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美国国家科学院院刊。2011年2月22日；108(8): 3383–3388.
2011年2月2日在线发布。 数字对象标识：10.1073/pnas.1013063108
PMCID公司：项目经理3044415
PMID：21289279

抑制真核生物起始因子4E和4G之间的相互作用会损害长期联想记忆巩固，但不会损害再巩固

查尔斯·霍费尔,通讯作者a、，b、，1 Kiriana K.Cowansage公司,a、，1 伊丽莎白·C·阿诺德,c（c） 杰西卡·班科,d日 内森·莫尔克,e（电子） 里卡德·罗德里格斯,（f） 恩里科·K·施密特,克 埃德文·克洛西,小时 迈克尔·乔列夫,小时 理查德·劳埃德,我 菲利普·皮埃尔,克 格哈特·瓦格纳,（f） 约瑟夫·勒杜克斯,一和埃里克·克伦a、，2
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

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补充资料

摘要

大量证据表明，蛋白质合成的全面阻断阻止了长期记忆的初始巩固和恢复后的再巩固。这些发现主要来自于对阻断核糖体功能的药物的研究，从而在全球范围内干扰cap依赖型和独立型翻译。这里我们显示，杏仁核内微量注射4EGI-1（一种cap依赖性翻译的小分子抑制剂，可选择性地干扰真核细胞起始因子（eIF）4E和4G之间的相互作用）可减弱恐惧记忆巩固，但不会再巩固。通过结合行为和生物化学技术，我们在体外和体内都提供了证据，证明eIF4E–eIF4G复合物对于由初始学习诱导的可塑性比由现有记忆的重新激活触发的可塑性更为严格。

关键词：内部核糖体进入位点依赖性翻译，eIF4G凋亡裂解片段

人们普遍认为，在相关神经元回路中合成新的蛋白质是长期记忆（LTM）存储的基本要求。翻译对于稳定活动记忆很重要，因为它会触发新蛋白质的产生，这些蛋白质是巩固（学习后）和再巩固（记忆重新激活后）期间持续分子和突触变化所必需的。然而，翻译在记忆形成中的作用仅在整体细胞蛋白翻译的背景下进行了探索。原则上，至少有两种形式的蛋白质合成可以用于记忆巩固或再巩固。翻译起始的主要模式要求真核起始因子（eIFs）的多蛋白复合物与靶mRNA的5′甲基化GTP帽结合形成(1,2). 具体而言，eIF4E和eIF4G之间的相互作用促进eIF4A RNA解旋酶活性、40S核糖体亚基的募集、扫描和肽延伸(三,4). 阻止eIF4F形成的分子（eIF4E+eIF4G+eIF3A），例如内源性调节因子4E-结合蛋白，它结合并隔离eIF4E，因此有效抑制cap依赖性翻译。同样，小分子4EGI-1在体外选择性破坏eIF4E–eIF4G相互作用（eIF4F形成）(5)，还抑制cap依赖的翻译。mRNA可通过内部核糖体进入位点（IRES）进行翻译的第二条途径，IRES不受5′端帽翻译机制中断的影响，例如阻断eIF4E–eIF4G相互作用(5). eIF4E–eIF4G相互作用在海马突触可塑性中的作用已被证明(6–8)，但它们还没有被证明可以形成记忆。分离翻译控制机制的能力与联想学习的研究有关，因为对cap依赖性和IRES介导的翻译在哺乳动物大脑功能中的相对作用知之甚少。例如，有证据表明IRES介导脆性X智力低下蛋白的翻译，这种蛋白在脆性X综合征中不存在，它本身是cap依赖性蛋白合成的重要调节器(9,10). 更好地理解cap和IRES依赖性翻译在不同形式的突触可塑性和记忆过程中的相对贡献，应该可以提高我们瞄准和操纵特定蛋白质表达的能力。

虽然蛋白质合成对两者的巩固有着广泛的贡献(11)和再合并(12)对于LTM，人们已经用茴香霉素和环己酰亚胺（CHX）等一般抑制剂进行了广泛的研究，但对记忆过程这些阶段的具体机械约束知之甚少。因此，我们利用4EGI-1的已知选择性，在巴甫洛夫听觉恐惧关联的巩固或再巩固过程中，破坏体内eIF4F的形成。通过将4EGI-1直接微量注射到外侧杏仁核（LA），这是恐惧关联可塑性的主要部位，我们能够研究cap依赖性翻译和eIF4F形成在恐惧记忆过程中的作用(5,13). 我们的研究结果表明，eIF4F复合物的形成在恐惧记忆巩固和再巩固中具有差异性。

结果和讨论

虽然4EGI-1以前被证明是一种高度特异的cap依赖性翻译抑制剂，但这些实验是在人类细胞培养系中进行的(5)这是一个并不总是反映大脑自然功能的人工系统。因此，我们最初试图确定4EGI-1在大鼠脑组织中的功效。我们发现，4EGI-1使用eFI4G或eIF4E抗体进行免疫沉淀，在先前研究中使用的浓度下有效地阻断了LA中eIF4E-eIF4G的相互作用(图1A类和图S1A类). 阻断eIF4E–eIF4G相互作用的效果是4EGI-1特有的，在CHX或EK-B9（4EG1-1的非活性类似物）中均未观察到(图1B类). 然后，我们选择性地将4EGI-1或载体注入插管大鼠的心室或杏仁核中，发现尽管该化合物阻断eIF4E–eIF4G相互作用的效率与直接处理裂解物相比有所降低(图S1A类)然而，当在体内应用于LA时，它有效地破坏了这些相互作用(图1C类和图S1B类). 此外，4EGI-1治疗与茴香霉素不同，没有激活应激激酶ERK1/2、p38 MAPK或JNK/SAPK，绕过了这些化合物的主要非靶向效应，这些化合物通常会使蛋白质合成抑制剂研究数据的解释复杂化(图S2) (14,15). 最后，我们使用基于嘌呤霉素的分析，采用SUnSET技术，直接证实4EGI-1可以减弱大脑中的蛋白质合成(16) (图1D类和图S1C类).

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4EGI-1阻断LA中eIF4E–eIF4G相互作用和蛋白质合成。(A类)eIF4E–eIF4G相互作用在4EGI-1与LA切片孵育后被抑制[载具（veh），n个=5，4EGI-1（4EGI），n个= 6, **P（P）<0.01，无统计学意义]。(B类)eIF4E–eIF4G交互被4EGI-1阻止，但不被CHX或EK-B9阻止，后者是4EGI-1（车辆、，n个= 5; 瑞士法郎，n个= 3; 4EGI-1中，n个= 5; EK-B9，n个= 4; *P（P）<0.05，方差分析）。(C类)注射4EGI-1[载体，n个= 4; 4EGI-1（20μg）n个= 4; 4EGI-1（40μg），n个= 4; 4EGI-1（80μg），n个= 4; *P（P）<0.05，学生的吨测试]。(D类)LA中的蛋白质合成被4EGI-1阻断。图像显示使用SUnSET方法用嘌呤霉素标记的新合成蛋白质（60分钟）(SI方法). （con，无嘌呤霉素对照，n个= 3; 车辆，n个= 4; 瑞士法郎，n个= 4; 4EGI-1，n个=5，EK-B9，n个= 3; **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001，方差分析）。

在确定了4EGI-1在体内杏仁核中的功效后，我们在标准线索恐惧条件化范式训练后立即将其注入LA，以测试其对联想恐惧记忆形成的影响，其中中性条件刺激（CS，音调）与一个令人厌恶的无条件刺激相结合（美国，footshock）(图2A类). 与以前使用普通蛋白质合成抑制剂的研究一致(12)，4EGI-1对短时记忆保持无影响(图2B类) (13)，但LTM合并严重受损(图2B类). 药物清除和修复后，所有大鼠恢复了正常的记忆功能(图S3C类)确认手术和4EGI-1均未永久损害LA功能。

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4EGI-1损害合并，但不损害再合并。(A类)巩固实验的行为和药物输注示意图。(B类)小分子抑制剂4EGI-1可减弱LTM，但修复后STM和LTM均不减弱。(C类)再巩固实验的行为和药物输注示意图。(D类)小分子抑制剂4EGI-1在记忆恢复后应用时不会损害LTM。载体（○），4EGI-1（●），5 mg/mL，每侧0.25μL。整合、车辆、，n个= 6; 4EGI-1，n个= 12, [吨(16) = −2.441,P（P）=0.027，方差分析]。再合并车辆，n个= 6; 4EGI-1，n个= 6, (P（P）>0.05，方差分析）。

4EGI-1对巩固的影响促使我们询问，如果在重新激活先前存储的记忆后给予这种浓度的化合物，是否会同样阻止再巩固。对大鼠进行条件反射，24小时后通过一次CS表现重新激活记忆。重新激活后，立即将4EGI-1或载体注入LA(图2C类和图S3). 与巩固实验一样，大鼠在再激活后的STM中没有表现出损伤(图S3B类). 有趣的是，第二天测试时，4EGI-1也未能阻止再巩固，这表明巩固需要不同的翻译控制机制，而记忆获得和重新激活后立即在时间窗口中的再巩固则需要不同的转换控制机制(图2D类和图S3).

由于4EGI-1损害巩固而非再巩固，我们假设这两个记忆过程可能在eIF4F形成和活动、整体蛋白质翻译或cap依赖翻译的时间要求方面有所不同。为了测试第一种可能性，我们检查了eIF4F形成在合并或再合并后是否增加。在本实验中，我们使用未插管的大鼠重复了行为程序，并在注射药物15分钟后提取LA(图3A类和图S3). 与我们的行为结果一致，我们发现在恐惧条件反射后，但在记忆重新激活后的同一时间点，LA中eIF4E–eIF4G的交互作用显著增强(图3B类). 重要的是，4EGI-1在恐惧条件反射阻止了学习诱导的eIF4E–eIF4G交互增加后交付给LA(图3C类).

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恐惧条件反射和恐惧记忆重新激活后的eIF4E–eIF4G交互。(A类)用于提取LA组织的训练示意图；naive（n）、context-only（c）、unparied（up）、post-conditioning（pc）和post-reactivation（pr）。在试验条件下15分钟后提取所有组织。(B类)eIF4E–eIF4G交互在调节后增加，但在重新激活后不会增加。(C类)小分子抑制剂4EGI-1阻断由条件反射（pc）、上下文（con）、，n个= 4; 车辆n个= 4; 8微克EGI-1（4EGI-1），n个= 4. (D类)eIF4E–eIF4G交互在重新激活后的稍后时间点不会增加。印迹是两个独立实验的代表；测试时间为再激活后60分钟和120分钟（pr）。所用的对照品是在相应时间点杀死的暴露于环境中的动物。

接下来我们研究了4EGI-1给药是否会阻止恐惧条件反射后的蛋白质合成。我们还发现4EGI-1治疗后LA蛋白合成减少了约30%(图4A类). 因为即使完全阻断eIF4E–eIF4G相互作用也不会阻止所有蛋白质合成，所以这种蛋白质合成减少的水平并不令人惊讶(5,17,18). 然而，我们的结果在以前的研究中很有意思，因为我们发现，在蛋白质合成阻滞水平低于以前使用其他蛋白质合成抑制剂的研究中（推测或测量）的情况下，存在显著的记忆损伤(12,13,19). 此外，这些发现结合最近的一份报告显示，与再固结相比，茴香霉素更有效、更持久地阻止了固结(20)与我们的研究结果一致，即记忆获得后eIF4F形成增加，但没有重新激活(图3B类). 最后，我们测试了再固结可能与eIF4F形成的固结在时间上不同的可能性。为了解决这种可能性，我们使用相同的范式训练大鼠(图2C类)并在记忆恢复后60和120分钟从大鼠身上采集LA。与之前的实验一致(图3B类)，我们发现在这些较晚的时间点eIF4F的形成没有差异(图3D类). 综上所述，这些发现表明，巩固尤其依赖于eIF4E–eIF4G相互作用或cap依赖性蛋白质合成所需。这些数据还表明，内存合并和再合并在eIF4F形成的要求方面有所不同，尽管以前在我们进行实验的时间窗口之外的时间窗口中再合并期间，eIF4E–eIF4G交互作用仍然可能增加。

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4EGI-1阻断蛋白质合成，并在恐惧条件反射和恐惧记忆重新激活后改变杏仁核eIF4G1蛋白水解片段的表达。(A类)小分子抑制剂4EGI-1阻断恐惧条件反射后LA中的蛋白质合成。这些数据对应于药物注射后约100分钟。在160分钟时检测到类似程度的封锁（车辆，n个= 4; 4EGI-1，n个= 3;P（P）<0.05，方差分析）。(B类)不同行为暴露后eIF4G1裂解亚型的差异调节；naive（n）、context-only（c）、unparied（up）、post-conditioning（pc）和post-reactivation（pr）。

eIF4F的形成是一种调节cap依赖性翻译的机制，通过这种机制可以从分子上区分整合和再整合。在恐惧条件反射或记忆重新激活后，这些依赖于蛋白质合成的记忆过程可能在eIF4G的表达和翻译后修饰方面有所不同。真核起始因子4G1是eIF4G的主要亚型，在蛋白质合成调控过程中被广泛修饰(18). eIF4G1的表达随着翻译速率的变化而迅速改变，eIF4G1的蛋白水解裂解为更小的信号肽，称为eIF4G凋亡裂解片段（FAG）(21). 然而，当我们将eIF4G1的主要表达亚型（～220 kDa）在条件作用后的水平与在活化后的表达进行比较时，我们发现该亚型的总水平没有变化(图3和​和4B类).4B类). 然而，我们确实观察到与C末端FAG（C-FAG）相对应的～120 kDa的eIF4G1免疫反应带水平，该FAG是eIF4G1的蛋白水解裂解片段(18,22)，在调节和重新激活后增加(图4B类). eIF4G1蛋白水解片段的特性，以及我们用于先前实验的多克隆eIF4G抗体的特异性，已通过针对eIF4G1 N端（582）和C端（586）的额外抗体得到证实(图S1D类). eIF4G1肽水平的增加不仅仅是因为美国的暴露，因为它们在即时电击控制实验中没有增加(图S1D类). 这些结果表明，eIF4G1在翻译后被修饰，以响应与巩固和再巩固相关的神经元活动。这种C-FAG在记忆中的作用尚不清楚，但有人认为C-FAG参与了RNA解旋酶eIF4A和eIF4E激酶Mnk1的细胞质隔离(18). 最后，这些观察结果特别有趣，因为不同的eIF4G1亚型和FAG被推测为调节特定mRNA库的翻译以响应不同的刺激，并且对IRES介导的翻译控制很重要(21,23).

因为eIF4F的形成对于高效合成含有复杂5′UTR的mRNAs特别关键(24)我们的研究结果表明，与再整合相比，这些类型的mRNAs支持的整合数量更多。也就是说，巩固而非再巩固可能更依赖于eIF4E–eIF4G相互作用和eIF4F RNA解旋酶活性的增加（通过eIF4A），以克服具有复杂5′UTR二级结构的mRNA中的空间干扰。为了验证这一观点，我们检测了MAP2的水平，其mRNA包含一个大而复杂的5′UTR。MAP2水平在条件反射后显著增加，但在记忆重新激活或其他行为控制条件下均未增加(图S4). 这些发现表明，恐惧条件作用（而非记忆再激活）诱导eIF4E–eIF4G相互作用和eIF4F RNA解旋酶活性（通过eIF4A）大幅增加，以克服MAP2 mRNA复杂5′UTR二级结构的立体干扰，从而使其翻译(25).

另一种可能性是，整合和再整合对相同的mRNA库有要求，但对eIF4F活性的要求在时间上有所不同。在这种情况下，在记忆巩固的初始阶段，支持大规模功能和结构可塑性的新蛋白质的翻译可能要到记忆巩固过程中的再激活后很久才能进行。然而，我们的结果和其他研究的结果并不支持这个观点(12,26,27). 我们的发现提出了一种有趣的可能性，即重新整合需要帽非依赖性翻译：即翻译含有IRES序列的mRNA。

虽然很明显，从头合成蛋白质对于持久的突触可塑性和记忆是必要的(11,14,15)我们目前的研究结果表明，在LA中，整合和再整合对cap依赖的翻译具有不同的翻译控制机制。整合而非再整合需要在电路激活后不久的某个时间点进行更高水平的cap-dependent转换。4EGI-1对巩固和再巩固的差异效应以及生化数据支持了这一观点，这些数据表明，eIF4E–eIF4G的相互作用在最初的恐惧条件下增强，但在记忆重新激活后没有增强。这些结果与以前对一般蛋白质合成抑制剂（如茴香霉素和CHX）的研究不同(12,28)，但与最近关于固结和再固结之间生化差异的报道一致(29,30). 4EGI-1对eIF4E–eIF4G相互作用的特异性使我们使用的药物浓度大大低于之前对茴香霉素的研究，这可能导致完全阻断翻译，但也会产生非特异性和细胞毒性作用(14). 需要进一步研究，以确定4EGI-1揭示的合并和再合并之间的差异是否由总翻译水平的差异或eIF4F形成的时间规则的差异所驱动。因此，4EGI-1是一种独特的药理学工具，它将使研究人员能够更特异地研究大脑中翻译控制的机制，并提供一种在突触活动或行为经验之后更选择性地阻止特定mRNA翻译的方法。

方法

动物。

雄性Sprague-Dawley大鼠（250–300 g）（Hilltop Lab Animals Inc.）用于所有行为和药物实验。大鼠被单独安置在温度和湿度控制的透明聚乙烯笼中，并在整个实验过程中保持12小时/12小时的光/暗循环，食物和水可以自由选择。程序按照美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南进行，并经纽约大学动物护理和使用委员会批准。

行为装置。

大鼠在带轭的恐惧调节室（大鼠测试笼；Coulbourn仪器）中进行习惯化、训练和测试，该室配有连接到电击发生器（H13-15型；Coulburn仪器）的金属不锈钢棒地板。每个腔室都是单独封闭和隔音的（H10-24A型；Coulbourn仪器）。使用每个单元内安装的红外数码相机将行为记录在VHS或DVD上。刺激演示使用Graphic State 2软件（Coulbourn Instruments）实现自动化。每节课之间用水清洗所有设备。

外科手术。

双侧植入插管以允许局部药物输注。用氯胺酮（100 mg/kg，i.p.；Ketaject）和木聚嗪（6.0 mg/kg i.p.，Xyla-Ject）的混合物麻醉大鼠，并在立体定向仪（David Kopf Instruments）中稳定。根据需要给予补充剂量以维持深度麻醉状态，并用加热的凝胶垫保持体温。暴露颅骨后，根据与LA相对应的前角坐标，在双侧钻取小孔（前后侧−3.2 mm，内侧5.5 mm，背侧-6.5 mm）。使用手术螺钉和丙烯酸牙胶将不锈钢导向套管（22号；Plastics One Inc.）降低并固定在颅骨上。为了防止堵塞，插入了超出导向套管0.5 mm的假套管。术后恢复后，给大鼠注射氯丁丙诺啡（2.0 mg/kg，静脉注射；丁二烯）作为术后镇痛。手术后，大鼠在恢复实验程序之前至少接受5天的恢复。

4EGI-1的LA内输注。

将eIF4E–eIF4G抑制剂4EGI-1溶解在50%二甲基亚砜和10%β-丙基环糊精的载体溶液中，使最终浓度为5μg/μL（每侧0.25μL中1.25μg）。输液时间超过2.5分钟（0.1μL/min），输液后允许注射器在导管中再停留2.5分钟，以使液体扩散。大鼠在恐惧调节（巩固实验）或再激活（再巩固实验）后立即注射成对药物载体。

合并协议。

将插管大鼠习惯于在白色室内灯照亮的恐惧调节室中10分钟。在对训练环境进行习惯化后，雄性Sprague-Dawley大鼠被三种20-s、5-kHz、80-dB音调（CS）的恐惧调节，每一种都与500-ms、0.8-mA的足震同时终止（美国）。训练结束后立即开始药物输注，3小时后测试STM的保留。第二天，通过单独呈现CS（平均试验间隔，120 s），对大鼠在修改的上下文中进行CS的LTM测试。测试环境的新特点包括一个红色的室内灯、电击装置上方的不透明丙烯酸平台和一种薄荷味剂。为了证实由药物效应引起的行为差异不是插管植入过程中所受损伤或永久性药物毒性的结果，采用相同的训练和测试方案对大鼠进行修复并重新测试LTM保留率。

重组协议。

为了测试4EGI-1对恐惧记忆再巩固的影响，将插管大鼠习惯于训练室10分钟，并用三种20-s，5-kHz，80-dB音调（CS）进行恐惧调节，每种音调与500-ms，0.8-mA的足震（US）同时终止。48小时后，在修改后的测试环境中，通过一次20秒的CS演讲重新激活了恐惧记忆。随后，大鼠立即接受药物或载体的LA内注射。3小时后在测试环境中测试再激活后的STM，如前所述进行修改，并在第二天测试LTM。在LTM测试后，对大鼠进行修复和重新测试。

得分。

行为被手动评分，恐惧记忆被评估，方法是将CS-合法冻结的持续时间除以CS的总长度，再乘以100得出百分比。为了确认CS行为的特异性，在第一次CS之前的20 s内，在测试环境中获得了基线冻结测量值。

排除标准。

大鼠被排除在行为实验之外的原因有两种：(我)大脑一侧或两侧插管错位的组织学证实(ii（ii）)显著感染或损伤的组织学和行为学证据。请参见图S5用于插管。

数据分析。

使用重复测量ANOVA对所有行为实验进行统计分析，使用试验作为受试者内部因素，使用条件（药物或载体）作为受试对象之间的变量。对实验的每个相关阶段（采集、STM、LTM）重复测试。所有生化实验均采用单因素方差分析（SPSS软件）进行分析。如果出现以下情况，则认为差异显著P（P）< 0.05.

含有LA的冠状切片的制备。

使用Leica VT1200振动棒的传统技术，从年龄匹配的大鼠（8-12周龄）制备冠状脑切片（400μm）。将切片保存在32°C的孵育瓶中，孵育瓶中灌注含氧人工脑脊液（ACSF），含mM:125 NaCl，2.5 KCl，1.25 NaH2人事军官4，25氯化钠三, 25d日-葡萄糖，2 CaCl2和1 MgCl2（2毫升/分钟）。切片在32°C的ACSF中恢复60分钟。切片要么用于蛋白质纯化，要么用溶于含有1%二甲基亚砜、0.5%β-丙基环糊精（Sigma）的ACSF中的4EGI-1处理。治疗后，将切片在干冰上速冻，并使用冷冻刀提取LA组织。通过解剖显微镜下的切片检查来确认提取效果。将LA混合（每个处理三到四片），以获得75到150μg的蛋白质用于实验。组织在含有mM:40 hepes（pH7.5）、150 NaCl、10焦磷酸、10甘油磷酸、1 EDTA和0.1%CHAPS、蛋白酶抑制剂II、磷酸酶抑制剂混合物I、II（Sigma）的冰镇裂解缓冲液中均质。

蛋白质合成分析。

为了制备含有LA的冠状片用于药物孵育，如上所述制备冠状脑片。然后以所需浓度对切片进行药物预处理（CHX，4EGI-1，EK-B9）30分钟。有关4EGI-1和EK-B9的详细结构，请参阅参考文献。5.使用SUnSET协议对蛋白质进行标记(16). 在蛋白合成抑制剂培养时间结束时，向培养基中添加嘌呤霉素（10μg/mL在载体中，亚阈值浓度用于总合成阻断），并将切片进一步培养10至60分钟。在此培养时间内，用嘌呤菌素对新合成的蛋白进行最终标记。用三次连续的含氧ACSF洗涤从培养基中去除嘌呤霉素，并将切片在干冰上快速冷冻。从切片中对感兴趣的区域进行显微解剖，制备蛋白裂解物并进行印迹。使用小鼠单克隆抗体12D10（1:5000，来自5 mg/mL储备）在印迹上鉴定Puramycin标记的蛋白质。因为只有一小部分脑蛋白被标记，所以使用ECL-Advance识别来自印迹的信号。

为了从输注药物的大鼠身上制备LA切片，首先使用条件反射范式对动物进行训练(图2A类)然后在规定的时间点（8.0μL中40μg），脑室内注入载体或4EGI-1（5μg/μL）。输液时间超过16分钟（0.5μL/min），输液后允许注射器在引导套管中再停留14分钟，以使液体扩散。30分钟后准备冠状脑片（如上所述）。切片在32°C的ACSF中恢复45分钟。

在所有情况下，反应都是通过在干冰上快速冷冻切片来停止的。蛋白质的制备、印迹和定量如下所述（参见西方印记,SI方法)50μg嘌呤霉素标记蛋白在4%至12%的梯度凝胶（Invitrogen）上溶解，并使用嘌呤菌素特异性抗体（小鼠单克隆12D10）使用SUnSET协议进行可视化(16). 通过将总泳道信号从250至15kDa取出来并从未标记的蛋白质泳道中减去该信号来确定蛋白质合成水平。将时间点与相应时间点的标签车辆折叠进行比较。

对于4EGI-1浓度曲线实验(图1C类)，所有药物均装在16.0μL载剂中，并加入适量的4EGI-1（20、40或80μg）。输注30分钟后，处死大鼠，快速提取杏仁核并冷冻在干冰上，提取蛋白裂解物，然后进行免疫沉淀或免疫印迹。

免疫沉淀。

组织在含有mM:40 hepes（pH 7.5）、150 NaCl、10焦磷酸、10甘油磷酸、1 EDTA和0.1%CHAPS、蛋白酶抑制剂II、磷酸酶抑制剂混合物I、II（Sigma）的冰冷裂解免疫沉淀缓冲液中均质。清除的匀浆（150–250μg）与抗eIF4G（1:100）（Bethyl Laboratories）孵育，并在4°C下轻轻摇晃过夜。抗体/裂解液混合物与结合在琼脂糖载体上的75μL IgG孵育（Pierce）。通过在25°C下摇晃2 h（或4°C过夜）培养珠/样品浆液。去除并保存上清液，在裂解缓冲液中洗涤免疫沉淀物三次，在mM（50 hepes pH 7.5，40 NaCl，2 EDTA）的洗涤缓冲液中清洗一次。将六倍SDS/PAGE缓冲液添加到洗涤的免疫沉淀物中，然后将其溶解在Novex预制（Invitrogen）4至12%梯度凝胶上。免疫沉淀的效率是通过检查从柯达4000MM成像仪获得的图像中的上清液和洗涤液部分来确定的（参见西方印记,SI方法). eFI4E的带密度值归一化为从免疫沉淀物中获得的eIF4G。

西方印迹和抗体。

使用标准方案进行蛋白质印迹。有关本研究中使用的原醇和抗体的详细描述，请参见SI方法.

补充材料

支持信息：

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院MH083472（给K.K.C.）、NS034007（给E.Klann）、NS047384（给E.Klann），MH46516（给J.E.L.）和MH38774（给J.E.L.）的支持；和FRAXA研究基金会（E.Klann）。

脚注

作者声明没有利益冲突。

*这篇直接提交的文章有一个预先安排的编辑。

本文包含在线支持信息，网址为www.pnas.org/lookup/supl/doi:10.1073/pnas.1013063108/-/DC补充.

工具书类

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文章来自美国国家科学院院刊由以下人员提供美国国家科学院