p73调节神经干细胞的维持

2.2. 神经层培养

神经干细胞在妊娠第E14天从小鼠中获得。简单地说，对皮层进行解剖和研磨，直到获得单细胞悬浮液。细胞计数并在2×10处进行电镀⁶细胞/10毫升/25厘米²按照制造商的说明，在NeuroCult®NSC基础培养基（小鼠）中的烧瓶中加入增殖补充剂和rh-EGF（10ng/ml）（均购自StemCells Technologies），这被认为是第0代。允许神经球形成7天。神经球每5天传代一次。第1代神经球用NeuroCult®化学分离试剂盒（StemCells Technologies）分离，并以克隆密度（20×10^三24孔板中的细胞/ml），并监测新神经球的再生。在指定的时间，分析神经球的数量和大小以及细胞总数。为了分化NSC，单细胞悬液（5×10⁵细胞/孔/24孔板）电镀在聚-我-NeuroCult®NSC基础培养基（小鼠）中的鸟氨酸玻璃盖玻片，含分化补充剂。

2.3. RNA提取和实时PCR

根据制造商的说明，使用Trizol（Invitrogen）从细胞中分离出总RNA。RNA样品用无RNase DNase I（Sigma）处理。使用Superscript III逆转录酶和寡核苷酸（dT）引物（Invitrogen）逆转录总RNA。用SYBR绿色预混料（Applied Biosystem）和特异性引物TAp73 Fwd 5′-GCACCTACTTGACCTCCC-3′和Rev 5′-GACTCTGAGCAATTGAAACC-3′在ABI PRISM 7000序列检测系统（AppliedBiosystema）中进行qRT-PCR；ΔNp73 Fwd 5′-ATGCTTACGTGGACCC-3′和Rev 5′-GCACTGCTGAGCAATTGAAAC-3′；p53 Fwd 5′-CTCTCCCCGCAAAAGAAAA-3′和Rev 5′-CGGAACATCTCGAGGTTA-3′；GAPDH Fwd 5′-CAATGAATACGTCTAGAGCAAC-3′和Rev 5′-AGGAGATGCTCAGTGTGG-3′；Sox-2适用于5′-TCCAAAAACTAACAACACATCG-3′和修订版5′-GAAGTGCAATGGAGAAAA-3′；Hes-1适用于5′-ACACCGGACAAACCAAAAGAC-3′和版本5′-CGCCTCTCCATGAGG-3′；Hes-5适用于5′-GATGCTCAGTCCCAAGAGA-3′和版本5′-AGCTTCAGCTCTATG-3′；Nanog用于5′-CACCCACCATGCTAGTCT-3′和版本5′-ACCCCAACTCCTGGTCCT-3′；缺口1适用于5′-ACTATCTCGGCGGCTTTC-3′和版本5′-GGCACTCGTTGATCTCCTCT-3′。

每个基因的表达都是从阈值周期定义的(C类_t吨)，并使用2计算相对表达水平^{-ΔΔC类_t吨}方法参照家政基因GAPDH的表达进行归一化。

2.4. 免疫荧光

E17.5和P7大脑固定在4%多聚甲醛中，并包埋在石蜡中。冠状切片被脱蜡，在分级酒精中重新水化，并在蒸馏水中冲洗。将切片封闭在0.1%PBS–吐温（vol/vol）中的10%山羊血清中，然后在封闭缓冲液中与一级和二级抗体孵育。细胞核用Hoechst 33342（Sigma）染色并安装共焦分析。对每个切片拍摄两张不同的图像，并计算标记的细胞数量(n个=2 p73−/−与n个=2名对照室友）。使用以下主要抗体：巢蛋白（小鼠，1/50，密理博）、GFAP（兔子，1/500，达科）。

3.2. p73缺乏的NSC显示增殖减少

接下来，利用神经球分析，我们关注p73是否是胚胎NSC增殖和自我更新所必需的。在培养7天后，来自WT和p73−/−小鼠的NSC都形成了神经球，但来自p73−的NSC在形态学上较小(图2A） 在DIV 4和DIV 7，p73−/−神经球的平均直径均显著小于WT小鼠(图2B） ●●●●。此外，如所示图2C、 p73−/−神经球倾向于在较小的尺寸范围内积聚。这些数据表明，p73是神经球最佳增殖所必需的。

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图2

p73缺乏的NSC显示增殖减少。（A） E14.5神经球来源于野生型和p73−/−小鼠。显示了NSC的代表性图片（每个基因分型有两个不同的字段）。（B） p73+/+和p73−/-小鼠的NSC直径分别为DIV 4和7。（C） 7级NSC的尺寸分布。p73−/−NSC在较低范围内累积。数据表示三个不同实验的平均值±SD。

3.3. p73−/−缺失会损害NSC自我更新相关基因的表达

接下来，我们研究了p73−/−衍生神经球表型改变的分子机制。涉及Sox基因的途径[17]和槽口[18]家庭与NSC的扩散/自我更新有关。因此，我们从WT和p73−/−小鼠的DIV 7神经球中分离出RNA，并通过qPCR分析这些家族候选基因的表达。如所示图3p73的缺失导致Sox-2、Notch-1和Nanog表达显著降低，表明p73直接或间接调节这些因子。事实上，Sox-2−/−小鼠具有与p73−/−小鼠相似的表型，具有中度侧脑室增大和后腹外侧皮质减少。此外，在海马体中，齿状回基本上不存在[19].

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图3

p73缺失会损害NSC自我更新相关基因的表达。DIV 7时p73−/−小鼠神经球中指示基因的相对表达。数据归一化为看家基因Gapdh，并与它们在p73+/+NSC中的表达相关。数据表示三个不同实验的平均值±SD。

这项工作得到了英国医学研究委员会的支持；EU EPISTEM（LSHB-CT-019067）、“癌症控制过敏原”（ACC12）、MIUR/PRIN（RBIP06LCA9_0023）、AIRC（2008-2010_33-08）、ISS“意大利-美国计划”N526D5、意大利人类蛋白质组网RBRN07BMCT_007和Telethon（GGPO4110）向G.M.提供的资助。；美国国立卫生研究院（R01-GM57587、R37-CA76584和R21-CA125173）和多发性骨髓瘤研究基金会对本文所述M.P.研究的资助也得到了菲利普·莫里斯美国公司（Philip Morris USA Inc.）和菲利普·莫里斯国际（Philips Morris International）对G.M.的部分支持。