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皮肤病学投资杂志。作者手稿；PMC 2011年2月23日发布。
以最终编辑形式发布为：
《皮肤病学杂志》。2008年1月；128(1): 9–17.
2007年7月12日在线发布。 数字对象标识：10.1038/sj.jid.5700949
预防性维修识别码：项目经理3043461
NIHMSID公司：NIHMS48201标准
PMID：17625597

表皮中Bmi-1的表达通过改变细胞周期调控蛋白的表达和抑制细胞凋亡提高细胞存活率

他第四任妻子凯西·李,1 高塔姆·阿迪卡里,1 Sivaprakasam Balasubramanian语,1 拉马穆尔西·戈帕拉克里什南（Ramamurthy Gopalakrishnan）,1 托马斯·麦考密克,2 戈伯丹·P.迪姆里,三 理查德·L·埃克特,1,2的情况下，4,5和埃伦·罗克6
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

多梳群（PcG）基因是基因表达的表观遗传学抑制剂，在发育中起着重要作用。在本研究中，我们检测了Bmi-1（B细胞特异性Moloney小鼠白血病病毒整合位点1）作为人类表皮角质形成细胞存活调节器的作用。我们鉴定了表皮和培养的人角质形成细胞中Bmi-1 mRNA和蛋白的表达。Bmi-1位于培养的角质形成细胞的细胞核中，在表皮中表达于基底层和基底上层。腺病毒载体Bmi-1促进角质形成细胞存活并保护角质形成细胞核免受应激因子介导的细胞死亡。这与细胞周期蛋白D1和选定的细胞周期蛋白依赖性激酶水平增加，caspase活性和聚ADP-核糖聚合酶（PARP）裂解降低有关。Bmi-1可能参与维持疾病状态，因为Bmi-1在转化的角质形成细胞、皮肤肿瘤和牛皮癣中水平升高。表皮基底上非增殖细胞和皮肤肿瘤内高百分比细胞中存在Bmi-1，表明Bmi-1在该组织中具有非干细胞促生存作用。基于Bmi-1在表皮基底上的分布，我们认为Bmi-1可能促进基底上角质形成细胞存活的维持，以防止分化过程中的过早死亡。这样的功能将有助于确保分层表皮的正确形成。

简介

多梳群（PcG）基因在哺乳动物的发育中起着重要的作用。Bmi-1（B细胞特异性Moloney小鼠白血病病毒整合位点1）是果蝇属调节干细胞维持和更新的PcG蛋白(莱斯萨尔等., 1999;欧姆（Ohta）等., 2002;公园等., 2003). Bmi-1是一种表观遗传调节因子，被认为在某些系统中通过抑制ink4a/ARF位点基因表达发挥作用。该位点编码细胞周期进程抑制蛋白p16墨水4a和第19页自动变速器（第14页自动变速器人类）。Bmi-1依赖性抑制p16墨水4a和19自动变速器水平以及其他细胞周期抑制蛋白的水平导致干细胞存活和增殖增强(岩岛等., 2004). Bmi-1作用的中断对发展有深远影响(岩岛等., 2004). 例如，B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1−/−小鼠无法有效更新造血干细胞，这一反应被归因于缺乏正常的、依赖Bmi-1的p16强直性抑制墨水4a和第19页应收账（f）水平(雅各布斯等.，1999年a;莫洛夫斯基等., 2003;公园等., 2003). 白血病和神经干细胞在B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1−/−老鼠(Lessard和Sauvageau，2003年;莫洛夫斯基等., 2003). 除了对干细胞的这些影响外，有人认为Bmi-1可能通过抑制p16的转录来增强肿瘤细胞的增殖/存活墨水4和第19页自动变速器(金等., 2004)并通过Bmi-1依赖性增加端粒酶逆转录酶的表达和活性(迪姆里等., 2002). 端粒酶逆转录酶是端粒酶的催化蛋白亚单位，负责维持端粒长度，端粒酶反转录酶的激活与细胞永生化有关(迪姆里等., 2002). 总之，这些发现表明Bmi-1在调节正常细胞生理学以及在过度增殖性疾病和上皮癌中作为促生存/增殖因子发挥着重要作用(冯兰唐等., 2001;迪姆里等., 2002;金等., 2004).

表皮是一层多层上皮，位于基底层的增殖细胞进行调节的细胞分裂(Fuchs和Byrne，1994年). 这种细胞分裂导致产生子细胞，这些子细胞进入基底上表皮层并进行分化(埃克特等., 1997). 这些分化细胞失去了增殖能力，但在分化过程的最后阶段之前，它们仍能存活。了解这些细胞停止增殖并在分化过程中保持的过程是一个主要目标。在本研究中，我们探讨了Bmi-1作为角质形成细胞功能调节器的作用。我们发现，Bmi-1在培养的表皮角质形成细胞和人类表皮中表达，并且在培养的正常人类角朊细胞中Bmi-1的过度表达促进了细胞数量的增加。此外，Bmi-1可保护角质形成细胞免受应激因子（UVB、冈田酸（OA）等）的攻击，并且在银屑病和鳞状细胞癌中Bmi-1水平升高，表明其在促进肿瘤细胞存活方面发挥作用。这些效应与细胞周期调节蛋白表达的变化和角朊细胞凋亡的抑制有关。基于这些发现，我们认为Bmi-1在维持基底层角质形成细胞的增殖和分化基底层上角质形成上皮细胞的活性方面发挥着重要作用。这些发现表明，最初被确定为干细胞维持因子的Bmi-1可能在表皮中发挥非干细胞作用，以维持分化的基底上角质形成细胞的存活。

结果

Bmi-1在角质形成细胞中表达

本研究的主要目的是评估Bmi-1是否在调节正常人表皮角质形成细胞存活方面发挥作用。据报道，Bmi-1在维持在3T3饲养细胞上的表皮角质形成细胞和培养的毛囊衍生干细胞中表达(克劳迪诺等., 2005;莫雷利等., 2006). 我们首次证实，当在无血清培养基中培养表皮角质形成细胞并在塑料上培养时，Bmi-1在培养的表皮角质化细胞中表达。如所示图1a通过逆转录PCR（RT-PCR）分析评估，表达Bmi-1编码mRNA。此外，如所示图1b在有（+）或无（−）抗Bmi-1的情况下培养总角质形成细胞提取物时，也存在Bmi-1蛋白。PcG基因产物，包括Bmi-1，作用于细胞核(科恩等., 1996)，我们监测了Bmi-1的亚细胞定位。用抗Bmi-1抗体对生长在玻璃盖玻片上的角质形成细胞进行免疫染色。如所示图1c，细胞核中检测到内源性hBmi-1。

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Bmi-1在培养的正常人角质形成细胞的细胞核中表达

(一)从正常人表皮角质形成细胞的近融合培养物中制备的总RNA（500 ng）在400 n存在或不存在的情况下通过RT-PCR扩增米并通过溴化乙锭染色检测所得cDNA产物（箭头）。M表示DNA大小标记（核苷酸）的迁移。β-每个样品中的肌动蛋白RNA扩增到相似水平（未显示）。(b条)从正常人角质形成细胞的近融合培养物中制备的总细胞提取物在8%聚丙烯酰胺凝胶上电泳用于免疫印迹。平行泳道在存在（+）或不存在（−）小鼠单克隆抗Bmi-1（稀释1∶500）的情况下孵育，然后加入第二抗体并使用增强化学发光试剂进行可视化。β-测定肌动蛋白水平以使蛋白质负荷正常化。(c（c）)将生长在玻璃盖玻片上的角质形成细胞固定，并在存在或不存在小鼠单克隆抗Bmi-1（1∶25稀释）的情况下孵育，然后与Cy3缀合的绵羊抗小鼠IgG（1∶100）孵育。箭头表示核Bmi-1。在三个单独的实验中，每个实验都观察到了类似的结果。

为了证实Bmi-1在人表皮中的表达，分离角质形成细胞RNA，并通过RT-PCR检测Bmi-1 mRNA。如所示图2a，在包皮表皮中检测到Bmi-1编码mRNA。此外，包皮表皮提取物与抗Bmi-1的孵育揭示了Bmi-1蛋白的存在(图2b). 然后，我们使用免疫组织学分析检查包皮切片，以监测Bmi-1组织分布。如所示图2c虽然在一些基底层增殖细胞中检测到Bmi-1，但在基底上表皮层也检测到分散分布的免疫反应性。真皮中很少或没有检测到Bmi-1表达。基底上Bmi-1的存在与最近的报道一致(雷尼施等., 2007). Bmi-1在整个基底上层都有高水平表达，这一事实很有趣，因为它表明Bmi-1可能在该组织中起非干细胞作用。

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Bmi-1在人类表皮中表达

(一)从分离的人包皮表皮中制备的总RNA（500 ng）在存在或不存在400 n的情况下通过RT-PCR扩增米每个引物的DNA产物通过溴化乙锭染色检测(体内)（箭头）。样本显示“K”是使用从感染tAd5-hBmi-1的培养人角质形成细胞中分离的RNA检测到的RT-PCR产物。M表示DNA大小标记（核苷酸）的迁移。(b条)从分离的人包皮表皮中制备总细胞提取物(体内)或取自培养的正常人角质形成细胞（K），并在8%聚丙烯酰胺上电泳，然后使用抗Bmi-1（1:500）和HRP-结合羊抗鼠IgG二级抗体（1:5000）进行免疫印迹。使用增强化学发光试剂观察二级抗体结合。β-测定肌动蛋白水平以使蛋白质负荷正常化。(c（c）)人类表皮组织切片采用石蜡包埋、脱蜡，并通过二甲苯和分级酒精系列进行水合。在0.3%H中孵育后2O（运行）2用PBS冲洗组织切片30分钟，然后在含有1%正常山羊血清和1 mg/ml牛血清白蛋白的PBS中封闭1小时。将一级抗体（小鼠单克隆抗Bmi-1，稀释1:50）在室温下添加2小时，然后与二级抗体（生物素化马抗鼠，1:1000）孵育30分钟，并使用Vectastain试剂盒（加利福尼亚州伯灵盖姆Vector Laboratories）对信号进行可视化。对切片进行清洗，然后用苏木精（Fisher，Pittsburgh，PA）复染，并用盖玻片密封。顶部面板（对照）与二级抗体孵育，底部面板（抗Bmi-1）与一级和二级抗体孵化。箭头表示表皮基底层。条形=50μm.这个实验重复了三次，每个实验的结果都相似。

Bmi-1表达促进角质形成细胞增殖

上述研究表明，Bmi-1存在于培养的角质形成细胞的细胞核中，也在表皮中表达。为了评估其功能作用，使用腺病毒载体过度表达Bmi-1。如中所示图3a原代角质形成细胞感染tAd5-hBmi-1导致细胞内Bmi-1水平增加五倍。为了评估对细胞数量的影响，用tAd5-EV或tAd5-hBmi-1感染角质形成细胞，并在72小时后监测细胞数量。在tAd5-EV感染的细胞中，由于细胞在3天内正常生长，感染后72小时角朊细胞数量增加了三倍。相反，在表达Bmi-1的培养物中，细胞数量增加了7倍(图3b). 为了评估细胞数量的增加是否反映在DNA合成水平上，我们监测了[三H] 胸腺嘧啶掺入上述处理的细胞DNA中。如所示图3c细胞数量的增加与DNA合成的平行增加有关，表明更多的细胞在表达Bmi-1的细胞中通过S期进展。

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Bmi-1表达增加角质形成细胞数量

(一)百分之三十汇合50厘米2在含有5 MOI Ad5-TA病毒的情况下，用tAd5-hBmi-1或tAd5-EV的5 MOI感染正常人角质形成细胞培养皿。24小时后，再添加新鲜的无病毒培养基24小时。在感染后48小时，收集细胞并制备提取物，用于电泳和免疫印迹抗Bmi-1。β-同时检测肌动蛋白作为蛋白质标准化对照。(b条)如上所述，用病毒处理角质形成细胞，在感染后48小时收集并计数。开条（对照）是开始病毒治疗时第0天的细胞数，阴影条是感染后72小时的细胞计数。请注意，细胞在tAd5-EV存在下以正常速度生长，因此细胞数量增加了72小时的几倍。根据学生的评估吨-文本中，tAd5-EV组和tAd5-hBmi-1组的平均值之间的差异在95%置信区间内是显著的。(c（c）)用上述病毒处理角质形成细胞，在48小时生长期的最后2小时内，用1μCi/ml（每毫升）[三H] 胸腺嘧啶。然后用冰镇PBS清洗细胞两次，用冰镇5%（w/v）三氯乙酸清洗两次，然后溶解在0.2中米氢氧化钠。公司[三H] 用液体闪烁计数法测定胸苷含量。三个实验中的每一个都观察到了相同的结果。

Bmi-1保护角质形成细胞免受应激因子的攻击

接下来，我们监测了应激因子激发后Bmi-1对角质形成细胞存活的影响。角质形成细胞感染tAd5-EV或tAd5-hBmi-1，24小时后用12-O（运行）-十四烷基佛波醇-13-乙酸酯（TPA）或OA。感染后48小时，对细胞进行检查。我们之前的研究表明，TPA或OA治疗可降低角质形成细胞的存活率(韦尔特等., 1995;埃菲莫娃等., 2003). 如所示图4a，Bmi-1的表达使TPA处理的角质形成细胞的存活率显著增加。图4b显示了Bmi-1对OA治疗反应的影响。图4c提供了对中所示治疗的细胞数量变化的定量评估图4a和b本实验表明，用2或10nM处理的细胞中观察到的细胞存活率下降可以被Bmi-1逆转；然而，当细胞受到更高（10 n米)OA浓度。这表明，正如可以合理预期的那样，Bmi-1保护细胞的能力有限，高浓度的应激剂可能会压倒Bmi-1的保护作用。

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表达Bmi-1的角质形成细胞对应激诱导的细胞死亡具有抵抗力

(一)20%的正常人角质形成细胞融合培养物在Ad5-TA的5 MOI存在下感染了5 MOI的tAd5-EV（EV）或tAd5-hBmi-1（Bmi-1）。在感染后24小时，添加含有指示浓度TPA的新鲜无病毒培养基，并继续培养24小时，然后拍摄细胞。(b条)将20%的融合角朊细胞培养物与上述病毒一起处理24小时，然后在含有2或10 n的无病毒培养基中再处理24小时米办公自动化。然后对这些细胞进行拍照。(c（c）)对缺乏或存在Bmi-1以及TPA或OA激发的细胞数量变化进行图形分析。面板a和面板b中显示的实验重复了三次，并绘制了数据。根据学生的评估吨-文本中，tAd5-EV组和tAd5-hBmi-1组的平均值之间的差异在每个治疗中都是显著的（50 ng/ml TPA，2 n米OA和10 n米OA），95%置信区间。

细胞周期调节蛋白表达的Bmi-1依赖性改变

以前在其他系统中的研究表明，Bmi-1可能通过调节细胞周期调节蛋白的水平来提高细胞存活率(雅各布斯等.，1999年a;莫洛夫斯基等., 2003;公园等., 2003;金等., 2004). 因此，我们确定Bmi-1是否产生这种反应。如所示图5ahBmi-1的表达不会改变细胞周期素依赖性激酶抑制剂p21的表达。此外，第16页墨水4a水平，已知在其他系统中会降低Bmi-1(雅各布斯等.，1999年a;莫洛夫斯基等., 2003;公园等., 2003)，在当前条件下生长的角质形成细胞中不受Bmi-1调节(图5a). Bmi-1水平的调节缺失与SCC-4口腔癌细胞的最新报道一致，SCC-4细胞的生长因Bmi-1表达的siRNA敲低而减慢，但这与p16减少无关墨水4a液位(康等2007年). 相反，Bmi-1的表达确实增加了细胞周期蛋白依赖激酶cdk2和cdk4的表达，以及细胞周期蛋白D1的水平。这些发现表明Bmi-1可以通过调节一系列细胞周期调节因子来影响细胞周期进展。

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Bmi-1增强角质形成细胞的存活

(一)在Ad5-TA的5个MOI存在下，用tAd5-EV的5个MOI或tAd5-hBmi-1感染角质形成细胞。24小时后，添加新鲜的无病毒培养基，并将细胞再培养24小时。然后制备总提取物并电泳进行免疫印迹，以检测指示蛋白的存在。这个β-加入肌动蛋白免疫印迹以确保蛋白质载量相等。(b条)用tAd5-EV或tAd5-hBmi-1的5个MOI感染角质形成细胞24小时。然后添加新鲜的无病毒培养基，并用2 n培养细胞米OA再延长24或48小时。然后制备总提取物，并用抗PARP或抗蛋白酶3电泳进行免疫印迹。A类β-加入肌动蛋白免疫印迹以确保蛋白质载量相等。(c（c）)如上所述用腺病毒感染角质形成细胞，24小时后用50 mJ/cm治疗2中波紫外线。额外48小时后，收集细胞，并通过免疫印迹法检测PARP和蛋白酶原3裂解产物。箭头表示PARP和pro-case 3的完整形式。星号表示裂开形式的迁移。这个实验重复了四次，每次重复都有相似的结果。

Bmi-1可通过抑制凋亡提高细胞存活率的第二种机制。在角质形成细胞中，凋亡涉及线粒体膜电位的丧失，并伴随着包括细胞色素在内的凋亡因子的释放c（c）以及半胱氨酸依赖性天冬氨酸定向蛋白酶（caspases）的激活(丹尼等., 2002;Waterhouse公司等., 2002;Scorrano和Korsmeyer，2003年). 聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）是一种参与DNA修复的DNA镍敏感蛋白，也是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的下游靶点，也被裂解(Scorrano和Korsmeyer，2003年). 为了评估Bmi-1是否影响细胞凋亡，我们监测了表达Bmi-1的细胞中蛋白酶原和PARP裂解的程度。用tAd5-EV或tAd5-hBmi-1处理角质形成细胞24小时，然后在无病毒培养基中用OA处理24或48小时。在感染后24小时和48小时，收集细胞，并分析其蛋白酶原3和PARP裂解(图5b). 这些蛋白质的裂解与其活化有关(亚当斯和科里，2002年;石，2002). 对EV感染细胞进行OA治疗后，24小时和48小时时，前蛋白酶3和PARP裂解产物显著增加。相反，Bmi-1的存在抑制了这些裂解产物的产生。紫外线照射是表皮中一种特别重要的凋亡刺激，导致凋亡的“晒伤”细胞的产生(拜尔等., 1995). 为了评估Bmi-1表达对细胞对这种生理性凋亡刺激的反应的影响，用tAd-EV或tAd-hBmi-1感染细胞24小时，暴露于50mJ/cm2UVB，然后在感染后48小时收获用于制备细胞提取物。如所示图5b，Bmi-1的表达导致UVB依赖性蛋白酶原3和PARP裂解的显著降低。这些发现表明Bmi-1抑制细胞凋亡。

Bmi-1在皮肤肿瘤和受累银屑病组织中的表达

据报道，Bmi-1表达可使细胞永生化(迪姆里等., 2002)Bmi-1在肿瘤中过表达(冯兰唐等., 2001;金等., 2004)，我们假设Bmi-1表达增加可能与过度增殖性表皮疾病有关，包括银屑病和癌症。我们首先检测了其在转化的角质细胞衍生细胞系中的表达。如所示图6aBmi-1 mRNA在A431、HaCaT和SCC-13细胞中很容易检测到。此外，与正常包皮角质形成细胞（KER）相比，表达水平显著增加N个). 为了评估鳞状细胞癌的表达模式，我们用抗Bmi-1染色肿瘤切片。如所示图6b，Bmi-1存在于侵袭性鳞癌中。整个肿瘤染色明显，肿瘤边缘染色较少（+抗Bmi-1）。当省略一级抗体（−抗Bmi-1）时，未观察到染色。

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Bmi-1在鳞状细胞肿瘤中表达，在癌细胞系中表达增加

(一)Bmi-1在肿瘤细胞系中过度表达。从A431、HaCaT、SCC13细胞和正常人角质形成细胞的近融合培养物中制备总蛋白提取物，并进行电泳。用抗Bmi-1或抗-β-肌动蛋白。(b条)Bmi-1存在于肿瘤组织中。取自人类鳞状细胞癌的组织切片，单独与二级抗体（−抗Bmi-1）或在一级和二级抗体存在的情况下进行孵育。条形=50μm.Bmi-1在所有区域都能检测到，但不是沿着肿瘤与结缔组织交界处的边缘。

为了评估Bmi-1是否在其他表皮增生性疾病中表达，我们测量了银屑病中Bmi-1的表达。如所示图7a，与抗Bmi-1孵育显示银屑病组织中有大量染色（+抗Bmi-1）。在没有初级抗体（−抗Bmi-1）培养的切片中未观察到这种染色。为了研究Bmi-1水平升高与增殖增加之间的关系，我们将人类银屑病组织移植到严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠上，并监测免疫抑制剂环孢素（Nickoloff，1999,2000). 环孢素治疗使植入SCID小鼠的银屑病组织恢复正常(大坝等., 1999). 如所示图7b，受累的银屑病组织显示出特征性的上皮扩张至真皮下层（左图）。此外，Bmi-1染色揭示了局部Bmi-1表达的存在（箭头）。此外，环孢素治疗可使组织形态正常化，并降低Bmi-1的表达。尽管Bmi-1存在于正常组织中的分散位置，但与银屑病组织中观察到的水平相比，其水平有所降低。一个有趣的特征是，在组织的基底上层观察到最高水平的染色，这种模式与在正常表皮中观察到的模式相似（见图2c).

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Bmi-1在人银屑病组织中表达，组织正常化后表达降低

(一)银屑病患者Bmi-1表达升高。Punch活检取自受累的银屑病组织，并与二级抗体单独孵育（−抗Bmi-1）或在一级和二级抗体同时存在的情况下孵育。棒材=50μm.箭头表示Bmi-1染色。(b条)银屑病表型正常化与Bmi-1表达降低相关。将人患银屑病组织移植到SCID小鼠上。平行移植物分别用环孢霉素A或不用环孢菌素A治疗3周。然后采集组织，固定，并用抗Bmi-1染色。棒材=50μm.箭头表示Bmi-1染色。表皮的范围在括号中表示（Epi）。

讨论

PcG基因编码一个进化上保守的调节因子家族果蝇属作为同源的基因，在发育过程中参与建立身体分割模式。在哺乳动物系统中，PcG蛋白通过表观遗传机制（例如染色质修饰）调节参与发育和分化的基因。PcG基因是器官发生和发育的重要调节器，因为干细胞的重编程需要表观遗传改变（例如甲基化）来指定和维持基因表达的长期变化。PcG基因编码的蛋白质包含两种不同的蛋白质复合体，它们协同调节基因表达——“Bmi-1复合体”和“Eed复合体”。Eed复合体包括Eed、EzH1和EzH2。Bmi-1复合物包括Bmi-1、Mel-18、Mph1/Rae28、M33、Scmh1和Ring1A/B。含Eed复合物通过组蛋白脱乙酰酶的募集控制基因抑制。这种招募导致Lys的局部染色质脱乙酰化和随后的甲基化27组蛋白H3。Bmi-1复合物随后与甲基化Lys结合27组蛋白H3，由Eed复合物作用产生，抑制基因表达并有助于维持表观遗传记忆(菲施勒等., 2003). 因此，这些复合物协同作用，在发育过程中维持基因表达的变化(Jacobs和van，2002年;奥兰多，2003).

Bmi-1在角质形成细胞中表达

由于表皮是一个更新组织，必须控制分化角质形成细胞的存活率，以产生正常的表皮屏障，因此我们评估了Bmi-1是否存在，以及它是否在角质细胞中起调节作用。Bmi-1定位于培养的正常人表皮角质形成细胞的细胞核中，与先前的报告一致，该报告表明Bmi-1在成纤维细胞中存在细胞核定位(科恩等., 1996). 这种定位似乎是功能所必需的，因为不能定位于细胞核的Bmi-1突变体是不活跃的(科恩等., 1996).

几项研究表明，Bmi-1的促生存、促增殖作用可能是由于其抑制调节细胞周期进展的蛋白质表达的能力。例如，在某些细胞类型中，在缺乏Bmi-1的情况下，p16的水平墨水4a和第19页自动变速器增加（雅各布斯等., 1999一,b条). 第16页墨水4a和第19页自动变速器是的产品墨水4a-arf抑制细胞周期进展的位点。第16页墨水4a通过抑制细胞周期蛋白D依赖性激酶抑制细胞周期进程，从而防止Rb磷酸化(塞拉诺等., 1993). 第19页自动变速器（第14页自动变速器通过结合MDM2防止p53抑癌蛋白的降解和失活(塞拉诺等., 1993;韦伯等., 1999). 有趣的是，p16墨水4a在当前条件下培养的角质形成细胞中低水平表达，p16水平没有变化INK4a公司是对Bmi-1过度表达的反应。这一发现与最近的研究一致，研究表明Bmi-1的表达不会改变p16墨水4a口腔上皮细胞的表达(康等., 2007). 我们也没有观察到p21水平的变化。然而，其他细胞周期调节蛋白也发生了变化，包括cyclin D1、cdk2和cdk4水平的增加。这与最近的一份报告一致，该报告表明可能存在许多Bmi-1靶点(布雷肯等., 2006). 因此，我们的研究表明，Bmi-1调节几个控制细胞周期G1期进展的分子靶点。

成人组织中的Bmi-1与恶性肿瘤

Bmi-1功能是维持成人干细胞所必需的。老化Bmi-1−/−小鼠在白血病、神经元和小脑颗粒细胞系中逐渐失去干细胞(雅各布斯等.，1999年a;Lessard和Sauvageau，2003年;莫洛夫斯基等., 2003;公园等., 2003;梁等., 2004)和Bmi-1缺陷的成纤维细胞表达升高的p16水平墨水4a和第19页自动变速器并缓慢增殖(雅各布斯等.，1999年b). 此外，Bmi-1过度表达可增强细胞增殖(Lessard和Sauvageau，2003年)，Bmi-1与myc在淋巴腺病中协同作用(搬运等., 1991)Bmi-1在人类结直肠癌中过度表达(金等., 2004)和人类非小细胞肺癌（NSCLC）(冯兰唐等., 2001). 这些发现表明Bmi-1在调节干细胞和成体细胞增殖和存活方面发挥作用。我们的发现与Bmi-1在提高成熟角质形成细胞存活率中的作用一致。我们还发现Bmi-1在鳞状细胞癌中表达，存在于活动性银屑病病变中，并且在培养的皮肤癌细胞中过表达。此外，在将人银屑病组织植入SCID小鼠的模型中，在活动性银屑病组中观察到Bmi-1的表达，但当用环孢素治疗小鼠使组织正常化时，Bmi-1表达减少或缺失。这些发现表明，Bmi-1可能在过度增殖性皮肤病的发展和维持中发挥作用，并且与Bmi-1在其他肿瘤类型中过度表达的观察结果一致(冯兰唐等., 2001;迪姆里等., 2002;金等., 2004).

表皮中Bmi-1的表达——Bmi-1在非干细胞存活中的作用

基于Bmi-1在调节干细胞存活方面的作用，我们预计Bmi-1可能在表皮增殖区的有限数量的细胞中特异表达，即在表皮基底层或毛囊隆起中(阿隆索和富克斯，2003年;Lavker公司等., 2003;克劳迪诺等., 2005;莫雷利等., 2006). 因此，我们感到惊讶的是，尽管Bmi-1在基底细胞中表达，但在基底上层也观察到分散的染色。这一发现与最近的报告一致雷尼施等. (2007)这一点特别有趣，因为基底上层细胞（棘层和颗粒状）虽然代谢活跃且有活力，但增殖潜力有限。这些细胞正在经历分化，这与许多终末分化产物的表达有关，包括总苞蛋白、洛里克林、丝聚蛋白等(埃克特等., 1997). 最终，这些细胞存活下来，直到到达上表皮的过渡区，在那里进行最终分化和角化(埃克特等., 1997). 这一过程最终导致所有细胞内结构的酶破坏、角蛋白束的组装和角化膜的组装(绿色，1980;埃克特等., 1997). 根据表皮中Bmi-1的表达模式，我们认为Bmi-1有一个作用是帮助维持非增殖性基底上角质形成细胞，防止过早死亡。

Bmi-1与角质形成细胞凋亡

我们的结果还表明，Bmi-1可能调节表皮对应激的反应。Bmi-1的表达维持了细胞在应激因子（包括OA、TPA和UVB）刺激下的存活。UVB暴露会导致caspase相关的角质形成细胞死亡，最终导致晒伤细胞的形成，而晒伤细胞是光诱导凋亡的产物(康尼等., 1992;拜尔等., 1995). 这些细胞表达激活的杀手和刽子手半胱天冬酶(清水等., 1999;卢等., 2002). 我们的研究表明，Bmi-1的表达可以逆转或减缓这一过程。只有一份报告指出了Bmi-1在调节细胞凋亡中的可能作用。在这项研究中，有人认为Bmi-1可以抑制p19中c-myc依赖性的增加农业研究基金抑制myc相关凋亡的机制(雅各布斯等.，1999年b). 我们的研究表明，Bmi-1的表达减弱了前胱天蛋白酶激活和PARP切割中UVB依赖性的增加。因此，组织中Bmi-1的水平可能会影响组织发生凋亡的趋势，也就是说，高水平的Bmi-1可能会使组织对光诱导的凋亡产生抵抗。

因此，我们的研究表明，Bmi-1在基底和基底上表皮层的细胞中都有表达，在基底上表皮中有更强烈的染色。特别有趣的是，Bmi-1在基底上细胞中表达，因为这些细胞已经失去增殖潜能，正在经历最终分化。这表明Bmi-1可能在表皮发挥作用，以维持生存并防止过早的终末分化。同样重要的是，Bmi-1在肿瘤内和受累的银屑病表皮中高百分比的细胞中表达。在这种情况下，Bmi-1的促生存功能可能会促进细胞存活和增殖，从而导致肿瘤的发展。Bmi-1在表皮增殖组织和非增殖组织中广泛表达，这表明Bmi-1严格来说并不是该组织中干细胞存活的调节器。在未来的研究中，解决这个假设将很重要体内使用表皮中表达不同水平Bmi-1的动物。

材料和方法

试剂和抗体

OA从加州圣地亚哥Calbiochem购买，TPA从西格玛（威斯康星州密尔沃基）购买。环孢素A从Ben Venue Laboratories（俄亥俄州贝德福德）获得。美国药典提供每5毫升250毫克（NDC 55390-122-10）。一毫升含有50毫克环孢素和650毫克克雷莫波尔，是33.2%（v/v）的无水酒精。兔多克隆抗caspase 3（9665）从Cell Signaling（马萨诸塞州贝弗利）获得。小鼠单克隆抗体，包括抗细胞周期蛋白D1（554180）和抗PARP（编号556494），从BD Pharmingen（加利福尼亚州圣地亚哥）获得。小鼠单克隆抗Bmi-1（ab14389）购自Abcam Inc.（马萨诸塞州剑桥），小鼠单克隆抗体-β-肌动蛋白来自Sigma（A5441）。兔抗cdk2（sc-163）、cdk4（sc-601）、cyclin E（sc-481）的多克隆抗体，一种针对p21的小鼠单克隆抗体cip1/waf1（sc-6246）和兔抗p16多克隆抗体墨水4a（C-20）（sc-468）购自圣克鲁斯生物技术公司（加州圣克鲁斯）。二级抗体，包括HRP结合绵羊抗鼠IgG（NA931）和HRP结合驴抗兔IgG，购自Amersham Biosciences（伊利诺伊州阿灵顿高地）。甲基-三H-胸苷从Amersham Biosciences获得（TRK300，25 Ci/mmol，1 mCi/ml）。

RT-PCR分析

采用常规方法进行RT-PCR。Bmi-1的引物为5′-GGTCTAGAGAGAGACGAAATGCG和5′-GGCTCAGCATAGCAAAGCTGTAATGGCATG。人类扩增引物β-该行动是从加利福尼亚州拉霍亚市斯特拉赫纳购买的。

Bmi-1腺病毒的构建

编码人Bmi-1（hBmi-1）的cDNA(阿尔克马等., 1993)用RT-PCR扩增Xba公司1个位点编码引物和来自人类包皮角质形成细胞原代培养物的总RNA。上游引物为5′-GGTCTAGA公司C类GGATCC公司CAAGCAAA公司自动液位计CATCG公司该引物编码Xba公司我和巴姆HI位点（下划线）和粗体序列与hBmi-1相同(Alkema公司等., 1993). hBmi-1蛋白翻译起始密码子下划线。下游引物5′-GGCTCGAG公司CAT公司克他加AAGCTGTAATGGCATG公司与Bmi-1编码序列下游的非编码序列同源。粗体序列与Bmi-1序列相同Xba公司我和Xho公司I站点下划线。hBmi-1 cDNA产物长度约1060 bp，被克隆到穿梭质粒pΔE1sp1B中，作为Xba1型片段以创建pΔE1sp1B-hBmi-1。用pΔE1sp1B-hBmi-1和pJM17腺病毒主干质粒转染A293包装细胞，产生hBmi-1-编码腺病毒tAd5-hBmi-1。如前所述构建空腺病毒、tAd5-EV和Ad5-TA辅助病毒(达什蒂等., 2001).

细胞培养

如前所述，在无血清培养基中培养正常人包皮角质形成细胞(达什蒂等., 2001). A431、HaCaT和SCC13细胞在含有2 m米 我-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素、10%胎牛血清和非必需氨基酸。

细胞增殖研究

将正常人角质形成细胞接种到9.5 cm2盘子并允许附着24小时。然后，在Ad5-TA和2.5的5 MOI存在下，用5 MOI的tAd5-EV（空载体）或tAd5-hBmi-1感染细胞μg/ml聚乙烯。Ad5-TA是一种辅助性腺病毒，编码四环素激活物（TA）。在天然状态下，TA蛋白激活hBmi-1编码转录单元的转录。向培养基中添加四环素可使TA失活，并导致hBmi-1水平降低。在感染后24小时，添加新鲜培养基，并在额外48小时后，使用0.025%胰蛋白酶/1 m收获细胞米EDTA并计数。

免疫印迹分析

将细胞亚流培养物感染上述腺病毒24小时。添加新鲜的无病毒培养基，用0或2 nM OA（24或48小时）或UVB（50 mJ/cm）处理细胞2)（俄亥俄州布鲁克帕克市紫外线资源国际有限公司的FS20-T12灯，带Kodacel过滤器）。细胞在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中清洗一次，并在20 m内制备裂解物米三氯化氢（pH 7.5），含150m米氯化钠，1米米EGTA，1米米EDTA，1%Triton X-100，2.5米米焦磷酸钠，1 m米 β-甘油磷酸，1米米钒酸钠、1μg leupeptin和1m米苯基甲基磺酰氟。在10%变性和还原聚丙烯酰胺凝胶上电泳等量的蛋白质，并转移到硝化纤维素。膜被堵塞了10米米Tris-HCl（pH 7.2），含100 m米氯化钠、0.1%吐温20和5%非脂肪干乳，并与适当的一级和二级抗体孵育。使用化学发光检测系统观察二级抗体结合。

角质形成细胞中Bmi-1的免疫组织学检测

为了在培养细胞中进行检测，将生长在盖玻片上的人包皮角质形成细胞用4%甲醛固定30分钟，用PBS洗涤，并使用含有0.1%Triton X-100和1%BSA的PBS渗透30分钟。然后用小鼠抗Bmi-1（1:100）培养盖玻片1小时，在含有0.1%Triton X-100和1%BSA的PBS中洗涤，并用Cy3-共轭羊抗鼠IgG（1:1000）孵育30分钟。然后用含有0.1%Triton X-100和1%BSA的PBS清洗细胞，并将其安装在含有Mowiol 4-88的固定剂中。用表观荧光显微镜监测Bmi-1的分布。为了检测人类皮肤活检中的Bmi-1，通过穿孔活检获取组织，固定在福尔马林中，用鼠单克隆抗Bmi-1（1:100）孵育，然后用HRP-结合的山羊抗鼠IgG（1:1000）洗涤和孵育。使用Vectastain试剂盒观察抗体结合。

人银屑病皮肤移植SCID小鼠模型

从患者累及的银屑病斑块中采集角质层活检样本（0.05 cm厚）。收集时，三个或四个单独的移植节段（1.0–1.5 cm2)从每个病人的活检中分离出来，并用每个切片的一个小修剪片进行初步组织学表征。收集后24小时内，将组织片段植入8周龄雌性CB-17 SCID小鼠（Taconic）。在这种方法中，小鼠被麻醉2从侧胸上切除一段皮肤。1.0–1.5厘米2在使用无菌凡士林浸渍纱布后，使用带状条将人类皮肤移植固定在该位置。三到四只小鼠接受来自同一患者的组织，个别小鼠被归一化为不同的实验治疗组。在开始环孢素治疗之前，大约需要2周的恢复时间。小鼠每周接受两次治疗，持续3周，在50只小鼠中注射或不注射0.15 mg环孢素Aμl体积(大坝等., 1999). 在开始环孢霉素A治疗24天后，收集移植物进行组织学分析和抗Bmi-1免疫染色。这些研究得到了机构动物和人类使用委员会的批准，所有研究都是根据赫尔辛基原则宣言进行的。收集所有组织样本时，获得了患者的书面知情同意书。

致谢

这项工作利用了俄亥俄州东北部皮肤病研究中心（NIH，AR39750）的设施，并得到了美国国立卫生研究院（RLE）的资助。阿迪卡里博士是视觉科学培训拨款的受训者。

缩写

B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1B细胞特异性Moloney小鼠白血病病毒整合位点1
办公自动化冈田酸
PARP项目聚ADP-核糖聚合酶
美国公共广播电视公司磷酸盐缓冲盐水
PcG公司多梳家族
逆转录聚合酶链反应逆转录PCR
SCID公司严重联合免疫缺陷
TPA公司12-O-十四烷酰基horbol-13-乙酸酯

脚注

利益冲突作者表示没有利益冲突。

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