缺乏与C激酶1相互作用蛋白的小鼠的保留性急性疼痛和受损神经病理性疼痛

摘要

介绍

神经传递需要在质膜上对信号转导机制进行空间和功能组装。突触后密度是兴奋性突触质膜下的一种电子密度细胞骨架结构，是受体、通道和效应器组织调节信号传导的一个部位[1]. 突触后密度包含膜蛋白，如AMPA受体（AMPAR）亚单位和NMDA受体亚单位，信号转导分子，如蛋白激酶Cα（PKCα）和神经元一氧化氮合酶，以及支架蛋白[1,2]. 大多数支架蛋白包含一个或多个PDZ（PSD-95/Dlg/ZO-1）氨基酸结构域[1,三,4]. 通过PDZ域相互作用，它们在突触受体周围组装细胞内信号复合物，调节突触和非突触受体的运输和功能，并参与通过突触受体激活触发的许多生理和病理过程[1,三-6]。

与C激酶1（PICK1）相互作用的蛋白，一种富含突触后密度的PDZ结构域支架蛋白，最初被报道与PKCα相互作用[7]随后在中枢神经元中被发现与突触AMPAR亚单位GluR2结合[8-10]. 我们最近报道，PICK1通过其PDZ结构域与GluR2和PKCα相互作用，将细胞内PKCα招募到突触GluR2，并导致GluR2在Ser880的磷酸化[11-14]. 这种磷酸化破坏了突触GluR2和锚定蛋白AMPAR结合蛋白/谷氨酸受体相互作用蛋白之间的相互作用；促进突触GluR2内化；并增加突触GluR2-lacking，Ca²⁺背角神经元中的可渗透性AMPAR[11-14]. 此外，我们之前已经证明，通过靶向性破坏PICK1基因来阻止背角GluR2内化，可以在维持期减弱完全弗氏佐剂（CFA）诱导的疼痛超敏反应[14]. 这些结果表明，脊髓PICK1可能通过促进背角GluR2内化参与持续炎症疼痛的维持。然而，PICK1在神经系统疼痛相关区域的表达和分布尚未被仔细研究。此外，CFA诱导的炎症性疼痛和神经损伤诱导的神经病理性疼痛可能在其中枢机制中共享一些细胞内信号通路[15]但PICK1是否也参与神经损伤诱导的持续性神经病理性疼痛的发展和维持尚不清楚。

在本研究中，我们首先描述了PICK1在两个主要疼痛相关区域的表达和分布，即背根神经节（DRG）和脊髓背角。然后，我们探讨了PICK1在第五腰椎（L₅)脊髓神经结扎（SNL）和远端横断。最后，我们检查了外周神经损伤是否像外周炎症一样诱导背角GluR2内化，以及在神经病理性疼痛条件下这种诱导是否需要脊髓PICK1。

材料和方法

结果

在WT小鼠的DRG中观察到PICK1阳性细胞，但在PICK1 KO小鼠中没有观察到（图​（图1A）。1安培). 大多数尺寸较小，从250μm到750μm不等²表面积（图​（图1B）。1B年). 一些中等大小的DRG细胞也呈PICK1阳性（图​（图1B）。1B年). 与小DRG细胞相比，大直径DRG细胞的群体大多缺乏PICK1。在计数的1124个DRG细胞中，约29.7%为PICK1阳性。双标记研究表明，PICK1仅与神经核标记物NeuN共定位[21]但胶质细胞中没有（图​（图2A）。2安培). 我们进一步鉴定了DRG中PICK1阳性神经元的细胞化学特征。约62.8%（211/336）的PICK1阳性神经元对IB4阳性，IB4是小DRG非肽能神经元的标志物[21]约26.9%（125/465）的PICK1阳性神经元CGRP阳性，CGRP是小DRG肽能神经元的标志物[21]。

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图1

PICK1免疫反应在背根神经节（DRG）中的定位和分布.A类，PICK1免疫反应性在野生型（WT；左）和PICK1基因敲除（KO，右）小鼠DRG细胞中的分布。在PICK1KO小鼠的DRG中未观察到PICK1的免疫反应。比例尺：200μm。B类，直方图显示了WT小鼠DRG中PICK1阳性和阴性躯体的横截面积频率。

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图2

DRG神经元中PICK1免疫反应及与IB4结合和CGRP的共定位数字图像由共焦激光扫描显微镜拍摄。A类PICK1和NeuN的Colocalization。B类PICK1和IB4结合的Colocalization。C类PICK1和CGRP的Colocalization。比例尺：5μm。

脊髓中也观察到PICK1蛋白。PICK1免疫反应在脊髓背角浅层的分布密度高于脊髓其他区域，尤其是在第一层和第二层内（图​（图3A）。3A级). 在高倍镜下，PICK1的免疫反应主要表现为点状或斑片状免疫染色（图​（图3B）。3B公司). 在背角可见少量PICK1阳性细胞体（图​（图3B）。3B公司). 在电子显微镜下，PICK1的免疫金标在突触后密度、树突和浅背角突触前终末显著（图​（图3C3厘米和​和3D三维).

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图3

PICK1免疫反应在脊髓中的定位和分布.A类PICK1免疫反应在背角Ⅰ层和内Ⅱ层最强。IIo：外板II。B类高倍镜下观察到A。PICK1阳性躯体（箭头）、穿孔和斑块（箭头）的轮廓区域。C类PICK1的免疫金标记在突触后密度中显著（箭头所示）。D类PICK1的免疫金标记在突触前末端（箭头）和突触后树突（箭头）显著。前：突触前。后：突触后。比例尺：A为100μm，B为5μm，C和D为100 nm。

我们进一步使用行为测试来确定PICK1是否参与伤害性信息的传递和调制。由于PICK1是一种支架蛋白，没有任何受体样或酶样活性，我们使用了一种基因组策略，其中PICK1基因发生突变。如前所述[16]、PICK1 KO雄性和雌性小鼠存活，外观正常。用PCR检查每只小鼠的基因组状态（图​（图4A），4A级)免疫组化和Western blotting分析证实PICK1蛋白在DRG和脊髓中的表达。正如预期的那样，PICK1 KO小鼠的DRG或脊髓中未检测到PICK1（图​（图1A1安培和​和4B）。4B类). 此外，还评估了PICK1相互作用蛋白在DRG和脊髓中的表达。Western blotting分析显示DRG中相互作用蛋白ASIC1和ASIC2的水平（图​（图4B）4B类)以及脊髓中相互作用蛋白GluR2和PKCα的水平（图​（图4C）4摄氏度)PICK1 KO小鼠正常。PICK1KO小鼠的DRG和脊髓细胞结构正常（数据未显示）。这些结果表明，除了PICK1蛋白的丢失外，PICK1基因的靶向破坏不会产生任何可检测到的DRG或脊髓解剖结构或蛋白表达异常。

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图4

PICK1基因敲除（KO）小鼠的生化特性.A类野生型（WT）、杂合型（HET）和PICK1 KO小鼠尾部DNA的PCR分析。M： 分子量标准。B类Western blot分析显示PICK1蛋白及其相互作用蛋白ASIC1和ASIC2在WT和PICK1 KO小鼠DRG中的表达。C类，Western印迹分析显示了来自WT和PICK1-KO小鼠的脊髓中PICK1及其相互作用蛋白GluR2和PKCα的表达。

我们首先研究了PICK1的缺失是否影响急性伤害性反应。通过不同的冯-弗雷纤维力引起的机械刺激引起的爪子缩回反应频率来评估急性机械敏感性。通过对左右后爪足底和尾巴施加高强度辐射热来评估急性热敏感性。我们发现PICK1KO小鼠对急性机械性损伤的爪子退缩反应（图​（图5A）5A级)和热刺激（图​（图5B）第5页)以及对急性热刺激的甩尾反应（图​（图5C）5摄氏度)与WT小鼠相似。这些数据表明，PICK1KO小鼠保留了急性疼痛信息的传递。

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图5

PICK1基因敲除（KO）保留急性疼痛.A类，幼稚野生型（WT）和PICK1 KO小鼠对von Frey单丝的各种作用力的反应的基线爪子拔出频率。B类，幼稚WT和PICK1 KO小鼠对热刺激反应的基线爪子撤退潜伏期。C类，幼稚WT和PICK1 KO小鼠对热刺激反应的基线尾舔潜伏期。

接下来，我们确定了PICK1在神经病理性疼痛中的作用。与我们之前的研究一致[6,22]，L₅SNL对WT小鼠同侧后爪神经损伤产生长期机械和热痛超敏反应。将0.24 mN（低强度）和4.33 mN（中等强度）von Frey纤丝应用于同侧后足跖侧，引起的足爪退缩频率显著高于损伤前基线值。这种机械性疼痛超敏反应在第3天可检测到，在第7天到第9天达到峰值，并在神经损伤后持续至少14天（图​（图6A6A级和​和6B）。6亿). 同样，对同侧后足跖侧施加热量后，足爪的拔出潜伏期与损伤前的基线值相比显著降低。这种热痛超敏反应在5天内形成，并持续至少14天（图​（图6C）。6摄氏度). 如上所述，WT和PICK1 KO小鼠对机械和热刺激的基线退出反应相似（图​（图6），6)但PICK1 KO小鼠在脊髓神经损伤后未表现出机械或热痛觉超敏反应。与PICK1KO小鼠的基线水平相比，爪子对机械和热刺激的撤退反应没有变化(P（P）> 0.05; 图​图6）。6). 正如预期的那样，腰神经损伤后，WT或PICK1 KO小鼠对侧后爪对机械和热刺激的撤退反应没有改变（图​（图66).

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图6

PICK1基因敲除（KO）小鼠表现出受损的神经病理性疼痛.L型₅SNL对0.24 mN（低强度；A类)和4.33 mN（中等强度；B类)机械刺激和显著降低爪子对热刺激的退缩潜伏期(C类)野生型（WT）小鼠的同侧（ipsi），而非对侧（对侧）。在观察期间，PICK1 KO小鼠没有表现出爪子撤退频率或延迟的任何变化*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01与PICK1KO小鼠同侧相应时间点。

由于运动功能与爪子收回反射反应有关，我们测试了PICK1的缺失是否影响运动功能。我们记录了WT和PICK1KO小鼠三种粗大反射（放置、抓握和扶正）的得分。我们发现，PICK1 KO小鼠在三种反射方面的表现与它们的WT同窝小鼠相同（表​（表1）1)并且没有表现出明显的运动协调缺陷。结果表明，PICK1缺陷不会损害粗大运动功能，也不能解释神经损伤引起疼痛行为的观察缺陷。

与其他先天性KO小鼠一样，PICK1基因KO小鼠在发育过程中可能会经历未知的神经系统代偿性变化。这些变化可能会影响动物的行为。为了进一步证实PICK1在神经病理性疼痛中的作用，我们使用PICK1 AS ODN急性短暂地击倒大鼠脊髓和DRG中的PICK1。我们之前的研究表明，i.给予PICK1 AS ODN（10μg），而非MS ODN（10ug），选择性地显著降低了PICK1在脊髓和DRG中的表达[14]. 这种减少并不影响基本的机械和热反应或运动功能，但确实减轻了CFA诱导的机械和热敏感性疼痛[14]. 在这里，我们发现，在静脉注射10μg PICK1 AS ODN后，机械和热疼痛的超敏反应显著减弱，直到SNL后第7天（图​（图7）。7). AS组（n=5）和生理盐水组（n=5；P（P）< 0.01). 正如预期的那样，10μg MS ODN不会影响神经损伤诱导的机械性和热性疼痛超敏反应的发展(P（P）>0.05，n=5；图​图77).

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图7

PICK1基因敲除可减轻神经病理性疼痛.L型₅脊髓神经结扎（SNL）导致对8.01 mN机械刺激的爪子拔出频率显著增加(A类)在热刺激下，爪子退缩潜伏期显著降低(B类)在盐处理大鼠的同侧。鞘内注射PICK1反义（AS）寡核苷酸（ODN，10μg）可延缓SNL后第3天和第5天机械性和热性疼痛超敏反应的发展。用生理盐水处理的大鼠和用错义（MS）ODN（10μg）处理的大白鼠之间，没有观察到爪子撤退频率或延迟的显著差异**P（P）与盐处理组的相同时间点相比，<0.01。

我们之前的研究结果表明，PICK1介导的背角GluR2内化有助于维持CFA诱导的慢性炎症疼痛。因此，我们研究了神经病理性疼痛是否会发生类似的过程。用差速离心法分离粗细胞溶质和突触体膜蛋白组分。与我们之前的研究一致[11,12,19]，一种血浆膜特异性蛋白，N个-钙粘蛋白在膜组分中高度检出，但在细胞溶质组分中未检出（数据未显示），这表明分离过程有效地将细胞溶质蛋白与突触体膜蛋白分离。我们发现L₅SNL没有改变同侧L细胞溶质或突触体部分GluR2的水平₄（未显示数据）和L₅（图​（图8）8)观察期间WT和PICK1 KO小鼠的背角。这些发现表明，周围神经损伤不会导致背角内吞GluR2。

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图8

我₅脊髓神经结扎（SNL）不会诱导野生型（WT）小鼠背角内吞GluR2.A类WT和PICK1基因敲除（KO）小鼠在L₅SNL公司。上图：代表性的西方印迹。底部：在标准化为相应的β-肌动蛋白后，相对于幼稚（0）小鼠表达的密度分析的统计摘要。B类实验结束后不同时间点WT和PICK1 KO小鼠同侧背角突触体膜组分中GluR2的水平₅SNL公司。上图：代表性的西方印迹。底部：归一化至相应值后，相对于幼稚（0）小鼠表达的密度分析的统计摘要N个-卡德林。

讨论

神经性疼痛是一种慢性疾病，影响着全世界数百万人。目前的治疗方法往往不足、无效或产生潜在的严重不良影响。因此，寻找新的治疗和预防策略至关重要。在这里，我们报告了PICK1，一种PDZ域的支架蛋白，可能需要用于诱导神经损伤诱导的神经病理性疼痛，这表明PICK1可能是预防和/或治疗这种疾病的新靶点。

本研究表明PICK1在DRG和背角这两个主要的疼痛相关区域表达。我们发现大约30%的DRG神经元对PICK1呈阳性反应，并且大多数这样的神经元都很小。肽能神经元和非肽能神经元均有代表。在背角，PICK1阳性终末、纤维和胞体集中在背角浅层，尤其是在第一层和第二层。在电子显微镜下，PICK1的免疫金标记与浅层背角神经元树突的突触后密度有关。与这一发现相一致，我们之前发现PICK1在背角的表达高于腹角或DRG[14]. PICK1在小DRG神经元和浅背角神经元中的大量表达表明它可能参与伤害性信息的传递和调制。

PICK1在急性疼痛和神经病理性疼痛中起着不同的作用。本研究显示，幼稚的PICK1 KO小鼠对有害的机械和热刺激有完整的反应，表明PICK1可能不参与急性疼痛传递。相反，PICK1基因敲除可在发育和维持期间消除神经损伤诱导的疼痛超敏反应。此外，脊髓和DRG中PICK1的敲低显著减轻了神经损伤诱导的疼痛超敏反应的发展。这些发现表明，脊髓和DRG中的PICK1参与神经病理性疼痛。我们之前的研究表明，脊髓PICK1缺陷也能减轻CFA诱导炎症性疼痛维持期的疼痛超敏反应[14]. 此外，我们发现这种作用可能归因于在CFA诱导的炎症性疼痛维持中NMDA受体/PKC触发的背角GluR2内化的减少[12-14]. 我们希望在神经病理性疼痛中也能观察到这种机制。然而，我们发现，在L₅SNL公司。这些结果表明，SNL诱导的神经损伤输入与CFA诱导的炎症输入不同，并不促进背角GluR2内化。因此，PICK1可能通过其他潜在机制参与神经病理性疼痛的发展，即使其与伙伴PKCα和GluR2结合。

除了与GluR2相互作用外，PICK1还通过其PDZ域与中枢神经元中ASIC1和ASIC2的C末端特异性相互作用[23,24]. ASIC1主要表达于小直径DRG神经元，而ASIC2定位于DRG小、中、大直径细胞的质膜[25-27]. 干扰小鼠ASIC2基因可显著降低机械感觉特定成分的敏感性[28]. 此外，PICK1通过PKC增强ASIC1的PKA磷酸化并增加ASIC2电流[29]. PICK1缺陷对神经病理性疼痛的抗痛觉过敏作用可能是由于DRG ASIC1和ASIC2功能的降低。

PICK1的PDZ结构域也与中枢神经元中的代谢型谷氨酸受体亚单位7（mGluR7）结合。一种抑制性突触前受体mGluR7在DRG神经元和初级传入终末表达[30,31]. 在神经病理性疼痛条件下激活，但在正常条件下不激活[32-34]. 因为PICK1抑制mGluR7的PKC磷酸化[9,35,36]PICK1缺乏可能导致mGluR7磷酸化抑制丧失，并增强mGluR 7的活化。激活的mGluR7随后会抑制初级传入神经释放谷氨酸，并在神经病理性疼痛中产生抗伤害作用。DRG PICK1可能通过调节ASIC1、ASIC2和mGluR7功能而导致神经病理性疼痛的可能性尚待进一步证实。值得注意的是，在神经病理性疼痛期间，PICK1仍与其他蛋白质相互作用，例如Eph受体酪氨酸激酶[37]，多巴胺转运体[38]和I类ADP-核糖基化因子[39]. 这些相互作用是否与神经病理性疼痛有关尚不清楚。

总之，我们发现PICK1在DRG和浅表背角神经元中表达。行为研究表明，敲除PICK1可在神经损伤诱导的神经病理性疼痛发展和维持期间消除疼痛超敏反应，而不会影响急性疼痛或运动功能。尽管神经性疼痛中这种抗伤害感受作用的机制尚不清楚，但PICK1似乎是预防和/或治疗这种疾病的潜在靶点。

竞争性利益

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

WW参与了研究设计，进行了手术、SNL模型、行为测试、RT-PCR、免疫组织化学和Western blot实验，并撰写了手稿草稿。RSP参与免疫金标记和电镜观察。KT、JX和RLH参与生成KO小鼠。YQL和RLH参与了对手稿的批判性审查。YXT和MY对研究的概念和设计、数据分析和解释以及对手稿的批判性审查做出了贡献。所有作者都已阅读并批准了最终手稿。

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