高效Kisspeptin拮抗剂的发现揭示了促性腺激素调节的生理机制

全细胞受体结合分析。

如前所述进行分析(Lu等人，2007年;Coetsee等人，2008年). 简言之，kisspeptin-10是在添加0.1%牛血清白蛋白和¹²⁵I-标记kisspeptin-10（100000 cpm/0.5 ml）。将细胞单层置于冰上，并暴露于0.5 ml肽（10 p米–10微米米); 然后将细胞在4°C下培养3 h。3 h后，用冰镇Dulbecco’s PBS（DPBS；含钙和镁）清洗细胞两次，然后用0.5 ml 0.1米摇晃时向细胞中加入氢氧化钠（NaOH）20分钟。将裂解液转移到塑料管中，并在Wallac 1470 Wizardγ计数器（PerkinElmer Life and Analytical Sciences）上计算结合放射性。

肌醇磷酸盐刺激试验。

刺激前，用DPBS（不含钙或镁）冲洗CHO/gpr-54细胞两次，然后用^三H-肌醇，37°C下用1%青霉素/链霉素标记HEPES-改良DMEM。将添加有1%青霉素/链霉素和1%氯化锂（0.5 ml）的HEPES改良DMEM在37°C下添加到细胞中30分钟，以阻止磷酸肌醇（IP）水解。然后用0.5 ml kisspeptin-10和类似物（10 p米–1 μ米)在37°C下，在上述介质中以1:100的比例稀释1小时，然后用10 m米甲酸在4°C下放置1小时以溶解细胞。将裂解液转移到含有0.5 ml Dowex树脂的塑料管中，以结合放射性IP，然后用1 ml水清洗树脂。然后用60 m冲洗树脂米甲酸铵/5 m米四硼酸钠后接1米甲酸铵/0.1米甲酸释放束缚辐射。然后，将800μl放射性溶液转移到含有2.5 ml闪烁液的闪烁瓶中，并在β计数器上计数60 s的放射性。实验重复3-5次。IP生成绘制为平均值±SEM，并使用双向方差分析和Bonferroni分析事后（post-hoc）测试(第页≥ 0.05).

脑片准备。

大脑切片是使用前面描述的方法制备的(Nunemaker等人，2002年). 简单地说，所有溶液都用95%的O冒泡₂/5%一氧化碳₂在整个实验过程中，混合至少15分钟，然后再接触组织。大脑被迅速取出并放置在含有250 m冰块的高蔗糖盐水溶液中米蔗糖，3.5米米KCl，26米米氯化钠_三，10米米葡萄糖，1.25米米钠₂高性能操作₄，1.2米米硫酸镁₄和2.5米米氯化镁₂用Vibratome 3000（国际技术产品公司）切割冠状300μm脑片。切片在30–32°C的温度下，在含135 m的50%高糖盐水和50%生理盐水（NS）的溶液中培养30 min米氯化钠，3.5米米KCl，10米米葡萄糖，1.3米米钠₂高性能操作₄，1.2米米硫酸镁₄和2.5米米氯化钙₂然后在室温下转移到100%NS溶液中，并在记录前至少保存30 min，不超过6 h。

电生理记录。

利用靶向细胞外记录（也称为loose-patch）研究kisspeptin-10和肽234对GnRH神经元放电活动的影响(Pielecka和Moenter，2006年). 由于低电阻密封（<50 MΩ）不会影响细胞膜，因此该方法是监测单个细胞内源性电活动的一种微创方法。虽然这些事件本身不是动作电位，但它们准确地反映了动作电位放电率的变化。为了简单起见，我们使用了短语firing rate、firing pattern和/或firing activity来表示这些事件。

将单个脑切片放置在记录室中，连续过量使用含氧NS溶液，并保持在29–31°C。用Olympus BX50WI垂直荧光显微镜和红外差示干涉对比（Opelco）观察细胞。GnRH神经元通过在470nm的短暂照射来识别，以可视化GFP信号。贴片硼硅酸盐移液管（世界精密仪器公司），其范围为1.5–3ΩM，用含有150 M的普通HEPES缓冲溶液填充米氯化钠，10米米HEPES，10米米葡萄糖，2.5米米氯化钙₂，1.3米米氯化镁₂和3.5米米KCl公司。使用MP-285微操作器（Sutter Instruments）将移液管与GnRH神经元接触。密封电阻范围为8 MΩ，在记录过程中保持稳定或增加，最高可达50 MΩ。使用EPC-8放大器（HEKA）和G4 Macintosh计算机（Apple computer）上Igor Pro（Wavemetrics）中运行的PulseControl XOP（Instrutech）获得电流轨迹，以获取数据。使用电压箝位模式，移液管保持电位为0mV，在10kHz下过滤，用ITC-18采集接口（Instrutech）数字化，用于记录。

实验设计。

人kisspeptin-10，1 n米（Phoenix Pharmaceuticals）通过恒温槽施用。不同剂量（1、10、100 n米)用肽234的活性测定其对kisspeptin-10激活gpr-54的拮抗作用。阳性对照细胞记录为10分钟的稳定基线，然后用kisspeptin-10处理5分钟，然后冲洗15分钟。在NS中记录实验细胞的5分钟稳定基线，然后在肽234（1、10或100 n）中记录10分钟基线米)然后在kisspeptin-10中加入相同剂量的拮抗剂5分钟，然后在NS中清洗。用含有拮抗剂的溶液洗涤也得到了类似的结果（1 n米肽234；n个=5个单元格；数据未显示）。10n中的一个电池米肽234组无活性；添加15 m米KCl证实了细胞活性和记录完整性。

实验设计。

用微透析法检测肽234对GnRH释放的影响。如前所述，当通过半透膜注入肽234时，该方法允许采集透析液样本以进行GnRH测量（23,24）。通过微透析探针将溶解在中枢神经系统灌注液中的肽234注入脑干中央隆起区30分钟，同时连续收集透析液。对于对照组，车辆也进行了类似的灌注。用肽234（10 n）检查每只动物米浓度）或在同一实验中以随机顺序的载体、两次挑战之间的2小时最小间隔。四只动物中的两只在单独的实验中接受了两次检查，共六次。在整个实验过程中，猴子被放在一只同伴猴子的附近，让它们不断获得食物和水，并经常得到水果、谷物、葡萄干和其他零食。取样的平均年龄为33.1±0.4个月。

颅底植入。

如前所述，我们使用微透析方法收集茎中层隆起区的灌流液(Keen等人，2008年). 实验前，29.1±1.2个月大的猴子（体重3.6±0.1 kg）很好地适应了灵长类椅子、实验环境和研究人员。他们在异氟醚麻醉下植入颅骨支架，与之前描述的推拉灌注法类似(Gearing和Terasawa，1988年). 实验前，允许动物恢复至少1个月。

微透析方法。

实验当天，将猴子置于立体定向仪中，氯胺酮[15 mg/kg，体重（体重）]和美托咪定（0.03–0.05 mg/kg，重量）麻醉。定制的导向套管（CMA 12）由一根不锈钢轴[76.0 mm长，0.91 mm外径（外径）]和一个可拆卸的不锈钢针（96.0 mm长、0.6 mm外径）组成，从导向套管尖端伸出20 mm。使用液压微驱动装置（MO95-B）将其插入脑干中央隆起（S-ME）上方5 mm的颅骨中。微驱动装置允许精确地对尖端位置进行三维调整。这个x个,年、和zS-ME的坐标通过脑室造影仪和颅底植入手术期间拍摄的最终X光片进行计算。通过放射显影确认插管的放置。放置引导套管后，将猴子从立体定向仪中取出，放在灵长类动物的椅子上。将内针正确放置在椅子上后，将其从引导套管中取出，并将定制的微透析探头（不锈钢轴，长96.0 mm，外径0.6 mm），配上薄膜（长5 mm，外径0.5 mm），按照前述方法通过引导套管插入S-ME(弗罗斯特等人，2008年;Keen等人，2008年). 为了逆转美托咪定的作用，将阿替帕唑（0.15–0.25 mg/kg）注射（静脉注射）到动物体内。插入探针后1小时内，动物完全清醒。

一种由147米组成的中枢神经系统灌注液米氯化钠，2.7米米KCl，1.2米米CaCl2，0.85米米从添加了杆菌肽（4U/ml）的CMA/微透析公司购买的MgCl2，用配备1或2.5 ml Hamilton气密注射器（Reno）的CMA/102微透析泵以2μl/min的速度通过流入管注入。用馏分收集器（FC203B型）在冰上，以10分钟的间隔，通过流出管将香料连续收集到12×75mm的硼硅酸盐管中长达12小时。灌流液样品立即冷冻在干冰上，并储存在−80°C下。

GnRH放射免疫分析。

如前所述，RIA使用Terry Nett博士（科罗拉多州立大学柯林斯堡分校）善意提供的抗血清R42进行(Gearing和Terasawa，1988年). 检测灵敏度为0.02pg/管，检测内和检测间变异系数分别为8.1%和11.3%。

激素测量。

使用美国国立卫生研究院提供的双抗体法和放射免疫分析试剂盒（a.F.Parlow博士，美国国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所，马里兰州贝塞斯达），以50μl的体积测量血清LH水平。大鼠LH-I-10用¹²⁵我使用IODO-GEN预涂管，遵循制造商（Pierce）的说明，并使用参考制剂LH-RP-3表示激素浓度。组内和组间变异系数分别低于8%和10%。检测灵敏度为5 pg/管。此外，在联合服用kp-10和肽234（时间为180分钟）后60分钟采集的血样中选择性地进行血清睾酮测定。为此，按照制造商的指示，使用了MP Biomedicals的商业试剂盒。检测灵敏度为0.1纳克/管，检测内变异系数为4.5%。对于每种激素，所有样本均在同一分析中进行测量。通过评估作为外部对照的已知激素浓度的大鼠血清样本，确认激素测定的准确性。

实验设计。

测定了肽234对去势动物LH分泌升高的影响。成年雄性小鼠要么在异氟醚麻醉下去势，要么保持完整。一周后，如前所述，将两种载体（20%丙二醇，13%二甲基亚砜）或肽234（15 nmol或1 nmol）分别注入小鼠侧脑室（每个3μl）(劳森和贝尔纳普，1986年;Hohmann等人，2000年;Krasnow等人，2003年). 每只动物的两次输注是相同的，每次间隔60分钟，均在轻度异氟醚麻醉下进行。第二次输注后30分钟，逆时针采集血液，离心6分钟。采集血浆并储存在−20°C下，直到检测LH。所有输液均在上午8:00至下午12:00进行n个=6-8只动物。

在发现较高剂量（15 nmol）的肽234具有强烈的拮抗作用后，进行了额外的剂量-反应研究，以更好地指定类似物的有效剂量。按照与之前相同的程序，对一组新的去势雄性小鼠进行了两次侧脑室内输注载体或三种剂量的肽234（1、5、15 nmol）中的一种，并在第二次输注后30分钟采集血液。包含的组n个=6-8只动物。

在接下来的一组实验中，我们确定了肽234单次输注是否会对LH分泌产生抑制作用，以及肽234的拮抗作用是否对kisspeptin信号传导具有特异性。首先，对去势雄性小鼠（和一组完整雄性对照组）进行脑室内单次输注（3μl）载体或肽234（5，15 nmol），30分钟后逆行采血。接下来，一组单独的健康男性首先接受3μl静脉滴注载体或肽234的治疗，然后在5分钟后再次静脉滴注kisspeptin（Phoenix Pharmaceuticals）或人工脑脊液（aCSF）。第二次输注后30分钟采集血液，并检测LH。kisspeptin的剂量为100fmol（之前证明在小鼠中可以有效诱导LH反应），肽234的剂量为100 pmol。包含的组n个=6-8只动物。