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美国生理学杂志胃肠道肝脏生理学。2011年2月；300（2）：G303–G315。
2010年11月11日在线发布。 数字对象标识：10.1152/ajpgi.00368.2010
PMCID公司：项目经理3043647
PMID：21071507

成人胆管细胞5-羟色胺合成的旁分泌调节与胆道重塑

阿莱西亚·奥梅内蒂,1 刘洋,1,2 劳尔·盖尼丁诺夫,三，4 辛西娅·盖伊,5 史蒂夫·S·崔,1,6 魏晨,1 马克·卡隆,三和安娜·梅·迪尔通讯作者1
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关联数据

补充资料

摘要

胆管细胞和基质细胞之间的旁分泌信号调节胆道重塑。胆管细胞具有神经上皮特性，5-羟色胺受体激动剂抑制其生长，但它们是否能够合成5-羟色素尚不清楚。我们假设胆管细胞合成5-羟色胺，肝肌成纤维细胞（MF）和胆管细胞之间的相互作用调节这一过程，从而影响胆道重塑。对具有神经元色氨酸羟化酶（TPH）亚型失活突变的胆管细胞±MF和色氨酸羟基酶-2敲除蛋白（TPH2KI）小鼠的跨阱培养进行了评估。细胞培养模型的结果证实了胆管细胞具有5-羟色胺受体，并首次证明了这些细胞表达TPH2并产生5-羟色宁，这会自动抑制其生长，但会刺激TGF-β的MF生成1.TGF-β增加1反过来，通过抑制胆管细胞TPH2的表达来抵消胆管细胞生长的自分泌抑制。对TPH2KI小鼠的研究证实，TPH2介导的血清素生成在受损胆管重塑中起着重要作用，因为TPH2功能降低的小鼠胆汁血清素水平降低，并表现出胆管细胞过度增殖，异常小管和肝祖细胞积聚，胆管结扎后肝纤维化加重。这一新证据表明，胆管细胞表达所谓的TPH神经元同种型，从头合成血清素，并将血清素作为自分泌/旁分泌信号来调节胆管树的再生，这补充了早期的研究，即血小板被动释放血清素刺激肝细胞增殖。鉴于5-羟色胺调节药物的广泛使用，这些发现对从各种类型的肝损伤中恢复具有潜在的重要意义。

关键词：神经色氨酸羟化酶、纤维导管反应、胆道纤维化、肝祖细胞

各种阻碍因素大胆管（如结石、狭窄、癌症）抑制胆汁流动并诱导肝内胆管细胞的代偿性增殖，以产生替代性胆管(14). 在健康成人肝脏中，胆管由胆管细胞排列，胆管细胞来源于少量常驻的双功能肝上皮祖细胞（人类称为肝母细胞，啮齿动物称为卵圆细胞），这些祖细胞也能够分化形成肝细胞。成肝细胞/卵圆细胞及其直系后代定位于肝内胆道树的最近端分支（称为Hering管）(31,32). 在大胆管梗阻期间，积聚在门脉周围区域的导管细胞表达未成熟肝上皮细胞的标记物，包括角蛋白7（KRT7）和巢蛋白，表明胆管梗阻促进了祖细胞池的扩张(8,28,29). 肌成纤维细胞（MF）和纤维基质也沿门静脉道积聚，最终导致胆汁性肝硬化(14).

在肝胆发育的正常过程中，增生的、未成熟的导管细胞和基质成分也会在肝内短暂积聚。与成人一样，在胚胎发育过程中，胆道树和肝实质都是由多能干祖细胞形成的(30). 当环绕门静脉分支的成肝细胞开始胆管细胞分化时，形成导管板(30). 导管板结构的重塑随后通过上皮-间充质相互作用进行，最终形成管合并到静脉周围间充质中(30). 导管形态发生的这一阶段始于新生导管细胞迁移到间质，并与纤维基质和成纤维细胞的短暂积聚有关。最终，成纤维细胞消失，多余的基质被重新吸收，留下嵌入在明确定义的门管束中的小导管(30). 这些重塑的胆管上皮细胞的进一步成熟最终完成了肝内胆管树(30). 在人类中，肝内胆道系统的生长持续到儿童早期，成熟在青春期完成(30).

成人胆道系统因梗阻而重塑的机制尚不清楚。然而，很明显，在发育过程中，成人胆道形态发生涉及胆管细胞和邻近基质细胞，特别是MF之间的旁分泌交叉对话(25,27,30). 大胆管梗阻后，肝内胆管细胞产生各种促纤维生成因子，包括某些发育形态因子，增加(9,12,13,25–27). 这促进了MF种群的增长并增强了纤维生成。MF反过来产生可溶性因子，促进导管细胞和其他肝祖细胞的增殖和活性，从而促进这些细胞的进一步积累(25,27). 因此，患有胆管梗阻的成人肝脏中，门脉的微环境变得偏斜，有利于未成熟导管细胞和MF的生长。因此，成人的大胆管梗阻可能会重现胚胎发育期间促进胆管形成的一些力量。

如前所述，原始胆管板的形成和重塑产生成熟胆管需要肝上皮祖细胞和基质元件之间的相互对话(33). 促纤维化细胞因子转化生长因子-β促进肝母细胞的胆管细胞分化1（转化生长因子-β1) (三,30). 导管板的形成还涉及血管生成素1（Angpt1）介导的酪氨酸激酶受体（Tie2）信号传导的诱导(6). 转化生长因子-β1抑制Angpt1(23)然而，这表明该细胞因子可能通过不同影响过程的不同阶段来调节导管生成。在内皮细胞中，Tie2的Angpt1激活诱导色氨酸羟化酶（TPH）和5-羟色胺（5-HT，血清素）的产生(4,5,10,35). 目前尚不清楚5-HT是否在胚胎发生期间的胆管发育中起任何作用。然而，据报道，在成人中，血小板衍生的5-HT可促进肝细胞生长(24)而1型5-HT受体激动剂已被证明抑制胆管细胞增殖(21). 这些发现表明，5-HT可能对双功能肝祖细胞的肝细胞和胆管细胞后代产生相反的作用。

胆管细胞可变地表达神经内分泌细胞标记物，如巢蛋白、嗜铬粒蛋白A和N-cam(7,21,30). 此外，已知它们会释放5-HT(7,21). 这一背景信息使我们假设，胆管细胞合成5-HT，成年期胆管细胞前体及其后代的增殖受肝MF和胆管细胞之间的相互作用调节，后者调节胆管细胞5-HT的生物合成。为了解决这个问题，我们检测了成人胆管细胞中控制5-HT稳态的酶、受体和转运体的表达，以及在Transwell共培养系统中单独培养或与肝MF共同培养时产生5-HT的能力。对5-HT对胆管细胞增殖的直接影响进行了表征，并确定了一种调节胆管细胞5-HT生成的MF衍生因子。为了确定胆管细胞衍生的5-HT是否对阻塞的胆道系统的重塑产生病理生理相关的影响，然后在成年WT小鼠和TPH失活突变降低胆道5-HT生成的转基因小鼠中进行胆管结扎。体外和体内研究的数据支持这一假设，并确定5-HT是成人胆道重塑的重要介质。

材料和方法

人类受试者

来自杜克大学医学院组织库共享资源的三名原发性胆汁性肝硬化患者和两名对照健康肝脏的匿名肝脏切片。根据美国国立卫生研究院人体研究指南，样本按照杜克大学卫生系统机构审查委员会批准的方案进行研究。

体外研究

细胞系和培养实验。

小鼠胆管细胞603B系由Yoshiyuki Ueno（日本仙台东北大学）和G.Gores（明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所）善意提供，并按照说明进行维护(25,27). 正常大鼠胆管细胞系（NRC）是N.LaRusso（明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所）的礼物，克隆衍生大鼠肝星状细胞系（MF-8B）是M.Rojkind（华盛顿特区乔治华盛顿大学）的礼物(25,27). 为了对小鼠和大鼠的胆管细胞进行表型分析和比较，对603B和NRC系进行了单细胞培养，并收集了mRNA、蛋白提取物和胞浆。

如前所述，为了评估MF衍生因子对胆管细胞的影响，MF-8B和603B胆管细胞系单独或在Transwell插入共培养系统中培养3和6天(25,27). 在每个实验中，从所有六个孔收集mRNA、蛋白质和条件培养基，并用于随后的定量实时逆转录聚合酶链反应（QRT-PCR）、Western blot分析或HPLC。所有的实验都重复了三次。

为了评估5-HT对胆管细胞生长的影响，在两种玻片室系统（NUNC Lab-Tek II，Nalge NUNC International）和96-well板（Corning）中进行了小鼠细胞系单细胞培养。在补充5%FBS的培养基中，用增加剂量的外源性5-HT（0–6-60–180 ng/ml，5-HT盐酸盐H9523 Sigma）处理细胞，以再现共培养条件。48小时后，通过免疫细胞化学和ELISA检测评估5-溴-2′-脱氧尿苷（BrdU）掺入，评估胆管细胞增殖。

用载体或重组TGF-β处理单代培养的胆管细胞1（2 ng/ml，240-B002研发系统）24小时。通过QRT-PCR评估该治疗对Angpt1/Tie2/TPH2轴的影响。

为了重现暴露于胆管细胞衍生的5-HT的影响，MF单细胞培养物也用外源性5-HT（5-HT盐酸盐H9523 Sigma）和TGF-β1用QRT-PCR定量mRNA诱导。

mRNA提取和QRT-PCR。

采用TRIzol（Invitrogen）结合RNeasy柱（Qiagen）提取总RNA。在无RNase DNase I处理（Qiagen）后，将样本反向转录到cDNA模板，并使用SYBR Green PCR Master Mix（Bio-Rad Laboratories）进行扩增，如前所述(25,27). 扩增子产物在2.0%琼脂糖凝胶上用0.5×Tris-borate-EDTA缓冲电泳分离，然后通过AlphaImager 3400凝胶分析系统显示代表性产物。根据ΔΔC，将目标基因表达归一化为看家基因表达，并表示为与相应实验对照中检测到的水平的比率t吨方法(25,27).

蛋白质印迹。

采用标准技术进行Western blot分析。603B和NRC细胞在添加蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液（Sigma）中均质化（Complete Mini 11 836 153 001，Roche）。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离全细胞裂解物（40 mg）并转移到聚偏二氟乙烯膜。针对小鼠和大鼠细胞系，KRT19的主要抗体分别为鼠抗鼠（Troma-III，杂交瘤库）和鼠抗人（1:1000，Dako）。适当的二级抗体（1:2000）与通过增强化学发光（Pierce Biotechnology）证明的抗原一起使用。

免疫细胞化学。

为了描述本研究中使用的胆管细胞系的特征，603B或NRC细胞系也通过使用Shandon Cytospin 4（Thermo Scientific）以600 rpm的转速将其胞吐到VWR超霜+微片（VWR International）上5分钟。将玻片风干24小时，然后用冷（−20°C）丙酮固定5分钟。用0.2%的TBS-Tween渗透细胞10分钟，然后在室温（RT）下用0.1%的TBS-Triton-X再渗透10分钟。然后在PBS中清洗细胞两次，并用过氧化物酶阻断试剂（Dako）孵育10分钟以抑制内源性过氧化物酶活性，并用DakoCytomation无血清蛋白阻断试剂（达科）阻断非特异性结合30分钟。然后用一抗在4°C下孵育玻片过夜（1:100稀释）针对KRT19（大鼠抗鼠，Troma-III，杂交瘤库）或1A型5-HT受体（HTR1A，ab79230，Abcam）。山羊抗鼠IgG辣根过氧化物酶（HRP）偶联物（1:100，sc-2006，加州圣克鲁斯）或Dako EnVision-HRP标记的聚合物抗鼠抗体用作二级抗体，并在RT下培养1 h。然后用二氨基联苯胺（DAB）（Dako）进行反染色。

然后通过免疫荧光分析603B和NRC，以评估参与5-HT生物合成的酶的存在。用冷（−20°C）丙酮固定细胞5分钟，然后用0.2%的TBS-Tween渗透10分钟，然后在室温下用0.1%的TBS-Triton-X渗透10分钟。然后在PBS中清洗细胞两次，用抗TPH1（兔多克隆TPH-H60，sc-30079，Santa Cruz）或TPH2（山羊多克隆TPH2-C12，sc48955）的初级抗体清洗细胞在4°C下涂敷过夜。用TBS-Tween 20 0.01%洗涤后，添加次级抗体30分钟。使用同型匹配抗体（R&D系统）作为阴性对照。Alexa Fluor 488羊抗兔（分子探针）和Alexa Fuor 594驴抗羊用作二级抗体（1:100稀释）。在两种细胞系中还进行了TPH2和胆道标记物γ-谷氨酰转移酶（γGT）（GGT1/2 sc-20639，Santa Cruz）的协同免疫荧光。采用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（Vectashield H-1200，Vector Laboratories）进行反染色。

为了评估体外BrdU标记指数，将603B接种到玻璃室载玻片上（Lab-Tek II，Nalge Nunc International），并在含有5%FBS的培养基中以增加剂量的5-HT（0-6-60-180 ng/ml，5-HT盐酸盐，H9523 Sigma）孵育48小时，加入BrdU，使增殖的胆管细胞将其并入细胞核。然后在PBS中清洗细胞两次，将其固定在80%丙酮中10分钟，然后用1 N HCl变性10分钟。用过氧化物酶阻断试剂（Dako）培养以抑制内源性过氧化物酶活性，并用Dako细胞形成无血清蛋白阻断试剂（达科）阻断抗体的非特异性结合30分钟。然后在室温下将载玻片与抗BrdU（M0744抗-BrdU，克隆Bu20a-Dako）的一级抗体（1:100稀释）孵育1小时。采用Dako EnVision-HRP标记的聚合物抗小鼠作为检测系统，进行标准DAB（Dako）复染。

细胞增殖试验。

按照制造商的说明，在96个平皿中重复培养带有外源性5-HT的603B细胞，并进行ELISA BrdU免疫分析（德国曼海姆罗氏）。

可溶性TGF-β1蛋白质定量。

从单/共培养物中收集条件培养基。转化生长因子-β的含量1用Quantikine小鼠、大鼠、猪、犬TGF-β测定胆管细胞和MF在培养基中的释放1免疫分析（MAB100B，研发系统），根据制造商的说明。

体内研究

动物和手术。

携带R439H等位基因TPH2功能突变的年龄匹配敲除（KI）小鼠(n个= 16) (1)和野生型（WT）室友(n个=12），并保持在温度和光照控制设施中。为了诱导胆道纤维化，动物接受了胆管结扎术（BDL）或假手术（sham），并在手术后2周被安乐死。对每只动物的肝脏和体重进行注释，并获取血液、胆汁和肝脏样本。为了评估体内胆管细胞增殖指数，在安乐死前2 h腹腔注射BrdU（50μg/g体重）。所有动物护理和程序均由杜克大学医学中心机构动物护理和使用委员会批准。

免疫组织化学。

用标准苏木精和伊红（H&E）对福尔马林固定、石蜡包埋的肝脏切片进行染色，以评估一般组织学。通过体内BrdU（Sigma-Aldrich）核掺入评估胆管细胞DNA复制指数。如前所述，使用小鼠抗BrdU（M0744，Clone Bu20a，Dako）处理切片。简言之，将载玻片固定、透化，并与过氧化物酶阻断试剂（Dako）孵育10分钟。用Citraplus缓冲液（BioGenex）预处理组织10分钟，作为热诱导的表位回收。用1 N HCl对载玻片进行10分钟的变性处理，以使抗BrdU抗体与DakoCytomation无血清蛋白块（Dako）结合并封闭30分钟。然后将载玻片与针对BrdU（M0744，克隆Bu20a-Dako，1:100稀释）的一级抗体孵育在4°C下过夜，使用Dako EnVision-HRP标记的聚合物抗鼠抗体作为检测系统，并使用标准DAB（Dako）复染。随机选择20×门脉野评估BrdU阳性细胞核，并分别计算导管细胞和肝细胞的BrdU标记指数。为了更好地评估导管反应区域内增殖的胆管细胞，还评估了BrdU与KRT19的共定位。即如上所述进行BrdU免疫组化。将载玻片与DakoCytomation无血清蛋白块（Dako）孵育30分钟，然后在4°C（1:500稀释）下隔夜涂抹大鼠抗鼠KRT19抗体（TROMA-III，发育研究杂交瘤库）。按照制造商的说明，使用鼠对鼠聚合物（PROMARK，Biocare Medical）和Vulcan快速红染色试剂盒2（Biocare-Medical）作为二次检测系统。

此外，还进行了标准免疫组织化学研究，以评估转基因小鼠和WT同窝小鼠对Sham或BDL的反应中KRT19-、AE1/AE3（Zymex）-和α-甲胎蛋白（A0008 Dako）阳性群体的扩增情况。为了对KRT19进行量化，使用Metaview软件（Universal Imaging）分析了×20个门管区（不考虑每个门管区的主要胆管），如前所述(26). 详细的检索技术和使用的抗体见表1.

表1。

用于免疫组织化学的抗体和检索技术

靶蛋白抗体检索技术稀释孵化
HTR1A型约79230Citraplus公司200过夜4°C
韩元-19特罗姆-IIICitraplus公司1,000过夜4°C
溴化铀M0744，克隆Bu20a0.1 M柠檬酸盐500过夜4°C
BrdU/KRT-19型M0744/TROMA-III型Citraplus公司500/1,000隔夜4°C/2小时室温
AE1/AE3Zymex公司Citraplus公司500过夜4°C
法新社AA008型400过夜4°C

形态测量学。

为了量化纤维化，5μm切片(N个=每组5个）用苦玫瑰红（Sigma）染色并用快速绿（Sigma）复染(30). 如前所述，使用Meta View软件进行形态分析和量化(27).

统计分析。

结果以SE的平均值表示。使用学生的t吨-测试。显著性在5%水平上被接受。

结果

人、小鼠和大鼠胆管细胞表达1A型5-HT受体，并通过降低增殖活性对5-HT治疗作出反应

免疫染色用于定位人类肝活检中HTR1A的表达。我们发现HTR1A由肝细胞表达（补充图S1；本文的在线版本包含补充数据），与早期报告一致(15,34). 此外，免疫组化显示，在健康人肝脏中，肝门管区胆管中的胆管细胞表达5-HTR1A蛋白。在原发性胆汁性肝硬化的肝脏中，胆管、胆管和纤维化门管区散在的基质细胞也表达HTR1A(图1A类). 由于HTR1A在健康和疾病肝脏的胆管细胞上的免疫组织化学证据是新的，因此，在与HTR1A或非免疫血清的初级抗血清孵育后，将已建立的小鼠和大鼠胆管细胞系的胞浆暴露于HRP结合的二级抗体，以验证HTR1A染色的特异性。只有在预先暴露于抗HTR1A后才显示出染色；小鼠胆管细胞（603B细胞系）和大鼠胆管细胞（NRC细胞系）均表现出强烈的HTR1A表达(图1,B类和C类). 因此，免疫染色数据补充并扩展了早期关于HTR1激动剂抑制BDL大鼠导管增殖的报道(20). 然而，早期的研究并未直接检测5-HT本身对导管增殖的影响。因此，我们用5-HT处理5-HTR1表达的小鼠胆管细胞。5-HT诱导胆管细胞BrdU掺入的剂量依赖性减少(图1D类)确定5-HT是胆管细胞生长抑制剂。

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胆管细胞表达HTR1A，并通过降低增殖活性对5-HT治疗作出反应。A类：原发性胆汁性肝硬化（PBC）患者或健康对照者（NL）代表性切片中1A型5-HT受体（HTR1A）免疫染色；插入). 箭头表示HRT1A阳性胆管/小管，并指向HTR1A阳性基质细胞。原始放大倍数×40。B类和C类小鼠603B系的免疫细胞化学(B类)和大鼠正常胆管细胞（NRC）系(C类)证明胆管细胞均匀表达HT1RA。插入在里面B类显示603B胆管细胞暴露于非免疫血清作为阴性（NEG）对照。原始放大倍数×63。D类：外源性5-HT处理小鼠胆管细胞导致细胞增殖抑制，5-溴-2′-脱氧尿苷（BrdU）标记指数呈剂量依赖性降低(顶部、和左下角)和ELISA BrdU掺入试验(右下角). 在×10原始放大倍数下，显示了暴露于外源性5-HT（0-6-60-180 ng/ml）48小时的胆管细胞腔玻片的代表性图片。定量数据表示为平均值±SE，组间差异由双尾学生的t吨-测试*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.001.

胆管细胞表达5-HT生物合成、分解代谢和转运的酶。

接下来，为了确定胆管细胞本身是否可能是5-HT的来源，我们使用QRT-PCR和免疫细胞化学检测了5-HT生物合成的速率控制酶TPH的mRNA和蛋白表达。TPH有两种亚型：TPH1定位于非神经元（外周）细胞，而TPH2主要表达于神经细胞(38–40). 在体外验证细胞保留了胆管细胞标记物（KRT19和γGT）的表达后，我们评估了小鼠和大鼠胆管细胞系中TPH1和TPH2的表达(图2,A类,电子、和F类). 小鼠和大鼠胆管细胞表达两种TPH亚型(图2,B类–F类). 正如HTR1免疫染色预测的那样，胆管细胞也表达HTR1A mRNA。此外，HTR1B、单胺氧化酶（mao）A和maoB（降解5-HT）的转录物，以及5-HT转运蛋白（sert）（介导细胞从细胞外空间摄取5-HT(图2B类). 因此，胆管细胞具有产生、降解、响应和运输5-HT的酶机制。

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胆管细胞表达5-HT生物合成、分解代谢和转运的酶。A类：Western印迹(左边)和免疫细胞化学(中间的和正确的)分析表明，小鼠603B和大鼠NRC胆管细胞均均匀表达导管标志物角蛋白19（KRT19）。原始放大倍数×63。B类定量实时逆转录聚合酶链反应（QRT-PCR）扩增子的2%琼脂糖凝胶显示603B胆管细胞中色氨酸羟化酶（tph）-1和-2、htr1A和B、单胺氧化酶（mao）A和B以及5-羟色胺（5-HT）转运体（sert）的表达。C类和D类：绿色TPH1免疫荧光细胞染色(C类)和TPH2为红色(D类)表明两种小鼠（603B，C类和D类,左边)和大鼠（NRC，D类和电子,正确的)表达5-HT生物合成的速率限制酶。4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）显示细胞核。用非免疫血清和次级抗体孵育的603B和NRC显示为阴性对照。原始放大倍数×40(C类和D类). 603B显示红色TPH2与绿色导管标记物γ-谷氨酰转肽酶（GGT）的协同免疫荧光(电子)和NRC(F类)胆管细胞。原始放大倍数×63。

胆管细胞产生5-HT

然后使用HPLC比较603B胆管细胞单培养物、603B肝细胞与肝MF和MF单培养物的Transwell共培养物条件培养液中的5-HT含量(图3A类). 在所有培养基中检测到5-HT。从MF单培养物和胆管细胞与MF的Transwell共培养物中获得的培养基含有可比水平的5-HT。然而，胆管细胞单培养物中5-HT的含量高出六倍。这些结果表明，可溶性MF衍生因子可能抑制了胆管细胞产生5-HT。

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肌成纤维细胞（MF）衍生的TGF-β抑制邻近胆管细胞中Angpt1/Tie2/TPH2轴和5-HT的产生。A类：采用高效液相色谱法检测603B胆管细胞（实心条）或MF（开放条）单培养物和胆管细胞/MF共培养物（阴影条）培养液中的5-HT含量。数据表示为绝对浓度（ng/ml）的平均值±SE。B类和C类：单培养和共培养胆管细胞（分别为实心和阴影条）的QRT-PCR显示tph-1和tph-2的差异表达(B类)血管生成素1（angpt1）和tie-2(C类). 将数据归一化为单个培养的胆管细胞，并显示为平均值±SE。D类：ELISA检测显示TGF-β1单个培养的603B胆管细胞培养基（实心条）或MF（开放条）和共培养条件培养基（阴影条）中的含量。将结果归一化为胆管细胞单细胞培养的值，并表示为平均值±SE。电子：603B-单培养胆管细胞暴露于重组TGF-β1（2 ng/ml）或载体在无血清培养基中培养24 h，并进行QRT-PCR分析以评估angpt1、tie2和tph2的表达。数据按照车辆处理控制标准化，并显示为平均值±SE。F类：MF单细胞培养物用外源性5-HT和TGF-β处理48 h1QRT-PCR检测细胞诱导率。结果归一化为车辆处理的MF，并表示为平均值±SE。对于所有数据集，双尾Student’st吨-测试用于评估组间差异*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.001.

为了进一步评估这种可能性，比较了单培养和共培养胆管细胞中TPH1和TPH2的表达。单培养胆管细胞和与MF共培养的胆管细胞中TPH1 mRNA水平相当相似。相比之下，与MF共同培养的胆管上皮细胞TPH2表达降低了80%(图3B类). 因为Angpt1与Tie2相互作用调节内皮细胞中5-HT的合成(4,35)接下来，我们确定了与MF共培养的胆管细胞是否会影响5-HT生成调节因子的表达。与单培养胆管细胞相比，与MF共培养的胆管细胞表达的Angpt1和Tie2 mRNA水平显著降低(图3C类). 总之，这些结果表明MF衍生因子可能会干扰促进TPH2表达和5-HT合成的胆管细胞Angpt1-Tie2信号，但还需要进一步的研究来明确证明这一点。

转化生长因子-β1据报道抑制Angpt1(23)和MF提供了丰富的TGF-β来源1在受伤的肝脏中。因此，我们比较了TGF-β1从我们的培养系统中提取条件培养基的含量，以评估TGF-β是否存在差异1暴露可能是导致单培养和共培养胆管细胞中Angpt1/Tie2/TPH2表达和5-HT含量差异的原因。MF单细胞培养基中TGF-β含量约为其两倍1作为胆管细胞的单细胞培养。MF与胆管细胞共培养进一步增加TGF-β1水平。因此，与MF共培养的胆管细胞暴露于显著较高浓度的TGF-β1胆管细胞的单细胞培养(图3D类). 确定较高水平的TGF-β1可能直接影响了胆管细胞5-HT的合成，用TGF-β对603B胆管细胞进行单培养1（或载体）24小时。与载体处理的对照组相比，暴露于TGF-β的胆管细胞1表达Angpt1、Tie2和TPH2 mRNA水平显著降低。这些发现支持MF-衍生TGF-β的概念1抑制胆管细胞产生5-HT。胆管细胞中5-HT的从头合成受到抑制，进而可能导致与肝MF共培养的胆管细胞的增殖活性增强(27).

因为TGF-β的水平1MF与胆管细胞共培养时增加(图3D类)，我们接下来问胆管细胞是否会产生促进转化生长因子βMF生成的因子1由于单培养胆管细胞的5-HT含量显著高于共培养胆管细胞(图3A类)，我们用5-HT处理MF单培养物，以确定它是否直接影响MF产生TGF-β1的确，5-HT直接作用于MF以上调其TGF-β的表达1信使核糖核酸增加三倍(图3电子). 这些结果表明5-HT和TGF-β1是肝脏MF和胆管细胞交换以控制其生长的各种旁分泌信号之一。根据这个模型(图4)，胆管细胞衍生的5-HT通过自分泌机制限制胆管细胞生长，但它以旁分泌方式刺激TGF-β的产生1通过相邻的MF。MF衍生的TGF-β1反过来，为MF生长提供自分泌刺激，但以旁分泌方式下调胆管细胞5-HT的生成。5-HT的减少抑制胆管细胞的生长，使导管细胞数量增加。增殖的导管细胞反过来产生Hedgehog配体、PDGF-BB和其他维持MF生长的MF生长因子(7,9,12–13,25–27)尽管局部5-HT减少。

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调节5-HT-TGF-β的旁分泌机制的工作模型1肝MF和胆管细胞的生成。胆管细胞衍生的5-HT（红色球体）以自分泌方式限制胆管细胞生长(1)并以旁分泌方式刺激TGF-β的产生1相邻MF（蓝色球体）(2). MF-衍生TGF-β1反过来，为MF的增长提供了一种自给自足的刺激(三)但以旁分泌方式下调胆管细胞5-HT的生成(4). 5-HT抑制胆管细胞生长，使导管细胞数量增加(5). 增殖的胆管细胞反过来产生可溶性因子（例如，Hedgehog配体、PDGF-BB、TGF-β1)尽管当地5-HT减少，但仍能维持MF的增长(6).

TPH2功能失活的小鼠在BDL后表现出胆汁5-HT减少和导管增殖过度

为了确定该模型的病理生理相关性，该模型来源于我们的细胞培养数据，我们比较了TPH2失活突变的转基因小鼠对BDL诱导的胆道损伤的反应(1)和WT室友控制。TPH2敲除小鼠（TPH2KI）在小鼠TPH2 R439H等位基因中携带一个功能性突变，该突变相当于在一组严重单极性抑郁症患者中发现的人类TPH2 R 441H等位突变(1). 先前对TPH2KI小鼠的鉴定表明，在表达TPH2的细胞中，5-HT合成减少了约80%，而TPH1和SERT的活性不受影响(1).

通过HPLC比较WT和TPH2KI小鼠的胆汁5-HT含量，评价了TPH2抑制对胆管细胞产生5-HT的影响。因为健康小鼠产生的胆汁数量不足，无法进行分析，所以在BDL后2周从WT和TPH2KI小鼠中收集胆汁。TPH2KI小鼠胆汁中5-HT含量持续降低(图5A类). TPH2KI小鼠胆管细胞产生5-HT的减少可能是其胆汁中5-HT含量减少的原因，因为1)原代肝细胞既不表达TPH1也不表达TPH2 mRNA（补充图S2）2)已知TPH2KI小鼠保留SERT功能(1). 因此，缺乏肝细胞改变5-HT生成和/或释放的证据。

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TPH2功能失活（TPH2KI）的小鼠表现出胆管结扎（BDL）导致的导管和肝细胞过度增殖。A类：采用高效液相色谱法评估TPH2KI胆汁中的5-HT含量(n个=10）和野生型（WT；n个=8）小鼠在BDL手术后2周。点表示每只动物的5-HT绝对胆汁浓度（ng/ml）。黑色条显示每组数值的平均值±SE。B类：在任一Sham后2周安乐死的代表性小鼠肝脏切片的苏木精和伊红（H&E）染色(左边)或BDL(正确的)手术。原始放大倍数×20。C类：WT中角蛋白（KRT）-19染色的代表性图片(顶部)或TPH2KI(底部)小鼠BDL手术后2周。原始放大倍数×40。右图显示了KRT19的计算机辅助形态测量评估结果+Sham或BDL手术后2周，WT和TPH2KI小鼠的面积。数据按照WT-Sham控制标准化，并显示为平均值±SE。D类：术后2周，给小鼠注射BrdU，2小时后处死；肝门管区（PT）胆管细胞BrdU标记指数定量(顶部)和TPH2KI(底部). 数据归一化为WT BDL，并表示为平均值±SE。原始放大倍数×40。插入显示BrdU阳性细胞核的小导管放大图像。电子：BDL TPH2KI小鼠截面的代表性图片显示KRT19/BrdU与BrdU合作定位到KRT19+管道(顶部)至KRT19−门脉周围区的肝细胞(顶部和底部).F类：肝细胞BrdU标记指数在WT门脉周围区域定量(顶部)和TPH2KI(底部). 数据归一化为WT BDL，并表示为平均值±SE。原始放大倍数×40。所有定量数据均表示为平均值±SE，组间差异由双尾学生的t吨-测试*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.001.

接下来，通过将WT和TPH2KI小鼠暴露于BDL，评估胆管细胞衍生5-HT减少对胆道重塑反应的影响。两组BDL诱导的导管增殖(图5B类). 然而，H&E染色的肝脏切片检查表明，TPH2KI小鼠的胆管对胆道损伤的反应更加强烈，在BDL后的门脉周围区域显示出大量异常的胆管结构。用胆管细胞标记物KRT19染色的肝脏切片的计算机辅助形态计量学评估证实了这种印象。BDL后2周，TPH2KI小鼠累积KRT19+TPH2KI小鼠的细胞增加了近25倍，而WT小鼠的增加了7倍(图5C类和补充图S3A类). BrdU标记表明，TPH2KI小鼠中KRT19表达细胞的扩增反映了胆管细胞增殖的增加(图5,D类和电子). 有趣的是，在BDL后，门脉周围的一些小肝细胞也合并了BrdU(图5F类). 与WT小鼠相比，TPH2KI小鼠BDL后BrdU阳性小肝细胞的蓄积量更大，TPH2K1组的肝体重比也显著增加(表2).

表2。

BDL对WT和TPH2KI小鼠肝脏和体重的影响

重量BDL第2版BDLP（P）价值
体重，g20.46 ± 0.07724.78 ± 1.170.021
肝脏重量，g1.12 ± 0.0421.59 ± 0.080.001
肝脏/体重，%5.5 ± 0.206.4 ± 0.070.0004

数值为平均值±SE。

胆管结扎术；WT，野生型；TPH2KI，色氨酸羟化酶-2敲除蛋白。

TPH2活性降低促进BDL小鼠肝祖细胞的生长

5-羟色胺已被证明能刺激成熟肝细胞的增殖(7). 因此，TPH2KI小鼠肝细胞增殖活性增加的证据[其中5-HT生成减少，SERT功能得到保留(1)]出乎意料。因为胆道树为能够沿肝细胞或胆管细胞谱系分化的双功能祖细胞提供了一个生态位(31–32)胆汁5-HT生成减少刺激了导管细胞的生长(图5,B类–电子)，我们检测了BDL后TPH2活性降低对祖细胞积累的影响。与WT-BDL小鼠相比，TPH2KI-BDL鼠表达了各种肝祖细胞标记物的mRNA水平显著升高，包括未成熟肝细胞标记物[α-胎蛋白（afp）和krt7]，以及未成熟胆管细胞标记物（krt19、krt7和nestin）（补充图S4）。免疫组织化学证实了这些发现，也显示表达祖细胞相关角蛋白的细胞显著扩张(图6,A类和B类和补充图S3B类)和AFP(图6,C类和D类和补充图S3C类). 有趣的是，假手术后，在TPH2KI小鼠中很容易发现表达AFP的肝细胞（但在WT小鼠中很少发现）(图6,C类和D类). 总的数据表明，胆汁中5-HT的产生调节了产生胆管细胞和肝细胞的双功能肝祖细胞群体的增殖活性。

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TPH2活性和胆汁5-HT含量的降低促进肝祖细胞的生长。AE1/AE3（标记祖细胞相关细胞角蛋白）的免疫组织化学分析(A类和B类)和α-甲胎蛋白（AFP）(C类和D类)WT代表路段(左边)和TPH2KI小鼠(正确的)假手术后2周(顶部)或BDL(底部)手术。代表性图片以40倍原始放大倍数显示。B类：AE1/AE3+面积通过计算机辅助形态测量评估进行量化。数据按照WT-Sham控制标准化，并显示为平均值±SE。D类：法新社+在免疫染色的肝脏切片中，对门脉附近的肝细胞进行计数(n个=5/组）。显示平均值±SE结果*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.001.

胆汁5-HT生成减少的小鼠肝纤维化加重

在慢性肝损伤期间，未成熟导管细胞和其他祖细胞（包括双功能肝祖细胞）的扩张通常与MF积聚和纤维化进展平行(31). 因此，我们比较了BDL后WT和TPH2KI小鼠的纤维生成。TPH2KI小鼠的纤维生成因子（例如tgfβ、pfgf-BB）、αsma（MF标记物）和胶原蛋白1（α）的mRNA表达增加。我(图7A类). 天狼星红染色也显示BDL-TPH2KI小鼠的肝纤维化持续高于BDL-WT小鼠(图7,B类和C类). 因此，成年TPH2KI小鼠胆汁中5-HT含量的降低（TPH2具有失活突变）显示出未成熟导管细胞的增殖增加，异常肝内胆管的形成，AFP的积累+当受到刺激胆道重塑的挑战时，祖细胞和胶原沉积增强。

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BDL后TPH2KI小鼠肝纤维化增加。A类：采用QRT-PCR分析BDL后2周TPH2KI（阴影条）和WT（实心条）小鼠的全肝组织，以评估纤维生成标记物[血小板衍生生长因子BB（PDGFBB）、TGF-β1，胶原蛋白1α（I），α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）]。数据标准化为WT-BDL值，并显示为平均值±SE。组间差异由双尾学生的t吨-测试*P（P）< 0.05.B类：进行天狼星红染色以显示纤维基质的差异。显示了各组的典型显微照片。原始放大倍数×20。C类：计算机辅助定量苦味酸红+WT（实心条）和TPH2KI（阴影条）小鼠肝脏切片中的面积(N个=每组5人），2周BDL手术。结果归一化为WT-BDL值，并显示为平均值±SE。两组之间的差异由双尾学生的t吨-测试*P（P）< 0.05.

讨论

肝外胆道系统的慢性阻塞刺激肝内导管细胞的增殖，以及门脉周围纤维基质的进行性堆积，最终桥接相邻的门脉，导致继发性胆汁性肝硬化(13). 本研究通过证明BDL诱导的导管细胞增殖和肝纤维化在具有TPH2失活突变和胆汁中5-HT含量降低的TPH2KI小鼠中均显著加剧，从而确定5-HT是这种纤维导管反应的重要调节剂。

伴随的体外研究表明，胆管细胞同时表达TPH1（由非神经元细胞表达的典型TPH亚型）和TPH2（所谓的神经元特异性TPH亚型态），并证明胆管细胞能够从头合成5-HT。结果还表明，5-HT直接抑制胆管细胞增殖，并表明这种自分泌生长抑制剂的胆管细胞产生受到TGF-β的显著影响1是一种MF衍生因子，可选择性下调胆管细胞TPH2的表达。

早期研究表明，在胆汁淤积性肝损伤期间，导管细胞和肝MF通常聚集在一起(12,13,37)并证明肝脏MF释放可溶性因子促进导管细胞生长(27). 因此，新发现揭示了肝脏MF促进邻近胆管细胞生长的一种新的旁分泌机制。细胞培养数据还表明，5-HT直接刺激肝MF生成TGF-β，这是一种支持MF生长的促纤维化因子。后一信息扩展了胆管细胞衍生促纤维化因子的列表(7)已知其包括PDGF-BB，一种有效的MF有丝分裂原(7,9). 因此，总的数据进一步支持了这样一个概念，即胆管细胞和肝MF之间的串话通过调节细胞暴露于生长调节剂中来协调胆道重塑。

需要进行更多研究，以阐明MF衍生TGF-β的具体机制1结果胆管细胞TPH2表达下调。由于TPH2以前不知道由胆管细胞表达，因此尚未探索其在此类细胞中的调节。然而，在其他细胞类型中，Angpt1、Tie2和TGF-β之间的相互作用1被证明可以调节5-HT的产生(4,5,10,23,35). 类似的机制可能在胆管细胞中起作用，因为我们发现将胆管细胞与肝脏MF共培养可显著抑制胆管细胞Angpt1和Tie2mRNA的表达。还需要进一步的工作来梳理不同胆管细胞衍生因子对MF生长的相对贡献和累积效应。我们的研究表明，5-HT刺激这些细胞产生TGF-β1是公认的MF生长因子。然而，同样明显的是，当5-HT的胆管细胞生成量下降时，其他自分泌/旁分泌因子能够驱动MF生长，因为MF种群通常会作为胆管细胞与MF旁分泌相互作用的净效应而扩张(12,13,25,27,37). 事实上，在目前对BDL-TPH2KI小鼠的研究中证明了后者的存在，与保持较高5-HT水平的WT小鼠相比，BDL-TPH2KI小鼠积累了更多的MF，并出现了更严重的肝纤维化。

许多类型的慢性肝损伤能够触发纤维化和导管细胞积聚（称为导管反应）。这种反应通常伴随着肝祖细胞数量的增加，包括肝母细胞/卵圆细胞、沿Hering管（胆道树的近端分支）分布的双功能肝上皮祖细胞(30,32). 本研究揭示了5-HT在这一过程中的作用，因为缺乏5-HT的TPH2KI小鼠在慢性胆汁淤积性损伤期间表现出肝祖细胞数量增加。有趣的是，这些群体包括表达未成熟肝细胞标记物的细胞（如α-胎蛋白），以及具有未成熟胆管细胞特征的细胞（例如巢蛋白表达）。因此，这些新发现表明，胆道5-HT生成的抑制促进了肝母细胞/卵圆细胞及其后代的生长。我们的发现进一步支持了这种可能性，即门脉周围区域的小AFP阳性肝细胞聚集了BrdU，这表明该区域的增殖活性增强。鉴于已发表的证据表明，将成熟肝细胞暴露于血小板衍生的5-HT刺激其增殖，这些结果尤其具有煽动性(15). 因此，5-HT对未成熟和成熟肝细胞的生长有不同的影响。因此，总的数据支持这样的观点，即在BDL后，祖细胞群体而非成熟肝细胞促进再生反应，从而导致5-HT缺乏的TPH2KI小鼠发生肝肿大。

还需要进一步研究，以阐明受5-HT影响的特定生长调节机制。以前的出版物将白细胞介素（IL）-6和调节IL-6表达的因子（如Foxa1和Foxa2）确定为5-HT调节的有吸引力的靶点。在人类中，慢性胆汁淤积性肝病与Foxa2在肝脏的表达降低有关(2)，一种与Foxa1相互作用以抑制IL-6转录的因子(17). BDL后导管细胞增殖活性的增强通常归因于IL-6，因为BDL诱导胆管细胞产生IL-6，而降低IL-6活性的各种策略可减弱BDL诱导的导管细胞增殖(19,20). 我们对BDL后WT和TPH2KI小鼠肝脏中IL-6 mRNA水平的初步比较表明，与WT小鼠相比，TPH2K小鼠中IL-6表达的诱导作用大六倍（补充图S5）。然而，到目前为止，我们发现BDL后WT和TPH2KI小鼠Foxa1或Foxa2的表达几乎没有差异（数据未显示）。因此，需要进一步研究以确定减少5-HT如何增加IL-6的产生。鉴于最近的一份报告，IL-6的过度表达发生在肝祖细胞中Foxa1和Foxa2靶向缺失的小鼠肝脏中，并导致AFP阳性祖细胞群的扩张、导管增殖和肝纤维化，这项工作将是重要的(17).

总之，肝导管细胞能够从头合成5-HT，抑制胆道5-HT生成的自分泌/旁分泌机制刺激导管细胞、肝MF和祖细胞增殖的新证据表明，肝细胞衍生的5-HT通常起到“刹车”的作用抑制这种细胞的生长。这一新信息补充了5-HT是成熟肝细胞重要有丝分裂因子的现有知识(15). 与胆管细胞不同，成熟肝细胞缺乏5-HT生物合成所必需的酶机制，因此，它们接触5-HT依赖于其他细胞释放5-HT。除了胆管细胞外，血小板和神经元还能够在肝脏微环境中释放5-HT(15,21,33). 因此，5-HT的浓度在不同的肝脏微区之间可能存在显著差异，从而允许细胞特异性调节增殖活性。根据5-HT受体细胞库的变化以及合成和降解5-HT的酶的表达，5-HT在肝上皮细胞分化谱中的净作用也可能不同。

虽然对成人肝脏中的此类问题知之甚少，但已有研究表明，血小板衍生的5-HT耗竭抑制了啮齿类动物肝部分切除术后的肝脏再生(15). 在人类中，至少有一次特异性肝毒性和进行性肝衰竭可归因于抗血小板药物氯吡格雷(11). 数以百万计的人服用改变5-HT稳态的药物来治疗抑郁症和其他神经精神疾病。相反，大多数类型的纤维化和胆汁淤积性肝病中发生的纤维导管反应预计会减少5-HT的肝脏生成。然而，这是否会导致晚期肝病的任何神经精神并发症，尚不清楚。尽管如此，总的观察结果提出了一种有趣的可能性，即5-羟色胺能信号传导影响肝脏损伤的各种结果，并确定该领域值得进一步研究。

赠款

这项工作得到了国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所RO1 DK077794（a.M.Diehl）的资助。

披露

作者未声明任何利益冲突，无论是财务还是其他方面。

补充材料

补充数字：

致谢

我们感谢W.C.Stone对本研究的行政支持，以及H.M.Vandongen的技术建议。Rolf Kemler开发的TROMA-III抗体来自发育研究杂交瘤银行，该银行由美国国家儿童健康与人类发展研究所赞助开发，由爱荷华大学爱荷华市生物系维护，邮编52242。

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文章来自美国生理学杂志-胃肠和肝脏生理学由以下人员提供美国生理学会