱（2克）的存在或不存在时有所不同。通过腹腔注射10%CCl溶液诱发四氯化碳慢性肝损伤4在无菌橄榄油中（0.5µl纯CCl4/g体重）每周两次，持续四周，最后一次给药72小时后收获。对于单剂量急性损伤，3.5µL纯CCl4/使用g体重。对于骨髓移植，12周龄受体小鼠接受900拉德致命照射，并移植~3×106如前所述，通过尾静脉注射从16至18周龄男性供体长骨中分离出骨髓细胞32。移植后8周，出现上述慢性损伤。所有动物实验均由加州大学洛杉矶分校动物护理与研究咨询委员会批准。

细胞培养与免疫细胞化学

永生星状细胞在添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的杜贝科改良鹰培养基（DMEM）中培养。原代星状细胞在DMEM、低葡萄糖（1 g/L）、1%青霉素、链霉素和两性霉素中培养。用于星状细胞分离和纯化的其他培养基、Eagles Minimal Essential Medium（EMEM）和DMEM/F12来自Biowittaker Lonza。通过在10%福尔马林中固定30分钟，在PBS中洗涤，然后与FITC-结合的α-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体（Sigma F3777，克隆1A4）或匹配的同型对照物（Sigma-F6522）以1:500滴度孵育2小时，对原代星状细胞（培养激活的第4-5天）进行免疫细胞化学。中性脂质的BODIPY染色同样在福尔马林固定的初级星状细胞上进行，用BODIPY试剂（Invitrogen）以1:1000培养1小时。细胞也用DAPI染色以标记细胞核（1:10000）。

初级星状细胞分离

如前所述，分离和纯化小鼠星状细胞27并在补充方法。

实时定量PCR

使用TRIzol（Invitrogen）从细胞或肝组织中提取RNA。使用iScript cDNA合成试剂盒（Biorad）逆转录1微克总RNA。使用Applied Biosystems 7900HT序列检测器进行Sybergreen（Diagenode）实时定量PCR检测。结果被归一化为36B4，并表示为对照+/−SEM上的平均折叠诱导。可根据要求提供特定引物序列。

统计

所有数据均显示为平均+/-SEM。将两组之间的差异与双尾非配对进行比较t吨测试。使用Newman-Keuls或Bonferroni事后测试（加利福尼亚州GraphPad Prism 4.0a），通过单因素或双因素方差分析比较多组之间的差异。*，P<.05；**，P<.01；***，P<0.001；NS，P>.05。

补充材料

01

单击此处查看。（333K，pdf）

致谢

我们感谢David Mangelsdorf对LXR缺失小鼠的研究，Tim Willson对GW3965的研究，Scott Friedman对HSC-T6和LX-2细胞系的研究，以及Sam French，Sr.对α-平滑肌肌动蛋白免疫组织化学的帮助。我们还感谢Clara Magyar对纤维化的数字量化，以及Jon Salazar对小鼠饲养的帮助。P.Tontonoz是霍华德·休斯医学研究所的研究员。这项工作得到了NIH培训拨款T32 DK07180-30和加州大学洛杉矶分校溃疡研究与教育中心（CURE）试点和可行性研究拨款441349-BB-39108（给S.W.Beaven）的支持，并向HL66088、HL30568和DK063491（给P.Tontonoz）拨款。

赠款支持：R24AA12885（非实质性肝细胞核心）和P50AA11999（南加州ALPD和肝硬化研究中心）对细胞分离（H.Tsukamoto）提供了额外支持。

缩写

CCl公司4四氯化碳
发动机控制模块细胞外基质
造血干细胞肝星状细胞
LXR公司肝脏X受体
MCD（MCD）缺乏蛋氨酸胆碱的饮食

脚注

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