细胞周期。2010年8月15日；9(16): 3328–3336.
p53依赖性细胞凋亡的缺失导致紫外线辐射超敏反应、免疫抑制增强和细胞衰老
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1,2 奥米德·塔瓦纳
1免疫学系；德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心；美国德克萨斯州休斯顿
2休斯顿生物医学科学研究生院；美国德克萨斯州休斯顿
卡拉·本杰明
三医学部；血液学/肿瘤科；迈阿密大学；西尔维斯特癌症中心；美国佛罗里达州迈阿密
纳胡姆·普埃布拉-奥索里奥
1免疫学系；德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心；美国德克萨斯州休斯顿
梅桑
1免疫学系；德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心；美国德克萨斯州休斯顿
斯蒂芬·厄尔里奇
1免疫学系；德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心；美国德克萨斯州休斯顿
2休斯顿生物医学科学研究生院；美国德克萨斯州休斯顿
Honnavara N Ananthaswamy公司
1免疫学系；德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心；美国德克萨斯州休斯顿
朱成明
1免疫学系；德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心；美国德克萨斯州休斯顿
2休斯顿生物医学科学研究生院；美国德克萨斯州休斯顿
1免疫学系；德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心；美国德克萨斯州休斯顿
2休斯顿生物医学科学研究生院；美国德克萨斯州休斯敦
三医学部；血液/肿瘤科；迈阿密大学；西尔维斯特癌症中心；美国佛罗里达州迈阿密
通讯作者。 #贡献均等。
2010年4月21日收到；2010年6月13日修订；2010年6月16日接受。
- 补充资料
补充材料
GUID:8031E0B6-AF77-40AE-8C81-A3A6A4B21A
摘要
基因毒性应激触发p53肿瘤抑制网络，激活细胞反应，导致细胞周期阻滞、DNA修复、凋亡或衰老。该网络主要通过不同下游靶点的反式激活发挥作用，包括细胞周期抑制剂p21（短期细胞周期阻滞或长期细胞衰老所需），或促凋亡基因，如p53上调凋亡调节剂（PUMA）和Noxa。然而，从细胞周期阻滞到细胞凋亡的机制尚不清楚。在这项研究中，我们发现携带低形态突变p53、R172P的小鼠比野生型小鼠更容易受到紫外线-B（UVB）诱导的皮肤损伤、炎症和免疫抑制。R172P突变可消除p53介导的细胞凋亡，同时保持细胞周期控制基本完整。第53页172P兰特胚胎成纤维细胞（MEFs）对UVB过敏，暴露于UVB后过早衰老，这与经历细胞凋亡的野生型MEFs形成鲜明对比。然而，这些突变细胞能够修复紫外线诱导的DNA损伤，表明紫外线超敏表型是由随后的损伤反应引起的。突变MEFs在UVR后诱导p53和p21，而野生型MEFs还诱导PUMA和Noxa。重要的是，p53172P兰特MEF未能下调抗凋亡蛋白Bcl-2，该蛋白在p53依赖性细胞凋亡中起重要作用。综上所述，这些数据表明，在没有p53介导的凋亡的情况下，细胞会经历细胞衰老，以防止基因组不稳定。我们的结果还表明p53依赖性凋亡可能在平衡细胞生长中发挥积极作用。
关键词：紫外线照射、p53、DNA损伤、DNA损伤反应、凋亡、衰老
引言
为了应对基因组DNA损伤，细胞激活了一个快速调节许多细胞活动的通路网络。DNA损伤反应途径的中心结果之一是肿瘤抑制因子p53的稳定和激活，这导致细胞周期阻滞和DNA修复、凋亡或细胞衰老。p53是一种转录因子。它激活许多不同的基因来诱导和调节不同的细胞功能网络，这些功能对于保护细胞免受基因组不稳定以及维持细胞生长和分化的内稳态至关重要。1,2最初的基因组损伤导致p53的稳定和核定位，在此可以快速激活短暂的细胞周期阻滞，从而在复制之前修复受损的DNA。在过度和不可修复的损伤后，p53可以进一步触发信号级联，通过转录不同的促凋亡基因，特别是p53预调节的凋亡调节剂（PUMA）和Noxa，诱导程序性细胞死亡三以及包括Bcl-2在内的抗凋亡基因的转表达。4细胞凋亡是一种保护细胞免受导致肿瘤发生的基因组不稳定性积累的直接机制。
DNA损伤也可能导致不可逆的细胞周期阻滞，称为细胞衰老。5——7在细胞周期检查点调节和诱导细胞衰老中发挥重要作用的一个关键p53靶点是细胞周期依赖性激酶抑制剂p21，它通常是反式激活的，并诱导G1通过抑制cyclinE/CDK2复合物来阻止DNA损伤。7,8细胞衰老可由多种不同的刺激诱导，包括端粒缩短（复制性衰老）、致癌信号（致癌诱导衰老）或独立于前两种信号的应激/DNA损伤（早衰）。9无论刺激如何，细胞衰老在防止基因组不稳定从而抑制肿瘤形成方面发挥着与细胞凋亡平行的功能。10DNA损伤后的细胞命运决定通过p53途径激活凋亡或细胞衰老，但触发因素仍不明确，包括不同的刺激和信号强度/持续性以及细胞类型特异性反应。11
大多数肿瘤发生的根本原因是DNA损伤，如果修复不准确或不当，会导致癌基因激活或失活，从而在缺乏生理刺激的情况下驱动细胞增殖和/或生存。12,13紫外线辐射（UVR）是一种直接损害基因组DNA的致癌物质。14,15过度暴露于紫外线辐射对我们的健康有潜在的危害，因为有证据表明，紫外线辐射与皮肤炎症、免疫抑制、基因突变、多种癌症和衰老等多种疾病有关。16——18抑癌基因p53在UVR引起的细胞反应和DNA损伤修复中起着重要作用。19,20先前的研究表明，在缺乏p53的一个或两个等位基因的情况下，小鼠对UVB诱导的肿瘤极为敏感，真皮中的细胞凋亡急剧减少。21,22最近的研究强调UVB是p53介导的细胞过早衰老的诱导剂23,24以及p53介导的凋亡。25为了在UVR后直接解读p53功能，我们使用了一种低形态、功能分离的p53点突变R172P，保留了部分细胞周期阻滞能力，但失去了p53介导的完全凋亡。26
在这项研究中，我们发现突变型p53小鼠，以下简称为p53市盈率，比野生型小鼠更容易受到紫外线诱导的皮肤损伤、炎症和免疫抑制。而在细胞水平上，p53市盈率小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）表现出紫外线超敏反应，不能激活促凋亡基因PUMA和Noxa，但保留上调p21的能力，最终导致细胞过早衰老和观察到的敏感性表型。相反，野生型MEFs经历凋亡，保留诱导这些促凋亡基因的能力，并以剂量依赖的方式死亡。总之，我们的研究表明了p53介导的细胞凋亡在体内的重要性，并表明在缺乏p53的情况下，细胞衰老作为一种失效安全机制被触发，以保护细胞免受基因组不稳定的影响，但这是有代价的。
结果
突变型p53172P兰特小鼠对UVB辐射过敏。
抑癌基因p53在细胞对紫外线辐射的反应中起着核心作用。20先前的研究表明，p53缺乏的小鼠暴露于慢性紫外线辐射下，皮肤肿瘤形成增加。19为了研究UVR对细胞的反应，UVR已知会导致皮肤红斑和炎症，我们将低形态p53突变小鼠（p53市盈率)并分析急性皮肤炎症反应。由于难以测量有色素皮肤的小鼠的红斑，因此我们通过测量4.5 kJ/m后的两倍皮肤厚度来确定皮肤的宏观炎症2UVB暴露。在UVB治疗后24小时和48小时，野生型小鼠的皮肤褶皱厚度比基线测量值增加了6%和27%，而p53市盈率小鼠的平均增长率分别为27%和74%。小鼠暴露于第二次剂量的UVB，并在第二次暴露24小时后进行测量。野生型皮肤从基线增加到33%，而p53对/对小鼠的体重显著增加，高达100%(). 紫外线照射下p53的皮肤皱褶肿胀差异P（P）/+小鼠与野生型小鼠的观察结果在统计学上无明显区别。为了进一步研究炎症反应，用苏木精和伊红对接受急性紫外线照射的小鼠的背部皮肤切片进行染色，结果表明紫外线照射不仅增加了表皮的厚度，还增加了真皮的厚度(). 这些数据表明p53市盈率小鼠对紫外线暴露过敏。
突变型p53市盈率小鼠对UVB辐射过敏。（A） 将小鼠剃毛并用4.5 kJ/m的剂量照射20和48小时，通过测量指定时间点背部皮肤的双皮褶厚度来确定皮肤肿胀。N=每组5个。数据为平均值±SEM，*表示与野生型相比p<0.05。（B） 指示时间点后辐射背部皮肤切片的代表性H&E复染。放大倍率，20倍。（C） UVB诱导的DTH抑制。用UVB治疗小鼠，然后用白色念珠菌10天后测量Hind脚垫，然后用念珠菌抗原注射攻击。DTH在激发24小时后通过足垫肿胀进行测量。在未免疫但受到攻击的小鼠中测量阴性对照。阳性对照组为未经辐射但经免疫和激发的小鼠。每组N>5。数据为平均值±SEM，*表示与野生型相比p<0.005。
小鼠p53纯合子172P兰特更容易受到UVR诱导的免疫抑制。
众所周知，紫外线辐射会导致全身免疫抑制，这与皮肤癌发病风险增加有关。27,28先前的研究表明，紫外线诱导的DNA损伤会引发野生型小鼠的免疫抑制。22,29确定p53是否市盈率紫外线照射后小鼠的免疫状态存在差异，我们比较了不同基因型UVB诱导的免疫抑制程度。小鼠暴露于UVB，然后用白色念珠菌5天后。如前所述，抑制延迟型超敏反应（DTH），30用于测量免疫状态。结果表明野生型和p53市盈率未经辐照的小鼠能够产生有效的DTH反应(). 有趣的是，p53对/对相对较低的紫外线剂量（0.5和2.5 kJ/m）对紫外线辐射的免疫抑制作用更敏感2（p<0.005；p53）市盈率与p53相比+/+). 5 kJ/m时2诱导野生型小鼠免疫抑制，p53市盈率小鼠的免疫抑制显著增强（p<0.005）。在最高剂量（10 kJ/m）时，未观察到明显的抑制差异2). 这些结果表明p53的敏感性增加市盈率小鼠对紫外线诱导的免疫抑制与它们对紫外线的超敏反应平行。
紫外线照射诱导p53-p21驱动的p53皮肤细胞衰老172P兰特老鼠。
紫外线照射诱导野生型小鼠皮肤p53依赖性凋亡。25确定紫外线是否也能诱导p53细胞凋亡市盈率小鼠，我们进行了TUNEL分析。在紫外线照射的野生型样品中检测到凋亡细胞，接受5和10 kJ/m的紫外线照射2UVB的(图S1)而p53几乎没有检测到凋亡市盈率和未辐照野生型样品。相反，暴露于10Gy电离辐射后，野生型皮肤中出现轻微的细胞凋亡，而p53中的皮肤切片中没有这种细胞凋亡市盈率老鼠。这证实了p53的凋亡缺陷表型市盈率为了确定紫外线照射后是否出现其他细胞反应，我们在紫外线照射后24和72小时对皮肤切片进行了β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色，这是一种指示细胞衰老的标记。如所示和S2系列，在p53的毛囊中特异性地观察到衰老细胞市盈率小鼠10 kJ/m后24小时2紫外线治疗；紫外线照射72小时后，这些细胞的数量显著增加。然而，在p53的皮肤切片中观察到低水平的衰老P（P）/+野生型小鼠即使在暴露于电离辐射（IR）后也不存在。这些结果表明，在没有细胞凋亡的情况下，p53市盈率皮肤细胞因紫外线损伤而衰老。为了确定皮肤中的这些反应是否依赖于p53和下游靶点p21的表达，我们使用免疫荧光染色。有趣的是，紫外线照射p53的皮肤切片市盈率小鼠的p53和p21蛋白水平增加，而野生型小鼠的p32和p21表达水平略有增加(). 我们的结果表明，UVB暴露在野生型和突变型小鼠中均可诱导p53和p21，但突变皮肤经历衰老而非凋亡，这可能是由于突变型p53和核p21的高水平，与细胞周期抑制活性相关。
诱导p53/p21诱导p53细胞衰老172P兰特UVB后的皮肤。（A） p53代表性皮肤切片市盈率，p53P（P）/+和p53+/+小鼠在5 kJ/m后24小时和72小时2UVB，（顶部和中间面板），或10 Gy IR后72小时（底部面板）。所有样品均用SA-β-gal染色，然后进行H&E复染。放大倍率，20倍。（B） p53皮肤切片的代表性免疫荧光染色市盈率和p53+/+老鼠；p53（绿色）和p21（红色）。放大40倍。
第53页172P兰特MEF对UVR特别敏感，但对IR不敏感。
测定p53的敏感性市盈率细胞接受UVB治疗，我们暴露早期传代p53对/对不同UVB剂量的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）比较野生型和p53的细胞存活率−/−MEF公司。如所示UVB剂量为50、100和250 J/m2对野生型细胞具有细胞毒性（存活率分别约为75%、55%和20%），但对p53没有细胞毒性−/−MEF公司。然而，p53的存活率对/对与野生型和p53相比，MEF显著减少−/−，在100 J/m时观察到最显著的差异2仅占27%的存活率。这些结果表明，低形态p53市盈率促使MEF对UVB治疗过敏。非辐照p53市盈率MEF的生长速度与野生型细胞相似（数据未显示），排除了在p53中观察到的敏感性市盈率MEF是由于未经处理的MEF存在增长劣势。31为了确定p53的低形态突变是否对IR后MEF的存活也很重要，我们将MEF暴露于不同剂量的IR，野生型，p53市盈率和p53−/−MEFs在对IR的反应中都表现出相对相似的生存模式，表明p53亚型突变不会影响MEFs在对IR的反应中的生存。在用UVR和IR进行类似剂量的集落形成试验后，观察到类似的趋势（数据未显示）。因此，我们认为p53市盈率对UVB治疗特别敏感，对IR不敏感。
第53页172P兰特MEF对UVR特别敏感，但对IR不敏感。（A） p53生长曲线+/+，p53市盈率和p53−/−不同剂量UVB后的MEF。（B） 不同剂量IR后的生长曲线。存活率由每个处理剂量下活细胞占未处理条件下总活细胞的百分比决定。给出了具有代表性的结果；每个实验独立重复5次以上。数据为平均值±SEM，*表示与野生型相比p<0.001。（C） 从紫外线暴露后0、6、24和48小时的MEF中提取DNA（200 J/m2). 使用针对CPD或（6-4）光产物（6-4 PP）的抗体通过RIA测量光产物。给出了具有代表性的结果；每个实验独立重复3次以上。（D） UVB暴露后0、6和24小时小鼠背部皮肤的DNA（5 kJ/m2); 如上所述测量光产物。N=5只老鼠/时间点。
突变型p53172P兰特细胞能够正常去除紫外线诱导的受损基底。
紫外线照射通过形成环丁烷-嘧啶二聚体（CPD）或嘧啶（6-4）-嘧啶酮光产物（6-4光产物）诱导DNA链扭曲，从而启动核苷酸切除修复（NER）途径和细胞周期检查点。32确定p53的超敏反应市盈率MEF是由于细胞修复紫外线诱导的CPD和（6-4）光产物的能力缺陷所致，从UVB照射的MEF（200 J/m）中分离出DNA2)在照射后6、24和48小时，通过放射免疫分析法分析CPD和（6-4）光产物。33结果如所示显示p53中（6-4）光产物和CPD的去除率市盈率和p53一样有效P（P）/+UVR后48小时的野生型细胞；这一结果表明，损伤DNA碱基的去除和修复本身并不受p53的影响对/对突变。
接下来我们分析了p53的体内超敏反应市盈率通过在紫外线照射后的不同时间点（0、6和24小时）从小鼠皮肤中提取DNA样本，小鼠存在修复紫外线诱导的CDP和（6-4）光产物的问题。5.0 kJ/m时2UVB是一种表现出明显超敏反应和免疫抑制的剂量，两种基因型中的（6-4）光产物都被迅速去除，在6小时时仅剩下53-67%，24小时后仍剩下19-43%，基因型之间的修复率没有显著变化。CPD的去除速度稍慢，6小时时仍有51-71%的CPD残留，24小时时仍保留24-48%的CPD，但在这里，无论基因型如何，修复率都是相似的(). 尽管如此，这些结果表明p53的敏感性增加市盈率小鼠对紫外线致癌不是由于修复缺陷所致的紫外线诱导的DNA损伤。
野生型MEF暴露于紫外线辐射后发生凋亡。
暴露于紫外线辐射后，野生型MEF的显著细胞反应是发生凋亡，而p53在介导这种死亡途径中起着重要作用。25,34p53基因市盈率突变使细胞对p53依赖性凋亡产生抵抗，26,35因此，为了确定在我们的系统中UVB辐射后野生型和突变型MEFs的凋亡程度，我们用标记的AnnexinV和PI对辐射后的MEFs进行染色，然后通过流式细胞术分析样品。36用UVB（100和250焦耳/米）处理MEF2)24小时和48小时后采集细胞。作为对UVB的反应，15至25%的野生型MEF在100 J/m剂量下发生凋亡2，与以前的报告相关。37当用更高剂量处理这些细胞时，这一百分比从28%增加到63%(和S3a公司). 典型剖面如所示这种凋亡依赖于p53，因为在p53缺陷的MEF中检测到非常低的凋亡水平（低于10%）。正如预期，p53市盈率MEF显示出与p53几乎相同的凋亡水平−/−MEF，进一步表明p53市盈率MEF缺乏p53介导的凋亡。
野生型MEF发生凋亡，而p53172P兰特中波紫外线照射后，MEF引发细胞衰老。（A） UVR后48小时收集细胞（100和250焦耳/米2)并使用膜联蛋白V和PI染色测量细胞凋亡，随后进行FACS分析。误差线代表平均值±SEM。差异通过双尾、非配对学生t检验确定*与野生型相比，p<0.001。（B） UVR后48小时不同基因型Annexin V染色后的FACS图谱（100和250 J/m2). 给出了具有代表性的结果；每个实验独立重复3次。（C） UVB后48小时SA-β-gal阳性细胞的定量（100和250 J/m2). （D） IR（6和10 Gy）后48 h SA-β-gal的定量。误差线代表平均值±SEM。*表示p<0.005与野生型。（e） 第53页市盈率未经处理的MEF（上部）和暴露于100 J/m的MEF2用SA-β-半乳糖对UVB辐射（下部）进行染色，并用H&E放大40倍进行复染。（F） p53中p53、p21、PUMA、Noxa和Bcl-2的Western blot分析+/+和p53市盈率暴露于100焦耳/米的MEF2紫外线照射后24、48和72小时采集，使用未经处理的p53−/−MeFs作为对照，β-actin显示为负载控制。
在没有凋亡的情况下，p53172P兰特MEF在紫外线照射后会衰老。
非同源末端连接缺陷型p53市盈率小鼠，抗原受体基因累积的DNA损伤导致发育中的淋巴细胞衰老，p53和p21数量增加，10和自发DNA损伤导致这些突变小鼠胰腺β细胞的细胞衰老。38接下来我们问UVR引起的初始DNA损伤是否会驱动p53市盈率MEF会衰老。野生型，p53−/−和p53市盈率MEF接受100和250焦耳/米剂量的UVB辐射224小时和48小时后收获，染色检测衰老相关β-半乳糖苷酶。如所示和S3B型在野生型和p53中都检测到极低比例的衰老细胞−/−MEFs，而在p53中检测到高百分比的衰老细胞市盈率MEF公司。p53中的水平超过50%对/对250焦耳/米后48小时MEF2相比之下，野生型p53的治疗率不足20%−/−MEF公司。衰老p53的代表性领域市盈率MEF用SA-β-gal染色，用H&E反染色，如所示另一方面，尽管p53中衰老细胞的百分比也较高市盈率IR治疗后MEF与野生型和p53的比较−/−MEFs，IR治疗后的总数低得多（只有3–6%），表明急性IR治疗后MEFs不会迅速衰老(和S3C系列). 这些结果表明p53基因172P兰特突变对紫外线诱导的DNA损伤作出反应，以剂量和时间依赖性的方式逐渐驱动细胞衰老，这解释了紫外线处理后p53的低膨胀率市盈率MEF公司。总的来说，这些结果揭示了p53172兰特被激活以应对紫外线诱导的损伤，而不是γ射线，从而驱动细胞衰老，这是导致p53生长缓慢的原因市盈率MEF公司。
第53页172P兰特不能反式激活促凋亡基因。
为了应对DNA损伤，p53被稳定并激活下游靶点以诱导细胞应答程序。为了确定野生型和突变型p53对UVB照射的反应差异，我们分析了UVB辐照后24、48和72小时已知下游凋亡和细胞衰老标记物的蛋白水平。如所示,S4系列和第5章，在未经处理的MEF以及接受100 J/m治疗的MEF中检测到低水平的p532UVB。然而，在250焦耳/米2野生型细胞中p53的水平在照射后24h开始升高，48h和72h下降。相反，突变型p53市盈率水平一直保持在高位。野生型和p53中p53的高表达对应于p21水平的增加市盈率250焦耳/米UVR后的MEF2(图S4). 与野生型相比，突变MEF中p21的水平也略有降低，这与之前关于p53的报道一致对/对突变细胞。26,31值得注意的是，UVR上调了野生型MEF中促凋亡蛋白PUMA的水平，而PUMA以及另一个p53依赖性促凋亡蛋白NOXA的水平在p53中仍然很低市盈率单元格()这与这些突变细胞无法触发p53介导的凋亡一致。因此，p53细胞凋亡不足市盈率至少部分原因是突变型p53不能处理对诱导凋亡重要的促凋亡因子。此外，UVB治疗后野生型抗凋亡蛋白Bcl-2水平下降，而突变细胞中Bcl-2的水平仍然很高，仅在72小时时p53中略有下降市盈率在基因型之间分析了额外的凋亡标记，这证实了我们的结果，并排除了Bax和Bak蛋白的参与(图S4)因为这些水平在UVB治疗前后没有改变。这些结果表明，突变型p53不能下调生存蛋白Bcl-2对UVB暴露的反应，这对诱导细胞凋亡至关重要。
讨论
抑癌基因p53在UVR后介导细胞反应中起着核心作用。20,39我们的研究表明，p53R172P突变在体内和体外都会导致UVB辐射超敏反应。在没有p53依赖性凋亡的情况下，突变小鼠对UVB辐射的耐受性大大降低。与野生型小鼠相比，在极低剂量下，突变小鼠的皮肤肿胀和免疫抑制更加严重。然而，没有证据表明p53修复UVR诱导的DNA损伤发生变化市盈率小鼠，表明易感性的增加是由UVR诱导的细胞反应引起的。
UVR除了是导致基因组不稳定和突变的直接DNA损伤剂外，还可诱导免疫抑制，这已被确定为诱发癌症的主要风险因素。40众所周知，紫外线辐射会导致特异性免疫抑制，从而导致对紫外线诱导的皮肤肿瘤的敏感性。41,42有趣的是，p53市盈率小鼠更容易受到紫外线辐射的免疫抑制作用，因为在极低剂量下观察到显著的免疫抑制，而在野生型小鼠中，UVR剂量并不抑制DTH。这些结果与在p53中发现的结果不同−/−与野生型小鼠相比，未表现出对UVB诱导的免疫抑制的敏感性增加。22众所周知，不同品系的小鼠对紫外线诱导的免疫抑制表现出不同程度的敏感性，43,44我们研究中使用的小鼠菌株（C57BL/6 129/Sv mix）可能可以解释在p53中观察到的结果之间的差异−/−和p53172P兰特老鼠。然而，这种解释是不太可能的，因为我们研究中的室友对照组没有表现出与p53相同的敏感性172P兰特老鼠。因为我们没有观察到紫外线诱导的DNA损伤修复缺陷和/或Ras，第16页墨水4a和第19页农业研究基金p53中的基因市盈率小鼠（数据未显示），我们得出结论，不能修复DNA损伤并不导致p53敏感性增加市盈率小鼠紫外线致癌。相反，p53突变导致细胞缺乏凋亡，强烈诱导细胞周期停滞和衰老，可能是UVB超敏反应的主要原因。与此相一致，最近的一项研究将长期紫外线暴露与人类皮肤成纤维细胞的过早衰老联系起来，23这可能会对紫外线诱导的光老化产生直接影响。需要进一步研究p53依赖性凋亡在紫外线诱导的炎症和免疫抑制中的作用。p53基因的突变可能与免疫抑制有关，也与肿瘤发生直接相关，这一领域尚未得到很好的研究。
紫外线诱导的DNA损伤可以通过NER途径修复，32或者，DNA严重受损的细胞发生凋亡。抑癌基因p53在这两个过程中起着核心作用。45它可以直接参与NER对DNA损伤的修复46,47并且具有已知的调节细胞周期阻滞的功能，为细胞在重新进入细胞周期之前修复受损的DNA提供时间。在DNA损伤后诱导程序性细胞死亡也是必需的。与p53缺陷的成纤维细胞不同，后者在总NER中有缺陷，我们的研究表明突变的p53市盈率细胞在紫外线照射后具有正常的修复DNA的能力，这表明DNA损伤本身并不是紫外线敏感性的唯一原因。目前还不完全了解p53如何参与NER过程。一些证据表明，p53可能直接与NER解旋酶因子XPD或XPB结合，48或通过调节基因表达如XPC或XPE基因在NER中发挥作用49,50以及编码启动全球基因组修复的反式激活基因。51我们的研究表明，低形态突变体p53172P兰特在修复紫外线诱导的DNA损伤方面至少保留部分功能。
我们的研究表明，两个p53依赖性事件对UVB暴露后诱导凋亡很重要：促凋亡基因的上调，如彪马和诺克斯抗凋亡基因的下调Bcl-2型通过转录因子E2F1的失活。52,53在这两种情况下，低形态突变型p53都有缺陷。这些结果与之前的报告一致，即PUMA或Noxa的缺失使MEF对紫外线诱导的细胞死亡具有部分抵抗力。25Bcl-2的过度表达也抑制紫外线诱导的凋亡，这与突变的p53相似市盈率UVR后的MEF。有趣的是，RNA干扰下调Bcl-2可恢复紫外线照射后p53细胞的凋亡反应−/−成纤维细胞，52表明Bcl-2在决定细胞命运中起着关键作用。
报告显示PUMA缺乏凋亡−/−或NOXA−/−与野生型相比，它们的存活率更高，从而使细胞能够抵抗紫外线照射。25这与我们的结果不一致，我们的结果表明p53市盈率紫外线照射后，MEF的增长速度慢于野生型。我们认为缺乏凋亡会导致细胞在DNA损伤后衰老，从而显著减缓细胞生长。在这些突变细胞中发现p21的高表达，p21是一种强细胞周期激酶抑制剂，也是p53的典型下游靶点。有证据表明p21是促使细胞衰老的关键成分。54然而，有趣的是观察到p53172P兰特未能交易私有PUMA/Noxa，但保留了将私有p21交易至几乎正常水平的能力。虽然我们不知道其机制，但这可能是p53调控启动子的本质中的线索。Morachis及其同事最近表明，参与细胞反应的基因的动力学表现不同，细胞周期调节启动子是“预加载的”，并且可以比需要收集和激活预启动复合物的凋亡分子更快地被激活。55这就提出了一种有趣的可能性，即突变型p53由于DNA结合域中的点突变所呈现的空间位阻或可能缺乏正确结合所需的一致序列而无法与某些启动子进行相互作用。无论如何，还需要进一步的研究来确切理解p53的原因172P兰特不能处理个体凋亡分子，但可以部分激活细胞周期调节器，我们的数据表明这是p53的主要原因市盈率细胞经历细胞衰老。
与IR暴露不同，UVR暴露诱导MEFs凋亡也是令人感兴趣的。紫外线和红外线照射造成不同类型的DNA损伤，从而触发p53上游的不同反应。紫外线主要引起DNA碱基上化学键的修饰，尤其是嘧啶碱基上的化学键，从而在C-T碱基之间形成二聚体或（6-4）光产物；这种损伤将导致染色质结构的扭曲，可能会加重某些细胞反应，这些反应与IR引起的DNA双链断裂截然不同。ATR和ATM被不同种类的DNA损伤激活，尽管它们在细胞周期检查点激活中有一些重叠的下游靶点。ATM感应双链DNA末端，ATR感应与RPA结合的单链DNA。56与ATM相比，ATR的激活速度较慢，这主要是由于在S和G阶段识别这些细胞中的DNA断裂2细胞周期的阶段。紫外线对基因组DNA的损伤可以通过ATR检测到，57通过Chk1介导信号通路，触发细胞周期阻滞、DNA修复、衰老或凋亡。与本研究相关的是，紫外线和红外辐射导致p53的不同翻译后修饰，最明显的是紫外线导致Ser389的磷酸化，而红外则没有。这会激活不同的下游效应器。有趣的是，p53S389A型突变小鼠在长期紫外线照射后更易患肿瘤，但在红外线照射后则不易患。58因此，不同类型的DNA损伤可以在不同的位点修饰p53以触发特定的细胞反应。
细胞对紫外线的反应也是细胞类型依赖性的。59最近的证据表明，ATR-ATRIP与TOPBP1分子的结合触发了DNA损伤反应，并诱导细胞以p53依赖的方式进行衰老。60托莱多及其同事发现，短暂的信号传导导致细胞周期停滞，而长时间持续的信号传导则导致衰老。在我们的研究中，UVR治疗以剂量依赖的方式导致野生型小鼠凋亡，但在凋亡缺陷突变体中诱导衰老。这些结果表明，UVB可能比TOPBP1依赖的途径激活更多，这些替代途径可能是触发细胞凋亡所必需的。最近报道了另一种突变型p53小鼠，其中p53富含脯氨酸的结构域的缺失对诱导凋亡很重要，它消除了凋亡途径，但没有细胞周期阻滞。61这种突变改变了肿瘤谱，与p53缺失小鼠相比，突变小鼠表现出异常的B淋巴细胞发育并死于B细胞淋巴瘤，而p53缺失鼠主要死于胸腺淋巴瘤。最重要的是，我们的研究表明，p53依赖性凋亡，以及DNA修复和细胞周期阻滞，共同控制细胞增殖和维持基因组完整性。这些反应是确保细胞内环境稳定所必需的。在我们的案例中，一种成分的缺陷，即凋亡途径，可能导致细胞内环境失衡，如果不加以抑制，可能会传播到致病性后果中。
我们的结果表明，p53依赖的细胞对UVR的反应在影响细胞增殖率方面起着主要作用。细胞凋亡是一个重要的生理过程，对于维持细胞内环境稳定和消除受损细胞以维持基因组完整性至关重要。我们的结果还表明，在没有p53依赖性凋亡的情况下，细胞可能会衰老，这是一个抑制细胞生长的过程，也是防止基因组不稳定的关键。同时，衰老也可能与UVB超敏反应、免疫抑制以及可能的衰老有关。我们的研究是p53依赖性细胞反应的一个明显例子，而不是DNA修复活性本身，DNA修复活性在调节细胞生长和增殖中起主导作用。此外，由于突变导致的p53功能异常可能会给细胞或生物体带来不利影响，即使存在正常的DNA损伤修复。
材料和方法
动物。
先前已经描述了小鼠的维持。38这些方案得到了德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心动物护理和使用委员会的批准。
急性照射。
在急性研究中，将小鼠背部刮毛，并按指定剂量照射一次137Csγ射线源（JLS Shepard&Associates，加利福尼亚州格伦代尔），或使用四个FS40日光灯的紫外线（National Biological，俄亥俄州Twinsburg）。30,62日光灯的紫外线输出是用IL1700辐射计测量的。在照射后的指定时间点，用卡尺测量背部皮肤皱褶，将照射区域的皮肤样本冷冻在液氮中，并固定一部分用于进一步研究。从冷冻样品中提取DNA。进行放射免疫分析以确定环嘧啶二聚体和（6-4）光产物形成的程度。33
免疫抑制。
如前所述，为了测量UVB对免疫反应的影响，使用了延迟型超敏反应。30将小鼠背部剃毛，第二天给予一定量的UVB辐射。五天后，他们接受福尔马林固定免疫白色念珠菌。延迟型超敏反应，由脚垫肿胀增加决定，以应对白色念珠菌-免疫后10天测定特异性抗原（阿勒切克，波特兰，ME）。计算组中每只动物的脚垫厚度（左脚+右脚÷2）的平均变化（N=5）。然后计算组的厚度变化±SEM。
皮肤组织学和免疫荧光。
将皮肤固定在Bouin溶液（Ricca Chemical Company）中过夜，通过乙醇脱水，并嵌入石蜡中进行组织学分析。用抗p53（细胞信号）和p21（圣克鲁斯）抗体培养切片（6µm）。根据制造商的建议应用二级抗体，并与带有DAPI（Vector）的Vectashield Hard Set孵育。通过荧光显微镜（Olympus BX41）分析载玻片。此外，使用转移酶介导的dUTP镍标记（TUNEL）检测试剂盒（Promega）检测细胞凋亡，DNase-1处理的切片作为阳性对照。38
细胞衰老。
通过染色试剂盒（细胞信号）检测皮肤中衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性。如前所述，检测MEF中的SA-β-gal活性。63对载玻片进行苏木精-伊红（H&E）染色，并用光学显微镜检查（奥林巴斯BX41）。使用ImageJ（马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院）对SA-β-gal活性阳性的MEF与总细胞进行评分。
细胞培养和紫外线照射。
在添加了10%胎牛血清（SAFC Biosciences）和100 U/mL青霉素（Cambrex）的Dulbecco改良Eagle's培养基（Mediatech）中培养至第13.5天的小鼠胚胎成纤维细胞。细胞在37°C和5%CO的培养箱中放置在10 cm的培养皿中2使用FS40日光灯进行照射；紫外输出用IL 1700辐射计测量。在亚融合后，将细胞暴露于不同剂量的UVB中，置于PBS薄层中。对照细胞保持在相同的培养条件下，无UVB。
辐射敏感性分析。
简单地说，MEF被播种在6厘米的培养皿上，然后用不同剂量的电离辐射通过137Csγ射线源。辐照后，更换培养基，并在37°C下培养7天，第3天改变培养基。在试验结束时，对MEFs进行胰蛋白酶消化并计数活细胞。此外，MEF被镀到10厘米的培养皿上，并按照上述方法用UVB照射，照射后3天评估其生存能力。
细胞凋亡和细胞周期分析。
如上所述，用电离辐射或UVB照射MEF，并在指定的时间点收集MEF。使用FITC-Annexin V细胞凋亡检测试剂盒（BD Pharmingen）分析细胞凋亡。使用流式细胞仪（FACScalibur，Becton Dickinson）收集数据，并通过FlowJo软件（Tree Star，OR）进行分析。
蛋白质印迹分析。
按照上述方法对细胞进行辐照，并将其收集在裂解缓冲液中。将40µg蛋白质加载到10%聚丙烯酰胺凝胶上。转移后，PVDF膜（Biorad）与p53、PUMA（细胞信号）、p21（BD Pharmingen）、PARP和Noxa（Abcam）、Bcl-2和Bax（Santa Cruz）、Bak（Calbiochem）和β-肌动蛋白（Thermo Scientific）抗体孵育。根据制造商的建议应用辣根过氧化物酶结合二级抗体。使用增强化学发光试剂盒（Perkin Elmer）检测信号。
统计分析。
结果显示为平均值±SEM。差异通过双尾、非配对Student t检验确定，CI为95%。p值小于0.05表示具有统计学意义（加利福尼亚州圣地亚哥GraphPad Prism软件公司）。
致谢
作者想感谢G.Lozano博士提供的p53基因市盈率小鼠David L.Mitchell博士帮助分析紫外线诱导的DNA损伤修复，医学博士Peter Wolf帮助确定皮肤褶皱厚度。由美国癌症学会-邦妮·基斯基金会（给加利福尼亚州）资助，国家癌症研究所拨款CA116933（给加利福尼亚省）、CA112660和CA131207（给欧盟），国家环境健康科学研究所拨款ES07784。C.L.B.部分由美国国立卫生研究院P50 CA093459拨款支持。
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