JNK调节神经元FoxO依赖性自噬

神经元JNK缺陷导致体外自噬增加

肝细胞成像显示JNK线粒体的形态^TKO公司神经元与对照神经元不同(图1G). 电子显微镜证实JNK^TKO公司线粒体比对照线粒体大（补充图S9）。在JNK中检测到许多形态类似于自噬体的双膜结构^TKO公司神经元，但不在对照神经元中。JNK中存在大量自噬体^TKO公司神经元提示这些细胞可能表现出更强的自噬能力。事实上，生化分析表明，自噬效应蛋白Atg8/LC3b的数量增加是通过磷脂酰乙醇胺与LC3b-I型的C末端结合产生LC3b-II来处理的，LC3b-III与自噬体膜紧密相关(Kabeya等人，2004年;Sou等人，2008年)JNK中^TKO公司神经元与对照神经元的比较(图3A). JNK中Atg8/LC3b表达增加^TKO公司神经元(图3A、E)，并且Atg8/LC3b从主要位于对照神经元胞体中的位置重新分布到JNK的轴突^TKO公司神经元(图3D). JNK中检测到的Atg8/LC3b免疫荧光^TKO公司神经元呈点状（补充图S10），与自噬体膜的定位一致。此外，p62/SQSTM1蛋白直接结合自噬效应器Atg8/LC3(Pankiv等人，2007年)在野生型神经元中检测到，但在JNK中未检测到^TKO公司神经元(图3A).

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图3。

神经元中JNK缺乏导致自噬增加。(A类)野生型（控制）和JNK^TKO公司感染CGN广告-核心在3 DIV时，在10 DIV时收获以制备蛋白质提取物，并使用LC3b、p62/SQSTM1和α-管蛋白抗体进行检测。(B类)对照品和JNK提取物^TKO公司通过检测Bcl-XL、Bnip3、Beclin-1和α-Tubulin抗体，通过免疫印迹分析检测CGN。通过Bcl-XL免疫沉淀的免疫印迹分析进行协同免疫沉淀分析。(C类)对照品和JNK提取物^TKO公司用AKT、pSer抗体探针通过免疫印迹（IB）分析检测CGN³⁰⁸-AKT、pSer⁴⁷³-AKT、FoxO1、pSer²⁴⁶-FoxO1和α-Tubulin。用Rb作为底物，在免疫复合物激酶试验（KA）中测定CDK2活性。显示相对CDK2活性在下面. (D类)控制和JNK^TKO公司CGN用βIII-管蛋白和LC3b抗体染色并用荧光显微镜检查。棒材，10μm。(E类)通过mRNA定量RT-PCR分析检测CGN中的基因表达，并将其归一化为Gapdh公司每个样本中的mRNA（平均值±SD；n个= 3). 显示了统计上的显著差异。(*)P（P）< 0.05. (F类)控制和JNK^TKO公司用DAPI和FoxO1和βIII-Tublin抗体对CGN进行染色。用荧光显微镜检查神经元。合并后的图像表示FoxO1与DAPI的共定位。棒材，10μm。

p62/SQSTM1的丢失表明JNK中自噬流量增加^TKO公司神经元与对照神经元的比较(Klonsky等人，2008年). 为了证实这一结论，我们检测了溶酶体抑制对LC3b-I转化为LC3b-II的影响。如果自噬通量增加，阻断自噬应导致LC3b-II的积累增加。与自噬通量增加一致，我们发现自噬抑制导致JNK中LC3b-II的增加更大^特科神经元与对照神经元的比较（补充图S11）。总之，这些数据表明JNK中存在积极的自噬反应^TKO公司神经元。

自噬可能有助于提高JNK的存活率^TKO公司神经元(Hara等人，2006年;小松等人，2006年). 事实上，使用药物抑制剂的研究表明，JNK的寿命延长需要自噬^TKO公司神经元与对照神经元的比较(图2C; 补充图S3）。此外，RNAi介导的自噬效应物Beclin-1的敲低导致JNK存活率降低^TKO公司神经元，但不控制神经元(图4). 总之，这些数据表明JNK的生存^TKO公司神经元依赖于自噬。

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图4。

RNAi介导的Beclin-1基因敲除对JNK自噬和存活的影响^TKO公司神经元。(A类)野生型（控制）和Jnk1号机组^{LoxP/LoxP公司}Jnk2号机组^−/− Jnk3号机组^−/−（JNK公司^TKO公司)神经元感染广告-核心在3 DIV时，在7 DIV时转染贝克林-1siRNA或对照siRNA贝克林-1通过定量RT-PCR分析，在11DIV下检测mRNA，并将其标准化为Gapdh公司每个样本中的mRNA（平均值±SD；n个= 3). 显示了统计上的显著差异。(*)P（P）< 0.05. (B类)控制和JNK^TKO公司用扰乱序列或贝克林-1用LC3b、p62/SQSTM1和α-Tubulin抗体在11 DIV下通过免疫印迹分析检测siRNA。(C类)RNAi转染对照和JNK的存活率^TKO公司对11个DIV的神经元进行定量（平均值±SD；n个= 20). 显示了统计上的显著差异。(*)P（P）< 0.05.

TORC1不介导JNK缺乏对神经元自噬的影响

mTOR蛋白激酶复合物TORC1是一种有效的自噬负调控因子(Guertin和Sabatini 2007). 因此，JNK缺陷神经元中TORC1活性降低可能是观察到的自噬增加的原因。为了测试TORC1功能，我们检测了TORC1底物pSer的磷酸化³⁸⁹第70页^S6K系列我们发现JNK缺乏不会改变神经元中TORC1底物的磷酸化（补充图S12）。这些数据表明，JNK缺乏通过TORC1依赖机制调节自噬。

JNK缺陷神经元自噬增加由FoxO1/Bnip3/Beclin-1途径介导

神经元中JNK缺陷触发自噬反应的发现(图3)这是意料之外的，因为对非神经元细胞的研究表明JNK参与了自噬的诱导(Yu等人，2004年;Ogata等人，2006年;Wei等人，2008年)或作为自噬相关细胞死亡的效应器(Yu等人，2004年;清水等，2010年). 事实上，我们发现，在缺乏JNK表达的复合突变体成纤维细胞中，血清撤除引起的自噬受到损害（补充图S13）。这一发现与神经元中化合物JNK缺乏诱导自发自噬的作用形成了显著对比(图3). 这些数据表明，JNK在自噬抑制中的作用可能仅限于神经元。

为了测试自噬介质Beclin-1是否与JNK缺陷引起的神经元自噬相关，我们检测了RNAi介导的Beclin-1表达下调的作用。敲除Beclin-1抑制JNK自噬生化标记^TKO公司神经元，包括LC3b-II增加和p62/SQSTM1降低(图4). 这些数据表明，Beclin-1可能介导JNK缺乏的影响，导致神经元自噬增加。

已经证实，Bcl2与Beclin-1的BH3结构域的JNK调节的相互作用可能有助于自噬(Wei等人，2008年). 因此，我们检测了神经元中Beclin-1与Bcl2家族蛋白的相互作用。在对照神经元中未检测到Beclin-1与Bcl2的共免疫沉淀。然而，在对照神经元中发现Beclin-1与Bcl-XL共免疫沉淀，但在JNK中这种相互作用被显著抑制^TKO公司神经元(图3B). Bcl-XL的BH3结构域结合活性受血清Bcl-WL磷酸化的负调控⁶²(Upreti等人，2008年)，但在JNK中未检测到Bcl-XL磷酸化增加^TKO公司神经元用磷酸特异性抗体进行免疫印迹分析（数据未显示）。因此，另一种机制必须调节Beclin-1的解离。Bcl-XL复合物中Beclin-1的释放可以通过与另一BH3结构域蛋白的竞争来介导。事实上，我们发现JNK^TKO公司神经元表达的Bnip3数量增加，这是Bcl2蛋白家族中仅有BH3的一个成员(图3B). 免疫共沉淀分析表明，从Bcl-XL复合物中释放Beclin-1与Bnip3的相互作用增加有关(图3B).

这个Bnip3号机组已知该基因是FoxO转录因子的靶点，该转录因子也能增加自噬相关基因的表达附件8/Lc3b和附件12(2008年萨利赫和布鲁内特). 这些基因在JNK中的表达增加^TKO公司神经元(图3A、B、D、E)表明JNK缺乏导致FoxO激活。事实上，基因表达分析显示福克斯O1JNK中mRNA和蛋白的表达^TKO公司神经元(图3C-E). 测试FoxO1是否有助于JNK中检测到的自噬增加^TKO公司我们检测了RNAi介导的FoxO1基因敲除对神经元的影响。击倒JNK中的FoxO1^TKO公司神经元导致Bnip3型和Atg公司基因，抑制LC3b-II的增加和p62/SQSTM1的减少，并导致神经元存活率下降(图5). 这些数据表明，FoxO1是JNK增加自噬和存活所必需的^TKO公司神经元。

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图5。

RNAi介导的FoxO1基因敲除对JNK自噬和存活的影响^TKO公司神经元。(A类,B类)野生型（控制）和Jnk1号机组^{LoxP/LoxP公司} Jnk2号机组^−/− Jnk3号机组^−/−（JNK公司^TKO公司)感染神经元广告-核心在3 DIV时，在7 DIV时转染福克斯O1siRNA或对照siRNA福克斯O1信使核糖核酸(A类)和Bnip3号机组信使核糖核酸(B类)在11 DIV时通过定量RT-PCR分析mRNA进行检测，并将其归一化为Gapdh公司每个样本中的mRNA（平均值±SD；n个= 3). 显示了统计上的显著差异。(*)P（P）< 0.05. (C类)控制和JNK^TKO公司用扰乱序列或福克斯O1用LC3b、p62/SQSTM1和α-Tubulin抗体在11 DIV下通过免疫印迹分析检测siRNA。(D类)RNAi转染的JNK^特科在11 DIV时通过定量RT-PCR分析神经元附件3,附件5、和附件12mRNA和归一化为Gapdh公司每个样本中的mRNA（平均值±SD；n个= 3). 显示了统计学上的显著差异。(*)P（P）< 0.05. (E类)RNAi转染对照和JNK的存活率^TKO公司对11 DIV时的神经元进行定量（平均值±SD；n个= 20). 显示了统计上的显著差异。(*)P（P）< 0.05.

细胞质隔离是包括AKT在内的信号转导途径调节FoxO1的主要机制(2008年萨利赫和布鲁内特). 我们发现Thr的AKT磷酸化略有增加³⁰⁸和Ser⁴⁷³JNK中^TKO公司神经元(图3C)表明JNK中AKT活性可能适度增加^TKO公司神经元与对照神经元进行比较。然而，我们发现在JNK中FoxO1的核定位增加^TKO公司神经元与对照神经元的比较(图3F). JNK中FoxO1的核重分布^TKO公司神经元与血清FoxO1磷酸化增加有关²⁴⁶(图3C)，一个主要诱导FoxO1核积累的位点，并被细胞周期依赖性蛋白激酶（CDKs）磷酸化(袁等人，2008). 神经退行性变过程中观察到流产细胞周期的重新进入(Kim和Bonni 2008)，包括冲程(Kuan等人，2004年). 事实上，我们发现CDK2在JNK中被激活^TKO公司神经元与对照神经元的比较(图3C). 测试CDK活性增加是否有助于JNK的表型^TKO公司我们检测了CDK抑制对对照和JNK的影响^特科神经元。我们发现CDK抑制抑制了Bnip3号机组和福克斯O1在JNK中检测到表达^TKO公司神经元(图6A). 此外，CDK抑制抑制了LC3b II的自噬相关增加、p62/SQSTM1的减少和JNK的存活^TKO公司神经元与对照神经元的比较(图6B-E). 这些数据证实了CDK活性在JNK缺陷神经元FoxO1/Bnip3/Beclin-1通路诱导自噬和存活中的作用。

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图6。

JNK的生存能力需要CDK活性^TKO公司神经元。(A类,B类)野生型（控制）和Jnk1号机组^{飞行/飞行} Jnk2号机组^−/− Jnk3号机组^−/−（JNK公司^TKO公司)感染神经元广告-核心在3 DIV时，在不使用或使用CDK抑制剂罗西维汀（5μM；我CDK），10 DIV(A类)在11 DIV.Bar，45μm的条件下，用相控显微镜检查神经元。(B类)11 DIV时检测存活神经元的数量（平均值±SD；n个= 20). 显示了统计上的显著差异。(*)P（P）< 0.05. (C类)控制和JNK^TKO公司用洛索维汀治疗10DIV后检测神经元(国际CDK)使用LC3b、p62SQTM1和α-管蛋白抗体进行免疫印迹分析8小时。(D类)控制和JNK^特科用罗斯科汀治疗后用免疫荧光分析检测神经元(国际CDK)使用LC3b抗体持续8小时。DNA用DAPI染色。棒材，20μm。(E类)控制和JNK^TKO公司用罗斯科汀治疗后检查神经元(iCDK公司)通过定量RT-PCR分析8小时福克斯O1和Bnip3号机组mRNA和归一化为Gapdh公司每个样本中的mRNA（平均值±SD；n个= 3). 显示了统计上的显著差异。(*)P（P）< 0.05.

体内神经元复合JNK缺乏小鼠

我们测试了转基因表达Cre公司floxed小鼠脑内重组酶的研究Jnk公司体内神经元功能研究。初步研究使用雀巢Cre小鼠证明神经祖细胞中的三重JNK缺陷导致早期胚胎死亡（数据未显示）。类似地Cre公司使用福克斯1-Cre转基因小鼠也会导致早期胚胎死亡（数据未显示）。这些JNK的早逝^TKO公司小鼠排除了三重JNK缺乏症对大脑影响的分析。因此，我们检查了Cre公司表达于对小鼠生存无必要的神经元子集中。一只老鼠Cre公司插入重组酶第二部分基因表达Cre公司小脑浦肯野细胞中的重组酶(Barski等人，2000年). 这个Pcp2-Cre公司菌株能够产生JNK1、JNK2和JNK3三种神经元缺陷的存活小鼠(图7). 浦肯野细胞缺陷是小脑共济失调的一个原因(Grusser-Cornehls和Baurle，2001年)，但在检测到复合JNK缺陷Purkinje细胞的小鼠中未检测到共济失调(图7,​,8).8). 这一观察表明，Purkinje细胞可以在没有JNK信号通路的情况下发挥功能。

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图7。

体内神经元JNK复合缺乏。青年（8周龄）Pcp2-Cre公司小鼠（对照）和Pcp2-Cre Jnk1号机组^{LoxP/LoxP公司}Jnk2号机组^−/− Jnk3号机组^−/−小鼠（JNK^TKO公司)那辆快车Cre公司对小脑浦肯野细胞中的重组酶进行了选择性检测。(A类)Purkinje细胞对照层和JNK的切片^TKO公司用JNK1/2抗体对小鼠进行免疫组织化学染色。棒材，100μm。(B类)小脑DNA通过PCR分析检测Jnk1号机组⁺（1550个基点），Jnk1号机组^LoxP公司（1095个基点），Jnk1号机组^Δ（395个基点），Jnk2号机组⁺（400亿桶），Jnk2号机组⁻（270bp），Jnk3号机组⁺（430 bp），以及Jnk3号机组⁻（250-bp）等位基因。(C类)对照组和JNK的Purkinje细胞层和DCN切片^TKO公司用Calbindin D-28k抗体对小鼠进行免疫荧光染色。棒，40μm。(D类)控制和JNK的DCN序列段^TKO公司小鼠通过H&E染色和通过Calbindin D-28k和GFAP的免疫组织化学染色抗体进行检查。棒材，100μm。(E类)对照组DCN和JNK的有髓轴突^TKO公司用透射电镜观察小鼠。酒吧：顶部面板，2μm；底部面板0.125μm。(F类)对照组和JNK有髓轴突的轴突面积、自噬体和线粒体的数量和面积^TKO公司对小鼠进行测量。数据以每组三只不同小鼠20个轴突的平均±SEM表示。控制和JNK之间的统计显著差异^TKO公司指示小鼠。(*)P（P）< 0.05.

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图8。

Purkinje细胞中复合JNK缺乏导致自噬增加。青年（8周龄）Pcp2-Cre公司小鼠（对照）和Pcp2-Cre Jnk1号机组^{LoxP/LoxP公司}Jnk2号机组^−/− Jnk3号机组^−/−小鼠（JNK^TKO公司)那辆快车Cre公司对小脑浦肯野细胞中的重组酶进行了选择性检测。(A类)Purkinje细胞层切片Pcp2乘员小鼠（对照）和Pcp2-Cre Jnk1号机组^{LoxP/LoxP公司}Jnk2号机组^−/− Jnk3号机组^−/−小鼠（JNK^TKO公司)用pSer抗体进行免疫组织化学染色²⁴⁶-FoxO1和p62/SQSTM1。棒材，100μm。(B类)Purkinje细胞对照层和JNK的切片^TKO公司用抗体（Bnip3、LC3b、Atg12和Calbidin-D28k）对小鼠进行染色，并用荧光显微镜进行检查。棒材，20μm。(C类)控制和JNK的DCN部分^TKO公司用抗体（Calbindin D-28k和LC3b）对小鼠进行染色，并用荧光显微镜进行检查。棒材，10μm。

免疫细胞化学分析显示小脑浦肯野细胞层JNK蛋白丢失(图7A)，小脑DNA的基因型分析导致识别出Jnk1号机组,Jnk2号机组、和Jnk3号机组(图7B). JNK公司^TKO公司Purkinje细胞的树突状树枝化减少（补充图S14）。使用Calbindin D-28k抗体的免疫荧光分析表明小脑深核（DCN）中存在肥大的浦肯野细胞轴突(图7C). 这些肥大的轴突也在JNK的切片中发现^TKO公司DCN用H&E染色(图7D)用Calbindin D-28k抗体进行免疫组织化学染色(图7D)，并使用高尔基试剂进行染色（补充图S14）。GFAP抗体染色显示轴突肥大与反应性胶质增生有关(图7D). 电子显微镜证实JNK DCN中有髓Purkinje细胞轴突肥大^特科老鼠(图7E; 补充图S15）。定量图像分析显示，JNK的DCN中Purkinje细胞轴突的横截面积显著增大^TKO公司小鼠与对照小鼠的比较(图7F). JNK中检测到轴突线粒体减少，自噬体数量增加^TKO公司小鼠与对照小鼠的比较(图7F). 相反，JNK中自噬体和线粒体的大小均增加^TKO公司小鼠与对照小鼠的比较(图7F).

JNK信号通路抑制神经元自噬

对非神经元细胞的研究表明，当细胞受到应激时，JNK从低基础状态显著激活(戴维斯2000). 然而，JNK在神经元中的调节非常不同。JNK1在基础条件下保持组成性激活，而JNK2和JNK3表现出较低的基础活性，并且具有应激反应性(Coffey等人，2000年,2002). 据报道，JNK在非神经元细胞中的自噬前作用由JNK1介导(Wei等人，2008年). 因此，有趣的是，JNK1在神经元中被组成性激活。基于非神经元细胞的研究(Wei等人，2008年)神经元JNK1的组成性激活应引起自噬。因此，必须存在一种机制来防止神经元中组成性激活的JNK1激活自噬。尽管其机制尚不清楚，但这些考虑表明，神经元对非神经元细胞中发现的自噬前JNK1信号通路是难治的(Wei等人，2008年).

我们对复合JNK缺陷神经元的分析表明，JNK调节神经元自噬。与JNK非神经元细胞的促自噬作用相反，神经元JNK抑制自噬。神经元JNK功能的丧失导致转录程序的参与，导致自噬相关基因的表达增加和自噬反应的诱导(图3). JNK缺乏引起的自噬诱导的一个结果是提高了神经元存活率(图2; 补充图S3）。

JNK可以作为调节FoxO诱导的自噬和凋亡的分子开关

FoxO转录因子参与诱导细胞死亡（凋亡）和细胞存活（自噬）反应(Salih和Brunet 2008). 本研究的结果确定JNK是一种信号分子，可能有助于协调这些对FoxO转录因子激活的不同反应。

神经元中FoxO的激活导致靶基因的表达比姆，一种促凋亡的BH3-only蛋白，并导致细胞死亡(Gilley等人，2003年). 神经元中JNK激活促进比姆，很可能是因为需要JNK-dependent AP-1活动比姆表达式(Whitfield等人，2001年). 此外，JNK在激活位点磷酸化Bim(Hubner等人，2008)，并导致Bim从抗凋亡Bcl2家族蛋白Mcl-1复合物中释放(Morel等人，2009年). 这些过程共同启动JNK依赖性凋亡。因此，抑制JNK可以防止神经细胞死亡。事实上，JNK小分子抑制剂在神经退行性疾病模型中可引起神经保护(Borsello等人，2003年;Hirt等人，2004年;Repici等人，2007年;Carboni等人，2008年;Esneault等人，2008年;Wiegler等人，2008年;Probst等人，2011年).

FoxO转录因子的激活也会导致自噬相关基因的表达增加，包括附件8/Lc3b,附件12、和Bnip3号机组(2008年萨利赫和布鲁内特). 而JNK与FoxO合作增加促凋亡比姆表达式(Whitfield等人，2001年)，JNK缺乏导致比姆表达式(图3E)并促进由自噬相关靶基因的FoxO依赖性表达增加介导的生存反应附件8/Lc3b,附件12、和Bnip3号机组(图3E,5B–D段). 事实上，抑制JNK缺陷神经元的自噬会导致快速死亡(图2C,​，4C）。4摄氏度). 这种神经元存活反应与中风模型有关，在中风模型中，神经元死亡由JNK依赖机制介导(Kuan等人，2003年;Pirianov等人，2007年).

总之，这些数据表明FoxO和JNK信号通路之间的串扰会导致神经元死亡。相反，JNK的丢失通过增加自噬促进FoxO诱导的存活。因此，JNK作为一个分子开关，定义了FoxO在神经元中激活的生理后果。

基因型分析

使用引物通过PCR分析检测基因组DNA，以确定野生型和Jnk1号机组⁻(Dong等人，1998年),Jnk1号机组^LoxP公司(Das等人，2007年),Jnk1号机组^Δ(Das等人，2007年),Jnk2号机组⁻(Yang等人，1998年),Jnk2号机组^M108G(Jaeschke等人，2006年),Jnk3号机组⁻(Yang等人，1997年)、和Cre公司⁺(Das等人，2007年)等位基因。

组织培养

野生型和Jnk1号机组^−/−Jnk2号机组^−/−中小企业基金(Tournier等人，2000年)在添加10%胎牛血清（Invitrogen）的Dulbecco改良Eagle's培养基中培养。从出生后第6天的小鼠中制备CGN的原代培养物(Kennedy等人，2007年). 用含有B27补充剂、1%谷氨酰胺、1%青霉素/链霉素、25 mM葡萄糖和25 mM KCl的神经基础培养基体外培养CGN 2 d；接种在聚-D-赖氨酸/层粘连蛋白涂层的室载玻片（Becton Dickenson）或培养皿（MatTek）中；然后每天感染腺病毒核心（Ad5CMVCre；～100多重感染）（基因转移载体核心，爱荷华州大学），持续3天。使用PepMute siRNA转染试剂（SignaGen实验室）和20 nM siRNA进行RNAi转染研究(｛“type”：“entrez核苷酸”，“attrs”：｛“text”：“NM_019584”，“term_id”：“1331036877”，“term_text”：“NM_019584”｝NM_019584号或{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_019739”，“term_id”：“239985491”，“term_text”：“NM_019739“}}NM_019739号Dharmacon RNA Technologies）在体内培养第7天（DIV）和第8天再次培养。一些培养物用1μM 1-萘甲基-4-氨基-1处理-第三种-丁基-3-(第页-甲基苯基）吡唑并[3,4-d日]嘧啶（1NM-PP1；钙生物化学）、1μM氯喹（Sigma）或5μM罗西汀（LC实验室）。神经元也用钙黄绿素-氨基酯（Calbiochem）染色，并用Leica SP2仪器通过共焦荧光显微镜成像(Kennedy等人，2007年).

RNA分析

使用7500 Fast Real-Time PCR机器（Applied Biosystems）通过定量PCR分析检测mRNA的表达。TaqMan分析用于定量附件3（Mm00471287_m1），附件5（Mm00504340_m1），附件7（Mm00512209_m1），附件8/Lc3b（Mm00782868_m1），附件12（Mm00503201_m1），贝克林-1（Mm01265461_m1），比姆（Mm01975020_s1），Bnip3号机组（Mm01275601_g1），福克斯O1（Mm00490672_M1），Gapdh公司（4352339E），基夫3a（Mm00492876_m1），基夫5a（00515258_m1），基夫5b（Mm00515276_m1），以及基夫5c（Mm00515265_m1）（应用生物系统）。相对mRNA表达通过测量Gapdh公司使用TaqMan测定法（Applied Biosystems）测定每个样品中的mRNA。

免疫印迹分析

使用Triton裂解缓冲液（20 mM Tris，pH 7.4，1%Triton X-100，10%甘油，137 mM NaCl，2 mM EDTA，25 mMβ-甘油磷酸，1 mM原钒酸钠，1 mM-苯甲基磺酰基氟化物，10μg/mL抑肽酶和亮氨酸蛋白酶）制备细胞提取物。通过检测LC3b（Novus Biologicals）抗体，通过蛋白质免疫印迹分析检测提取物（20–50μg蛋白质）；第62页/SQSTM1；CDK-2（圣克鲁斯生物技术）；AKT，pSer公司³⁰⁸-AKT、pSer⁴⁷³-AKT、Beclin-1和Bcl-XL；pThr基因³⁸⁹-S6K和S6K（细胞信号）；JNK1/2（BD Biosciences Pharmingen）；磷酸化神经丝H（SMI-31R，Covance）；磷酸-胺、Bnip3和FoxO1（Abcam）；和α-管蛋白（西格玛）。pSer抗体²⁴⁶-FoxO1由Azad Bonni博士提供(袁等人，2008). 免疫复合物通过增强化学发光（NEN）检测。免疫沉淀物的免疫印迹分析使用一步法完全免疫沉淀素-西部试剂盒（Genescript Corp.）进行。

蛋白激酶分析

使用Rb-C融合蛋白（细胞信号传递）作为底物，在体外激酶分析中测量CDK2活性，并使用荧光成像仪（分子动力学）定量。

免疫荧光分析

通过在室温下与4%多聚甲醛孵育1h固定初级CGN，并在−20°C下与含有5%乙酸的90%甲醇孵育5min使其渗透。然后在室温下用1%脱脂牛奶在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中封闭载玻片1小时，并用抗磷酸盐-Ser抗体孵育⁶³-cJun（细胞信号传导）、脱酪氨酸Tubulin、突触体素和Tau（Chemicon）；Ankyrin G和Lamp-1（圣克鲁斯生物技术）；Snap25和FoxO1（Abcam）；LC3b（Novus Biologicals）；以及添加1%脱脂奶的PBS中的βIII-Tubulin（Covance），在4°C下过夜。二级抗体与Alexa Fluor 488或546（分子探针）在室温下结合1小时。用100 nM MitoTracker Red（分子探针）在37°C下加载CGN 15分钟。所有冲洗过的载玻片均用VectaShield固定介质和DAPI（Vector Laboratories）固定，并用徕卡SP2激光扫描共聚焦荧光显微镜进行检查。

时间荧光显微镜

CGN在体外培养12天，置于聚-d-赖氨酸/层粘连蛋白涂层的35-mm玻璃底微孔培养皿（MatTek）中，并与100 nM MitoTracker Green（分子探针）孵育3分钟。使用尼康TE2000-E2显微镜和横河CSU10b旋转盘共焦扫描头以及定制激光发射、声光可调谐滤光片（NEOS）和中继光学（Solamere Technology Group）对CGN细胞进行了时间荧光显微镜观察。使用尼康60×Plan Apo油物镜（NA=1.4）和QImaging Rolera MGi相机，使用具有电子倍增增益的数字化仪获得多波长共焦Z系列。变形软件控制显微镜硬件和图像采集。每3秒收集一次帧，曝光时间为100毫秒。

电子显微镜

细胞和组织在室温下用1.25%戊二醛固定30分钟，在4°C下用2.5%戊二醛在二甲氨基甲酸盐缓冲液中固定14小时。然后用1%（w/v）四氧化锇将细胞固定在PBS中，脱水，并嵌入Lx 112/Araldite 502环氧树脂中。超薄切片按顺序安装在铜支撑格栅上，与柠檬酸铅和醋酸铀酰进行对比，并在Philips CM 10透射电子显微镜上进行检查(Gangwani等人，2005年). 使用AxioVision 4.5版（蔡司）程序通过图像分析对电子显微照片进行定量。

组织切片的免疫组织化学和免疫荧光分析

使用添加4%（w/v）多聚甲醛的PBS对小鼠进行灌注固定。处理固定组织（4°C下24小时）并将其埋入石蜡中，制备4μm切片。这些切片用JNK1/2（BD Biosciences Pharmingen）、p62/SQSTM1（Abnova）或pSer的抗体染色²⁴⁶-FOXO1系列(袁等人，2008)使用间接免疫过氧化物酶检测(Xu等人，1998年). 切片也在石蜡清除后用抗原揭膜液（Vector Laboratories）和微波照射进行抗原回收，并进行免疫荧光染色。随后用0.4%Triton X-100、10%山羊血清、150 mM NaCl和10 mM Tris-HCl（pH 7.4）封闭切片。将切片与Calbindin D-28k（Sigma）、Bnip3和Atg12（细胞信号）或LC3b（Novus Biologicals）抗体在4°C下孵育12小时并清洗。免疫复合物通过与Alexa Fluor 488或546（分子探针）结合的二级抗体在25°C下孵育1小时来检测。用DAPI（Vector Laboratories）对载玻片进行清洗并用VectaShield固定介质固定，然后用Leica SP2激光扫描共聚焦荧光显微镜进行检查。使用快速高尔基染色试剂盒（FD NeuroTechnologies）处理小脑冰冻切片（100μm）。

我们感谢阿扎德·博尼提供pSer²⁴⁶-FoxO1抗体；Tammy Barrett、Vicky Benoit和Jian Hua Liu提供专家技术援助；和凯西·杰姆寻求行政协助。这些研究得到了美国国立卫生研究院（NS054948）的资助。这些研究使用的马萨诸塞大学核心设施由NIDDK糖尿病和内分泌研究中心（DK32520）提供支持。R.J.D.是霍华德·休斯医学研究所的研究员。