大电导率Ca²⁺-激活的K⁺通道β₁-亚单位敲除小鼠不是高血压

摘要

大电导率ca²⁺-激活的K⁺通道（BK通道）被膜去极化激活，胞浆钙增加²⁺浓度(17,27). BK通道提供血管张力的“负反馈”控制，因为BK通道激活导致血管平滑肌细胞（VSMC）膜电位超极化，电压门控钙离子关闭²⁺通道和肌肉放松。在VSMC中，BK通道由成孔α亚基和辅助β组成₁-调节钙的亚单位²⁺灵敏度(17,43). BK通道β₁-该亚基在VSMC中富集，并与BK成孔α-亚基共渗。β基因缺失₁-亚单位降低钙²⁺BK通道的灵敏度并减少Ca的耦合²⁺火花到BK通道激活(2,32). BK通道β₁-亚单位敲除（BKβ₁-KO）小鼠已被用于研究BK通道功能在VSMC收缩力生理调节中的作用以及作为人类疾病（如哮喘）模型(41)，勃起功能障碍(47)和膀胱过度活动(29). 这些研究结果表明，BK通道可能是人类疾病治疗的治疗靶点(8,9,18).

BKβ的动脉研究₁-KO小鼠表现出较高的动脉肌张力和收缩力(2,31)内皮功能障碍和O增加₂⁻通过增加NADPH氧化酶的活性和表达而形成(28). 尚不清楚BKβ₁-KO小鼠也有较高的静脉张力和收缩力，尽管BK通道被证明可以调节猪体内的静脉容量(49)在一些实验动物体内(26,43)和人类(14,22,23,37). 据报道，BKβ的平均动脉压（MAP）₁-使用颈动脉插管进行急性测量时，KO小鼠的血压升高了～10–15 mmHg(2,32). 使用尾袖容积描记法进行的测量显示，BKβ的MAP值要高得多₁-KO小鼠（>20 mmHg）与对照小鼠的比较(11,12). BK通道β₁-亚单位也在肾小球细胞、集合小管和醛固酮敏感的远端肾单位中表达，其中β₁-亚单位与BK通道结合调节K⁺分泌物(11,12,13,33,34). BKβ高血压₁-KO小鼠与K的改变有关⁺分泌物，钠⁺清除和醛固酮增多(11,12,13,33,34).

使用尾袖体积描记术或颈动脉导管插入术测量血压需要约束小鼠；伴随的压力会改变血压(31). 在BKβ中₁-KO小鼠，应激对血压的影响可能会因血管肌张力增高、内皮功能障碍、O₂⁻形成和醛固酮增多症(2,11,12,32,28). 因此，测定BKβ的血压至关重要₁-KO小鼠使用遥测技术，将压力对血压测量的影响降至最低(15,24,31,48). BK通道的破坏导致L型钙的激活²⁺膀胱平滑肌细胞的膜电位通道(E类_米)去极化和L型钙增加²⁺电流密度(42). 没有研究直接评估L型Ca²⁺BKβ通道导致血压升高₁-KO小鼠。BKβ₁-KO小鼠可能表现出血压对盐的敏感性增加，因为它们的血浆醛固酮、钠水平升高⁺和钠受损引起的渗透压⁺间隙(11). BKβ血压升高₁-KO被低钠降低⁺使用尾袖容积描记法测量饮食(11). 在目前的研究中，我们比较了BKβ的血压₁-KO和野生型（WT）通过无线遥测控制小鼠。我们还评估了血管L型钙的作用²⁺BKβ通道功能及高盐摄入对血压的影响₁-KO小鼠。在体外评估肠系膜动脉（MA）中BK通道功能在动脉收缩性和β肾上腺素能受体（AR）介导的舒张中的作用.最后，早期研究表明，体内BK通道受损不仅会增加MAP，还会降低静脉容量(49). 因为我们和其他人都认为调节静脉平滑肌张力有助于调节动脉压力(10,16,21,35)，我们还比较了BK和L型钙²⁺WT和BKβ在MA和肠系膜静脉（MV）中的通道功能₁-体外KO小鼠。

材料和方法

结果

BKβ₁-KO小鼠没有高血压。

BKβ每日（24小时平均）MAP₁-KO小鼠与WT小鼠无差异(图1A类). 因为体力活动影响MAP(41)在小鼠最活跃的夜间也测定MAP。遥测仪植入五天后，当小鼠恢复正常昼夜节律时，BKβ的MAP₁-KO小鼠夜间（6:00 P.M.-6:00 A.M.）比WT小鼠高约10 mmHg，而白天（6:00 A.M-6:00 P.M）没有差异(图1B类). 平均夜间和日间MAP测量值如所示图1C类.

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图1。

连续测量野生型（WT）和大电导率钙的平均动脉压（MAP）²⁺-激活的K⁺通道（BK）β₁-遥测植入后敲除（KO）小鼠7天。MAP每10分钟采样10秒。A类：每日MAP计算为24小时测量的平均值。B类：每小时MAP计算为每小时6次测量的平均值第6天和第7天.C类：夜间（6:00 P.M.-6:00 A.M.）和白天（6:00 A.M-6:00 P.M）的平均MAP。天：WT和BKβ的每日心率（HR）₁-遥测植入后7天对KO小鼠进行测量。HR每10分钟取样10秒。每日HR计算为24小时测量的平均值*与WT小鼠显著不同(P（P）< 0.05).

发件人第3天当小鼠恢复血压昼夜节律时，WT和BKβ之间的HR没有差异₁-KO小鼠(图1天). BKβ₁-KO小鼠也没有心脏肥大，正如心身重量比的类似值所示（WT，4.8±0.1 mg/g；BKβ₁-KO，4.9±0.1毫克/克，n个=每组14人，P（P）> 0.05).

硝苯地平对WT和BKβ的降压作用相似₁-KO小鼠。

硝苯地平引起WT和BKβMAP的快速发作和剂量依赖性降低₁-KO小鼠(图2,A–D). 两组硝苯地平的阈值剂量均为1.25 mg/kg，MAP最大下降量为10 mg/kg₁-KO小鼠与WT小鼠在各剂量硝苯地平下进行比较。BKβ的MAP恢复时间无差异₁-KO小鼠与WT小鼠的比较。

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图2。

A–D：硝苯地平（Nif）诱导WT和BKβ的降压反应₁-KO小鼠。MAP在硝苯地平给药前2小时和给药后4小时每隔10分钟显示一次*与WT小鼠显著不同(P（P）< 0.05).

BKβ中的血压₁-KO小鼠可能对盐不敏感。

给WT和BKβ注入盐水（1%氯化钠）7天₁-KO小鼠。在BKβ中₁-KO小鼠，MAP随着盐摄入量的增加而立即增加(图3A类). 然而，与MAP基线水平相比，24小时平均MAP在5天内仅增加3-5 mmHg(图3A类)然后返回到基线水平第6天WT和BKβ24小时平均MAP无差异₁-盐水给药期间的KO小鼠。在BKβ中MAP显著升高₁-仅在夜间KO(图3,B类和C类). 高盐摄入在任何时候都不会改变WT小鼠的MAP。

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图3。

1%氯化钠摄入对WT和BKβMAP的影响₁-KO小鼠。A类：在1%氯化钠进水之前、期间和之后测量的每日MAP。B类：小鼠摄入高盐时，夜间和白天的平均MAP*与控制水平显著不同(P（P）< 0.05).

删除β₁-亚单位损害动脉BK通道功能并增加L型钙²⁺通道功能。

BK和L型Ca²⁺用paxilline和Bay K 8644在隔离和加压MA中测试通道功能(图5). 在WT MA中，帕西林和Bay K 8644的ID分别比基线水平降低了21±4和38±5%(图4,A类,B类、和E类). 在BKβ中₁-KO MA，帕西林仅使MA收缩4±2%，与WT MA相比减少75%(图4,C类和E类). Bay K 8644诱导的MA收缩为52±4%，比WT MA增加30%(图4,天和E类).

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图4。

帕罗西汀和Bayk 8644对WT和BKβ的影响₁-KO肠系膜动脉（MA）体外培养。WT MA中帕西林和Bayk 8644收缩反应的追踪记录(A类和B类)和BKβ₁-KO马萨诸塞州(C类和天).E类：WT和BKβ的平均数据₁-KO MA.MAID，MA内径*与WT MA显著不同。

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图5。

帕西林、Bayk 8644和苯肾上腺素（PE）对WT和BKβ的影响₁-体外KO MV。A类和B类：WT和BKβ中的跟踪记录₁-KO肠系膜静脉（MV）。C类：WT和BKβ的汇总数据₁-KO MV.MVID，MV内径*与WT MV显著不同。

PE在WT和BKβ制剂中引起了非常大且相似的MV收缩₁-帕西林和Bay K 8644均未使MV收缩的KO小鼠(图5,A–C).

BK通道缺陷增加MA收缩性，但不改变β-AR介导的MA舒张。

为了确定BK通道缺陷是否会改变动脉收缩力，我们比较了BKβ对NE和KCl的收缩反应₁-KO和WT MA(图6). NE浓度响应曲线在BKβ中左移₁-KO马萨诸塞州(图6A类). BKβ的pD2值为7.2±0.3₁-KO和6.3±0.4（对于WT MA）(n个= 5–6,P（P）< 0.05). 最大收缩相似，两种制剂中NE的收缩峰值均为1μmol/l。在BKβ中KCl浓度响应曲线也呈左移₁-KO与WT MA比较(图6B类). 当KCl浓度为40 mmol/l时，BKβ的收缩反应₁-KO MA大于WT MA（72±5 vs.52±5%，P（P）< 0.05) (图6C类). 帕罗西林消除了WT和BKβ之间的差异₁-KO MA制剂(图6C类). 帕西林使WT-MA收缩21±3%，但帕西林不收缩BKβ₁-马萨诸塞州KO。

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图6。

WT和BKβ收缩和舒张反应的比较₁-体外KO-MA.A型和B类：NE和KCl在WT和BKβ中的浓度响应曲线₁-马萨诸塞州KO。C类：对KCl（40 mmol/l）的收缩反应，无论是否预处理帕西林（0.5μmol/l）。天：异丙肾上腺素（ISP）在PE（1μmol/l）预收缩WT和BKβ中的浓度响应曲线₁-KO MA，有或没有ICI-118551（1μmol/l）预处理*与WT MA显著不同。

确定BKβ中的β-AR功能是否上调₁-采用或不采用ICI-118551治疗对KO小鼠ISP诱导的MA松弛进行测试。预约束WT和BKβ的松弛₁-KO制剂与ISP类似，有或没有ICI-118551治疗(图6天).

BKβ₁-亚单位在小鼠静脉中不表达。

BKβ的表达₁-通过LacZ基因染色测定BKβ血管中的亚单位₁-KO小鼠(2,41). β₁-MA平滑肌细胞中容易检测到亚单位表达(图7,D–F型)但不在MV准备中(图7,G公司和F类). 我们还比较了BKβ₁-其他动脉和静脉中的亚单位表达[见补充数据（本文的补充数据可在美国生理学杂志：心脏和循环生理学网站上找到。）]。BKβ₁-亚单位在整个动脉系统中均有检测，但仅在门静脉主干和肺静脉中检测到。

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图7。

WT和BKβ中MA和MV的LacZ基因染色₁-KO小鼠。阳性染色显示在BKβ₁-KO-MA段(天和E类)和MA横截面中的平滑肌细胞(F类)，但不在WT MA的线段和横截面中(A-C公司). BKβ段染色阴性₁-KO MV.箭头表示阳性染色。

讨论

BKβ₁-KO小鼠已被广泛用作人类疾病动物模型中研究BK通道功能对平滑肌细胞收缩性的贡献的工具(29,41,47). 以前的研究发现，BKβ₁-KO小鼠患有高血压，可能是因为血管肌生成张力和收缩力增加、氧化应激和钠异常⁺-K（K）⁺肾脏的吸收/清除(2,11,12,28,32). 然而，我们报告称，当使用遥测技术测量血压时，高血压被定义为24小时平均MAP、BKβ显著升高₁-KO小鼠没有高血压。BKβ₁-在小鼠最活跃的夜间，KO小鼠的MAP确实略高于WT小鼠，但夜间MAP的增加是适度的，与WT小鼠相比，不会导致24小时平均MAP显著增加。

在目前的研究中，血压是通过遥测技术测量的。这项技术提供了更可靠的测量，因为可以连续进行测量，并且不存在尾袖容积描记术或使用栓系动物的动脉导管直接测量所需的束缚应力(15,24,31,48). C57BL6 BKβ中的MAP₁-KO小鼠在交感神经系统活性最高的夜间升高<10 mmHg。BKβ之间的MAP无差异₁-KO和WT小鼠在白天交感神经活性较低时。总的来说，两组小鼠24小时平均血压测量值没有差异。这些数据支持我们的结论，即BKβ₁-KO小鼠没有高血压。我们的数据与之前的研究结果对比表明，当使用尾袖容积描记术或颈动脉插管测量MAP时，MAP升高(2,11,12,13,32). 之前在129 svj+C57BL/6 BKβ混合组中报告过高血压₁-KO系小鼠（高出约20 mmHg）(2)，一种比任何其他小鼠菌株血压都高的菌株(7)和4-至8-摩尔C57BL/6 BKβ₁-KO小鼠（高于~13 mmHg）(32)，通过导管测量。有趣的是，Grimm等人的早期研究(11,12)还表明，3到4个月的C57BL/6 BKβ₁-KO小鼠（来自Brenner博士实验室）患有高血压。与从Charles River Laboratory购买的C57BL/6对照小鼠相比，血压高约20 mmHg（通过尾袖测量）(11,12). 在我们的研究中，我们使用了BKβ₁-KO和对照小鼠的年龄和遗传背景完全相同。因此，不同的年龄和遗传背景并不能解释我们的观察结果。与非遥测血压测量相关的行为应激可能会增加交感神经活动，这可能是早期实验中观察到的MAP升高的原因。在我们的研究中，从BKβ中分离出MA₁-KO小鼠对NE的收缩力增加。这些数据与之前在主动脉和脑动脉中的研究相似(2,28,32)也就是说，由于E类_米去极化和较高水平的活性氧(2,28,32). 然而，BKβ的收缩性增加₁-KO动脉由E类_米去极化，而不是通过特异性增加对去甲肾上腺素的敏感性，因为对KCl的反应也增强，而这种增强被BK通道阻滞剂减弱(32). 因此，BKβ中可能增加了对限制性应激的交感神经介导的血压反应₁-KO小鼠因血管反应性增加。我们的遥测测量显示BKβ支持这一解释₁-KO小鼠在活动期MAP较高。我们没有在体内测试MAP对外源NE的反应。然而，“高血压”C57BL/6 BKβ₁-KO小鼠对α反应正常₁-早期研究中植入导管测量MAP时体内AR激活（PE）(32). 对α的不同反应₁-体内和体外肾上腺素能血管收缩可通过体内限制性应激来解释，即基线血压可能因BKβ的交感神经介导的血管收缩而升高₁-早期研究中的KO小鼠。我们发现BKβ对NE的反应阈值较低₁-KO动脉，但BKβ对NE的最大反应相似₁-KO和WT动脉。有趣的是，栓系BKβ的HR基线水平显著升高₁-KO比对照组小鼠（680±8 vs.617±20次/min）(32)而在我们的研究中，当通过遥测测量时，两组动物的心率相似（两组均为560±15次/分）。这些结果表明，压力和交感神经介导的血管收缩可能导致早期研究中观察到的血压升高。虽然BKβ不太可能₁-亚单位突变会直接增加交感神经流出量，交感神经活性在这些小鼠血压调节中的作用有待进一步研究。

持续高血压会导致心肌肥厚，以及BKβ₁-如果MAP长期升高，KO小鼠将出现心肌肥大。然而，我们没有检测到BKβ的心肌肥大₁-KO小鼠，与我们的结论一致，这些小鼠没有高血压。这一结果与早期关于129 svj+C57BL6 BKβ心肌肥大的报道不同₁-具有高血压遗传背景的KO小鼠(2,7). 我们的结果得到了关于C57BL/6 BKβ的早期报告的支持₁-KO小鼠的心脏肥大并不明显，尽管据报道血压比对照小鼠高约13–20 mmHg。小鼠的年龄从12周到8个月不等(11,12,32). 因此，早期研究并不表明C57BL/6 BKβ₁-KO小鼠随着年龄增长而高血压(46)，因为即使在8个月龄的小鼠中也没有心肌肥大(32). 我们的研究结果也得到了BK通道α-亚单位KO小鼠研究的支持。在这些小鼠中，BK通道功能全面丧失，这导致遥测测得的血压（～6 mmHg）轻微但显著升高(38). 血压适度升高是由于醛固酮增多症伴血清钾降低所致⁺以及小动脉血管张力增加。在这些小鼠中未检测到心肌肥大。此外，作者得出结论，完全BK通道缺失导致的系统性血压表型相对温和，比预期的要温和，至少在静息状态下是如此。然而，在“紧急”情况下，如内毒素和失血性休克、缺氧和缺血，BK通道功能对血管张力和血压的调节作用(8,9)，这是非常可能的。

来自BKβ的动脉₁-此前，KO小鼠在体外表现出肌生成张力和收缩力增加(2,28,32)以及我们目前的研究。在类似的动脉中，当L型Ca²⁺平滑肌通道特异性失活(25). 在我们的体外研究中，我们发现BKβ₁-KO MA表现出明显受损的BK通道功能和适度增加的L型钙²⁺分别使用paxilline和Bay K 8644测试时的信道功能。这表明BKβ肌原性张力增加₁-KO动脉由钙增强介导²⁺通过L型钙的流入²⁺可能是因为动脉平滑肌细胞的负膜电位较低，伴随着L型钙的增加²⁺窗口电流。如果是，阻断L型钙²⁺通道功能应导致BKβ的血压大幅下降₁-KO与WT小鼠进行比较。令人惊讶的是，在我们的研究中，BKβ对硝苯地平的降压反应仅稍大（峰值约为10 mmHg）₁-KO和WT小鼠。根据体外研究结果，预计硝苯地平诱导的降压反应会大大增强。然而，L型钙仅适度增加²⁺通道介导的血压效应与我们的发现一致，即小鼠血压正常。血压对L型钙的异常适度依赖²⁺通道可以反映BKβ的代偿性下调₁-KO，但我们的体外数据不支持这一观点。尚不清楚L型钙²⁺通道在小鼠MV中表达；然而，缺乏功能性L型钙²⁺MV中的信道得到当前研究的支持，研究表明Bay K 8644不收缩WT和BKβ₁-KO MV。那么，推测在体内WT和BKβ中没有硝苯地平诱导的静脉舒张作用₁-KO小鼠。我们的结果与早期研究一致，研究表明L型钙²⁺通道在静脉中表达，但通道被细胞内钙“沉默”²⁺(45). 我们不能排除可能有助于调节BKβ动脉张力的其他机制的异常₁-KO小鼠；例如，T型Ca²⁺信道也可以与BK信道相关联(5,19). 测量心输出量和计算总外周阻力对于评估完整BKβ的整体动脉收缩张力是必要的₁-KO小鼠。

BKβ的预期高血压表型₁-KO小鼠也可以被代偿信号通路的适应性上调所掩盖，从而导致钙降低²⁺通过电压操作Ca的流入²⁺体内通道。例如，β-AR-cAMP蛋白激酶A（PKA）信号与BK和L型钙相关²⁺平滑肌细胞的通道功能(19,20). BK通道α-亚基的突变导致PKA表达上调和β-AR/cAMP介导的气管和膀胱舒张增强(三,39,42). 然而，当我们在研究中测试β-AR介导的动脉血管舒张时，我们没有发现β-AR（β₁-或β₂-AR）介导的动脉舒张。或者，BKβ体内血管肌原性张力可能增加₁-KO小鼠，但高血压可通过抑制其他调节血压的机制（如神经体液）来预防。早期研究表明，β₁-亚基突变；然而，α亚单位突变小鼠的气管和膀胱中存在更明显的代偿机制(三,29,39,41).

最近的研究表明，BKβ₁-亚单位通道与K相关⁺分泌物，钠⁺远端肾单位的清除率和醛固酮敏感性。BKβ的破坏₁-据报道，亚单位导致K改变⁺分泌物，钠⁺清除、醛固酮增多症和高血压(11,12,13). 在已发表的研究中，BKβ₁-据报道，KO小鼠（3-4个月龄）的血浆容量较高，Na⁺钠清除受损引起的浓度和渗透压(11,12). BKβ中的血压₁-通过低盐饮食减少KO小鼠(11)表明这些小鼠的血压对盐敏感。在我们的研究中，BKβ₁-KO和对照小鼠的年龄和遗传背景与这些早期研究中的相同，但7天摄入1%氯化钠仅导致5天内MAP短暂增加5 mmHg，表明这些动物的血压对盐不敏感。虽然我们显示BKβ₁-KO小鼠在摄入高盐时不会形成持续性高血压，我们不能排除BKβ₁-高盐摄入水平的KO小鼠可能会患高血压(12)或长期高盐饮食。

在早期的研究中，在大鼠门静脉中检测到功能性BK通道(6)，兔子(1)，豚鼠(30)和BALB/c小鼠(36)也存在于大鼠的MV中(26,43). BK通道有助于调节人类隐神经(14,23,37)和前臂静脉张力(22,40). 在当前的研究中，我们发现BKβ₁-亚单位在小鼠的动脉中表达，但在静脉中不表达（门静脉和肺静脉除外，即对静脉容量贡献不大的大传导静脉）。BK通道α亚基可以在没有β的情况下发挥作用₁-亚基。一般来说，这使得BK渠道更难打开；打开缺少β的BK通道所需的电压有大约30-40-mV的正偏移₁-平滑肌细胞中的亚单位(2). 目前尚不清楚BK通道α-亚单位是否在小鼠静脉中表达，但我们的数据表明，帕西林没有感染MV，这支持了小鼠静脉中缺乏功能性BK通道。目前，我们不知道静脉中是否只有C57BL/6小鼠出现功能性BK通道缺失。静脉BK通道功能在血压调节中的作用（如果有的话）尚不清楚，但我们的数据表明，由BK通道功能障碍引起的动脉张力的单独增加可能不会对血压产生很大影响。因此，这些小鼠可能是研究BK通道在血管张力调节中的功能的有用工具，因为C57BL小鼠本身就是静脉BKβ₁-亚单位“淘汰”

总之，BKβ₁-根据连续24小时的血压测量，KO小鼠没有高血压。尽管L型钙²⁺BKβ在体外增强动脉平滑肌的通道功能₁-KO小鼠，这不会增加对L型钙的血压依赖性²⁺体内通道。小鼠静脉平滑肌细胞中不存在功能性BK通道。尽管BKβ₁-KO小鼠对钠的肾处理异常⁺和K⁺以及血浆醛固酮升高，通过遥测评估时，他们没有表现出强烈的血压盐敏感性。在静息状态下，动脉BK通道在体内的血压调节中没有关键作用，或者BK通道功能的永久性丧失可以通过其他细胞或整合血压控制机制得到有效补偿。

赠款

本研究得到了国家心脏、肺和血液研究所P01 HL-070687赠款和密歇根州立大学健康与生物医学研究倡议奖的支持。

披露

没有。

致谢

参考文献