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公共科学图书馆一号。2011; 6（2）：e14665。
2011年2月7日在线发布。 数字对象标识：10.1371/journal.pone.0014665
预防性维修识别码：项目经理3034713
PMID：21326871

靶向血管NADPH氧化酶1通过PPARα介导机制阻断肿瘤血管生成

萨拉·加里多·乌尔巴尼,1 斯蒂芬·杰梅林,1 克里斯汀·德弗特,1 圣埃芬妮·卡内塞奇,1,2 奥利维尔·巴塞特,1 塞德里克·西恩德拉莱维兹（Cédric Szyndralewiez）,三 弗雷迪·海茨,三 帕特里克·佩奇,三 泽维尔·蒙特,4 莉莲·米查利克,5 杰克·阿尔比塞,6 Curzio Rüegg公司,7 卡尔·海因茨·克劳斯,1和击败伊姆霍夫1,*
斯特凡·沃尔夫，编辑器
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关联数据

补充资料

摘要

活性氧（ROS）是内皮细胞迁移、增殖和存活的调节器，与血管生成密切相关。产生ROS的NOX酶的不同亚型在脉管系统中表达，并通过不同的定位和激活提供不同的信号提示。我们发现，NOX1缺乏的小鼠，而不是NOX2或NOX4，会损害血管生成。血管生成刺激后，NOX1在原代小鼠和人内皮细胞中的表达和活性增加。NOX1沉默通过抑制NF-κB调节因子PPARα减少内皮细胞迁移和管状结构的形成。使用新型NOX特异性抑制剂以PPARα依赖的方式减少体内血管生成和肿瘤生长。总之，血管NOX1是血管生成的关键介质，是抗血管生成治疗的一个有吸引力的靶点。

介绍

血管生成是一个复杂的过程，发生在胚胎发生和伤口修复等生理情况下，并导致糖尿病、银屑病、关节炎和癌症等病理状况。血管生成是癌症进展的关键决定因素。如果没有它，肿瘤就无法生长到超过显微镜下病灶的大小，并作为休眠的、不扩张的结节持续存在[1],[2]肿瘤细胞、基质细胞和浸润的骨髓源细胞可以通过一种称为血管生成转换的过程来启动血管生成，在这个过程中，促血管生成因子的分泌增加和/或内源性抗血管生成因子生成减少[3],[4]血管生成血管主要是由现有血管系统中的内皮细胞萌芽形成的。这个过程包括周围基质的降解、细胞增殖、迁移、分化和管形成[5]抑制血管生成最近被引入临床，作为阻止癌症进展的新治疗选择[6]。

NADPH氧化酶是产生活性氧物种（ROS）的酶。根据浓度和亚细胞定位，活性氧可以调节多种细胞功能，包括病原体杀伤、细胞迁移、增殖和分化（供审查[7]). NADPH氧化酶（NOX）家族的蛋白质由七种异构体（NOX1-5和DUOX 1-2）组成，它们通过膜传输电子，从而将氧气还原为超氧化物。根据亚型，这些催化跨膜蛋白与p22形成复合物凤凰（phox）和细胞质亚基p67凤凰（phox）/NOXO1，第47页凤凰（phox）/NOXA1，第40页凤凰（phox）和Rac1/2[7]NOX1亚型在上皮细胞、视网膜周细胞、破骨细胞、血管平滑肌和内皮细胞中表达[8]——[16]虽然结肠癌患者中NOX1表达增加[17]，有人认为这可能与炎症而非肿瘤发生有关[18],[19]然而，成纤维细胞或癌细胞中NOX1的实验性过表达通过增加VEGF和MMPs的生成介导血管生成开关[20]此外，NOX1已被证明在体外调节窦状内皮细胞的凋亡和形态发生[16]。

核激素受体过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）与维甲酸X受体二聚体。经脂质激活后，该复合物通过与过氧化物酶体增殖物反应元件结合来调节基因转录。PPARα是该家族的成员，通过抑制转录因子NF-κB介导抗炎活性。在血管系统中，PPARα通过与p65亚单位直接相互作用或上调NF-κB抑制亚单位I-κB的表达来抑制NF-κ子B的反式激活[21],[22]在不同的肿瘤模型中，激动剂激活PPARα通过减少促血管生成因子（如VEGF或环氧碳三烯酸）的产生阻止肿瘤生长和血管生成[23]——[25]在人内皮细胞中，PPARα激活剂还抑制细胞因子诱导的粘附分子和趋化因子的表达[26]。

在本研究中，我们分析了NOX1在人和小鼠血管生成中的作用，并观察到在血管生成转换过程中NOX1的表达和活性增加。此外，NOX1缺乏小鼠的血管形成在血管生成因子和肿瘤的作用下显著减少。NOX1缺乏还导致内皮细胞迁移减少，管状结构形成减少。我们分析了NOX1调节血管生成的机制，发现NOX1下调抗炎和抗血管生成核受体PPARα的表达和活性。

结果

NOX1缺乏小鼠显示血管生成受损

为了测试NOX依赖性ROS的产生是否参与血管形成，我们进行了体内使用缺乏不同NOX亚型的小鼠进行基质胶血管生成测定。将Matrigel预加载血管生成因子bFGF，并将其植入野生型（WT）或NOX缺乏小鼠皮下。NOX2或NOX4缺乏动物的皮下Matrigel栓塞血管形成通过基于X射线的计算机断层扫描定量，其血管生成反应与WT小鼠无明显区别。相比之下，与WT小鼠相比，NOX1基因敲除和NOX1/2双敲除动物的Matrigel塞血管生成分别减少了47%±7.6和65%±13.2(图1a). 这种差异在切除后Matrigel塞的宏观图像上很明显(图1b). 血管标记物PECAM-1的塞子免疫染色显示，与野生动物相比，NOX1-和NOX1/2缺陷小鼠的PECAM-1阳性区域减少（分别为56%±2和46%±3）(图1c、d). 值得注意的是，NOX1-a和NOX1/2缺乏小鼠中的塞子缺乏大血管，而小血管数量显著增加(图1e)。

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NOX1缺乏小鼠表现出血管生成能力降低。

用500 ng/ml bFGF加载Matrigel，并将其植入NOX缺乏小鼠皮下。一周后，静脉注射碘化脂质体，并通过X射线断层扫描分析栓塞。（a） 基质凝胶栓塞血管化的量化。图中显示了灰色密度±s.e.m.的平均值。对于WT、NOX1 KO和NOX1/2 KO n=8，对于NOX2 KO与NOX4 KO n=6。（b）切除塞子的照片，比例尺代表（a）中实验塞子中的1 cm.c.血管密度。图表显示PECAM-1阳性面积的百分比±s.e.m.（d）。PECAM-1免疫染色照片，绿色为PECAM-1，蓝色为细胞核，比例尺代表20µm。使用20x/0.5数字孔径透镜获取图像，并使用LSM510 Meta共焦显微镜（卡尔蔡司）进行分析。e.容器尺寸分析；管腔小于20µm的血管被视为小血管（黑色），从20到50中等（深灰色），超过50µm为大血管（浅灰色）±标准偏差（s.e.m.Anova p<0.01）；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

从这些结果中，我们得出结论，NOX1对bFGF诱导的血管生成至关重要。

促血管生成因子上调NOX1的表达和活性

确定NOX1缺乏小鼠中观察到的异常血管生成是否是由于内皮细胞功能受损所致；我们研究了NOX1抑制对小鼠肺内皮细胞（MLEC）的影响[27](图S1)小鼠胸腺内皮瘤（tEnd）细胞和原代人脐静脉衍生内皮细胞（HUVEC）。我们首先研究了基础条件下这些细胞中NOX1的表达水平，以及对血管生成因子VEGF或bFGF以20 ng/ml刺激3小时的反应。定量实时PCR显示血管生成刺激后所有内皮细胞中NOX1 mRNA表达上调2-3倍(图2a-c). 在VEGF或bFGF刺激下，NOX4和NOX2的表达没有改变（数据未显示）。当内皮细胞NOX4表达水平较高时，发现NOX2非常低。

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血管生成刺激上调NOX1的表达和活性。

用20 ng/ml的VEGF或b-FGF刺激小鼠原代肺内皮细胞（MLEC，a）、HUVEC（b）和小鼠内皮瘤细胞系（c）3小时后，通过实时定量PCR检测NOX1的表达。NOX1 mRNA的数量被归一化为看家基因、小鼠细胞微管蛋白和人类细胞β2-微球蛋白的数量，±s.e.m，n=3。NOX1的活性通过使用MLEC（d，g）、HUVEC（e，h）和小鼠内皮瘤（f，i）上的DHE底物进行ROS测量来评估。VEGF和b-FGF刺激以NOX1依赖的方式上调ROS生成。g、 h，i.图表显示了在有或无VEGF或b-FGF的情况下刺激的内皮细胞中ROS水平的量化。g.MLEC WT（黑色条）、MLEC WT+GKT136901（灰色条）、MLEC NOX1KO（白色条）。h.未经处理的HUVEC（黑色条）或用10µM的GKT136901处理的HUVEC（灰色条）。i.未经处理的小鼠内皮瘤细胞系（黑条），用10µM（灰条）的GKT136901处理，用NOX1 siRNA处理（白条）。使用Student t检验，结果以倍数增加±s.e.m表示，n=3.*p<0.05，***<0.001。

接下来，我们分析了小鼠和人类内皮细胞对VEGF和bFGF刺激的反应中ROS的产生。正如预期的那样，这些因素增加了细胞内ROS水平(图2g–i)在NOX1缺乏的MLEC中，对VEGF或bFGF刺激产生的活性氧缺乏或严重受损(图2d，g). 这与NOX4缺乏形成对比，NOX4不足不影响VEGF或bFGF诱导的ROS生成。这些数据与NOX1沉默后内皮细胞产生的活性氧不足一致(图2i和数据未显示）。此外，经药理性NOX抑制剂GKT136901处理的细胞在VEGF或bFGF刺激后未诱导ROS(图2d-i). 通过筛选130000多个分子，确定了特异性NADPH氧化酶抑制剂GKT136901[28]在NOX亚基特异性无细胞系统中[29],[30]，GKT136901以高亲和力（Ki=160±10nM）抑制NOX1，类似于不可逆的黄素蛋白抑制剂二苯基碘鎓（DPI；Ki=70±10nM）(图3a). 然而，DPI对NOX4（Ki=70 nM）、NOX2（Ki=70nM）和黄嘌呤氧化酶（Ki=50 nM）的效力相同。相反，GKT136901对NOX1和NOX4更具特异性，对NOX2的效力低十倍（Ki=1530±90 nM），对黄嘌呤氧化酶几乎没有亲和力（Ki>100µM）(图3b和图S2). 此外，GKT136901完全抑制NOX1和NOX4的氧化酶活性，但对NOX2只有部分影响(图S2). 为了证明GKT136901对NOX酶的特异性，对135个不同靶点进行了药理学分析，包括ROS生成酶和氧化还原敏感酶[31]GKT136901在10µM下表现出低抑制或无抑制，表明该化合物具有高度的特异性(表S1)。

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GKT136901抑制NOX1依赖性ROS生成。

（a） 从NOX1过表达细胞制备的膜上GKT136901（）和DPI（x）的浓度响应曲线。结果代表了四分之一的实验，共进行了三次。数值表示为平均值±s.e.m.（b）GKT136901和DPI对NOX1、NOX2、NOX4和黄嘌呤氧化酶的亲和力。GKT136901是一种NADPH-氧化酶特异性抑制剂，对NOX1和NOX4的选择性高于NOX2，而DPI以相同的效力抑制所有测试的NADPH氧化酶。

综上所述，NOX1缺陷细胞和抑制剂GKT136901的结果表明NOX1负责血管生成前因子VEGF或bFGF刺激的内皮细胞中ROS的产生。

NOX1介导内皮细胞迁移和萌发

血管生成需要内皮细胞增殖、发芽和迁移[5]为了确定血管生成中的NOX1依赖步骤，我们进行了不同的在体外功能分析。NOX1缺乏的MLEC和NOX1沉默的细胞的细胞增殖没有改变（数据未显示）。然而，与WT细胞相比，NOX1缺乏动物MLEC的细胞迁移和管形成显著减少(图4a、d). 我们还观察到NOX1抑制剂GKT136901对MLEC内皮细胞迁移和管形成的抑制作用(图4)和依赖NOX的ROS阻断剂(图S3)[32],[33]此外，在小鼠和人类内皮细胞中使用siRNA沉默NOX1表达显著减少了迁移（迁移面积分别减少17%±5.7和24%±3.8）和管状结构的形成（骨骼长度分别减少28%±4.8和34%±14）(图4c、e和f). 我们没有观察到来自NOX4缺乏小鼠的MLEC或使用siRNA沉默NOX4的细胞对迁移或管形成的抑制作用(图4a、c、d和f)。

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NOX1抑制阻断内皮细胞迁移和管状结构的形成。

通过创伤愈合试验分析小鼠原代内皮细胞（a）、人原代内皮细胞核（b）和内皮瘤细胞系（c）的体外迁移。通过三维培养小鼠原代内皮细胞（d）、人原代血管内皮细胞（e）或内皮瘤细胞系（f）来测量管状结构的形成。使用Student t检验，结果以控制±s.e.m的%表示，n=3.*p<0.05，**p<0.01，***<0.001。GKT136901的使用浓度为10µM。

此外，使用NOX1表达载体，我们观察到NOX1过度表达（三倍增加）足以增加内皮瘤细胞的迁移和管状结构的形成(图S4)。

这些实验表明，NOX1是一种参与内皮细胞迁移和管状结构形成的重要蛋白，在细胞增殖中没有明显作用。

NOX1下调PPARα表达

PPARα是一种具有抗炎功能的核激素受体，能够阻断VEGF的血管生成活性[23],[34],[35]我们观察到NOX1缺失的MLEC表达的PPARα比WT MLEC高5倍(图5a)，而PPARγ表达无差异（数据未显示）。在NOX1沉默的内皮细胞系中也观察到PPARα表达的这种上调(图5a)并且依赖于PPARα转录激活。事实上，当NOX1沉默的细胞与PPARα拮抗剂GW6471孵育时，不再观察到PPARα上调（数据未显示）。这表明NOX1缺陷内皮细胞中观察到的迁移和管形成缺陷可能依赖于PPARα表达和转录活性的上调。

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NOX1负调节PPARα的表达和活性。

NOX1缺乏导致PPAR上调α内皮细胞中促血管生成信号的表达和抑制。（a） ●●●●。PPAR表达水平α在MLEC和内皮瘤细胞系中通过定量实时PCR，归一化为微管蛋白表达。（b–c）PPARα拮抗剂GW6471补偿了MLEC中的NOX1缺乏。（b） ●●●●。存在或不存在PPAR时NOX1缺陷MLEC的迁移α拮抗剂（10µM）。（c） ●●●●。存在或不存在PPAR时NOX1缺陷MLEC的管状结构形成α拮抗剂（10µM）。在没有NOX1的情况下，VEGF和b-FGF诱导的NFκb核转位受到抑制，并且依赖于PPARα活动。（d） ●●●●。Western blot分析用VEGF和bFGF（20 ng/ml）刺激30分钟后WT和NOX1缺陷细胞的细胞核和细胞质部分的p65 NFκB。（e） ●●●●。在用VEGF和bFGF刺激之前，用Western blot分析经或不经10µM GW6471处理的NOX1-silenced细胞的细胞核和细胞质部分中的p65 NFkB。图中显示了通过密度测定法测定的细胞核p65 NF-κB相对于细胞质p65 NFκB±s.e.m的丰度。n=3.*p<0.05，**p<0.01（学生t检验）。

为了验证这一假设，我们用PPARα拮抗剂GW6471处理NOX1缺陷的MLEC，发现与未处理的NOX1缺失细胞相比，该化合物恢复了细胞迁移和管形成(图5b–c). 此外，从PPARα缺陷小鼠中分离的PPARα缺陷内皮细胞比WT内皮细胞迁移更多。正如预期的那样，在PPARα缺陷细胞中使用抑制剂GKT136901抑制NOX1并不影响内皮细胞的迁移或侵袭（数据未显示）。

总之，这些结果表明NOX1通过抑制PPARα的表达和活性促进内皮细胞迁移和萌发。

NOX1通过抑制PPARα促进NF-κB活化以应对血管生成刺激

然后，我们着手进一步确定与血管生成相关的血管NOX1信号通路。在用血管生成因子bFGF刺激10分钟后，观察到Akt和ERK1/2的激活。在NOX1缺乏的MLEC中，与WT细胞相比，Akt活化降低，而ERK1/2活化不受影响(图S5). 这些结果表明，NOX1参与激活Akt信号通路以响应bFGF。由于NOX1抑制PPARα的表达，这也与文献中描述的PPARα是通过阻断Akt而非ERK1/2激活来抑制VEGF信号的抑制剂相一致。

由于已知PPARα抑制NF-κB活化，我们监测了NOX1缺陷MLEC对VEGF或bFGF刺激的反应（30分钟）中NFκB的活化。NOX1缺陷的MLEC与WT细胞相比，在对VEGF或bFGF的反应中，NF-κB p65亚单位的核转位减少，如内皮细胞核提取物和免疫荧光的Western blotting所示(图5d和图S6). 利用内皮细胞系，我们证明NF-κB易位的抑制依赖于PPARα的激活。事实上，在NOX1诱导的细胞中，PPARα的表达上调(图5a). 当这些细胞在血管生成刺激前用PPARα拮抗剂GW6471处理时，不再观察到NF-kB核移位缺陷(图5e和图S6). 此外，在NOX1缺陷细胞中，PPARα和NF-κB靶基因被解除调控(表1). 例如：血管NOX1缺乏导致抗氧化基因过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶-3和抗迁移基因VE钙粘蛋白上调，同时下调促血管生成基因MMP2、MMP9、uPAR、VEGF和bFGF。将NOX1沉默的细胞与PPARα拮抗剂GW6471孵育可阻断这种作用，表明这些调控依赖于PPARα活性(表1)。

表1

NOX1缺乏调节的基因表达。
LMEC NOX1 KO公司t结束siRNA NOX1t结束siRNA NOX1+GW 6471
过氧化氢酶 1.52±0.29 1.52±0.19 0.92±0.012
GPX3系列 1.47±0.08 1.49±0.13 0.70±0.01
VE-卡德林 2.29±0.07 1.54±0.28 0.9±0.2
基质金属蛋白酶-2 0.43±0.24 0.97±0.10 2.13±0.24
基质金属蛋白酶-9 0.29±0.13 0.89±0.13 0.47±0.07
uPAR公司 0.41±0.12 0.76±0.19 1.34±0.6
血管内皮生长因子 0.31±0.05 2.04±0.29 0.68±0.04
碱性成纤维细胞生长因子 0.71±0.21 0.81±0.13 0.64±0.25
VCAM-1型 0.84±0.01 0.76±0.04 0.57±0.18
通过定量实时PCR分析NOX1缺陷原代内皮细胞（MLEC）或沉默细胞内皮细胞系中靶基因的表达水平，与对照细胞相比。结果以倍数增加或减少±s.e.m.n=3表示。

宿主NOX1促进肿瘤血管生成和肿瘤进展

上述发现促使我们研究NOX1是否通过促进肿瘤血管化而促进肿瘤进展。为此，我们将致瘤B16F0黑色素瘤细胞或Lewis肺癌（LLC1）细胞皮下植入WT和NOX1缺乏小鼠。与B16F0细胞相比，LLC1细胞表达高水平的NOX1。我们观察到患有B16F0黑色素瘤但没有LLC1肿瘤的NOX1缺乏动物的肿瘤血管减少(图6a–b)。

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抑制NOX1可减少肿瘤生长和血管生成。

将B16F0（a）或LLC1（b）肿瘤细胞皮下注射到WT或NOX1-KO小鼠体内。允许肿瘤生长10天，通过测量阳性（血管）面积和总（肿瘤）面积±s.e.m（以百分比表示），用PECAM-1染色鉴定肿瘤血管密度。n=8；注射LLC1肿瘤细胞的WT小鼠口服NOX抑制剂GKT136901（40 mg/kg/天）8天；（c） ●●●●。图表以mg±s.e.m表示肿瘤重量，每组n=8。（d） ●●●●。（c）中实验得出的肿瘤血管密度。图中显示肿瘤血管化，以PECAM-1阳性面积±s.e.m.的百分比表示。；（e） ●●●●。肿瘤体积变化（单位：mm）三在肿瘤细胞注射GKT136901（黑箭头）或抗VEGFR2（DC101）（尖箭头）后8天开始治疗后。用卡尺测量肿瘤体积，公式V=4/3π（L/2*L/2*w/2）。n=8；（f） ●●●●。来自（e）中实验的肿瘤中的血管密度。第12天。图表显示肿瘤血管化以PECAM-1阳性面积±s.e.m.WT或PPAR的百分比表示α注射B16F0（g）或LLC1（h）的KO小鼠随后用NOX抑制剂GKT136901以40mg/kg/天通过口服给药处理8天。图表显示肿瘤血管化以PECAM-1阳性面积±s.e.m.的百分比表示，n=6.*p<0.05，**p<0.01（学生t检验）。

为了评估NOX1是否是癌症治疗的一个有价值的靶点，我们使用了抑制剂GKT136901。该抑制剂不干扰肿瘤细胞增殖和凋亡在体外但它影响了他们的活性氧生成活动(图S7). LLC1注射后第1天，荷瘤小鼠每天口服GKT136901，剂量为40 mg/kg。治疗一周后，GKT13901治疗小鼠的肿瘤大小比车用治疗小鼠小34%±5.8(图6c). 如图S8通过PECAM-1免疫染色对肿瘤血管进行量化，结果显示GKT136901治疗的肿瘤与溶媒治疗的动物相比，血管面积减少了59%±9.3(图6d). 此外，我们用GKT136901或抗血管内皮生长因子R2抗体DC101作为阳性对照，对患有既定肿瘤的动物进行治疗试验（即在肿瘤植入后8天开始）。治疗期间每天测量肿瘤体积。两种治疗都延迟了肿瘤进展（分别为35%±5.7和35%±9.7）和血管形成（分别为36%±16和43%±20）(图6e、f). 根据这些结果，我们得出结论，NOX1在促进肿瘤血管生成和肿瘤进展方面发挥着关键作用。

进一步分析NOX1和PPARα之间的联系体内，我们在WT或PPARα缺陷小鼠中注射LLC1或B16F0肿瘤细胞，并用NOX1抑制剂GKT136901治疗这些动物。通过PECAM-1免疫染色分析这些肿瘤的血管化。在WT小鼠中，该抑制剂阻断了LLC1和B16F0肿瘤血管化（100%±24vs 65%±13和100%±15vs 64%±14），而在PPARα缺陷小鼠中无作用（100%±17vs 129%±23和100%±26vs 98%±24）(图6g，h)。

从这些观察结果中，我们得出结论，NOX1通过抑制抗血管生成因子PPARα促进肿瘤血管生成。

讨论

活性氧是癌症生物学中的重要角色[36]——[38]在较高水平上，它们诱导细胞凋亡和/或衰老，而在稳态水平上，则影响存活和增殖。在肿瘤内皮细胞中，NOX酶通过ROS依赖机制促进血管生成，从而促进肿瘤生长。在本研究中，我们表明血管NOX1，而不是NOX2或NOX4，是血管生成的重要调节器，通过调节内皮细胞迁移和管形成。我们进一步确定NOX1活性抑制抗炎核激素受体PPARα作为介导这些效应的关键机制(图7)。

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NOX1在肿瘤血管生成中的作用示意图。

（a） 肿瘤细胞和肿瘤浸润白细胞在肿瘤发展过程中产生促血管生成因子，如VEGF和bFGF。这些因素通过发芽、迁移和增殖激活原有血管形成新血管。（b） 内皮细胞通过将血管生成因子固定在表面受体上接受血管生成刺激。此交互启动信号级联，从而通过Rac1激活NOX1。NOX1依赖性ROS抑制核激素受体PPARα通过翻译后修饰和转录调控。这种抑制导致NF-κB活化和血管生成因子如基质金属蛋白酶、生长因子或迁移分子的转录。

抑制NOX1可减少内皮细胞迁移。NOX1、ROS和细胞迁移之间的联系先前已经在非内皮细胞如结肠癌细胞系中进行了描述[39]此外，Schröder等人报告说，阻断NOX1通过NOX1依赖的ROS激活JNK减少FGF刺激的平滑肌细胞迁移，而JNK反过来磷酸化paxillin[40]。调节平滑肌细胞迁移可能不仅限于NOX1，因为NOX4表现出类似的作用[41]然而，这些相互矛盾的数据可能是由于bFGF和PDGF分别激活平滑肌细胞的不同模式。根据这些数据，很明显NOX1和衍生的ROS产物阻碍血管平滑肌和肿瘤细胞的迁移。NOX1在内皮细胞迁移和血管生成中的作用以前被忽视，这可能是因为在静息状态的内皮细胞中，NOX1表达水平较低，并且仅在血管生成转换期间上调，正如我们在本研究中所示。

重要的是，我们没有发现其他测试的NOX亚型2和4参与bFGF诱导的体内血管生成的证据。这与其他报告相反，这些报告表明NOX亚型具有血管生成作用。血管生成素-1、血管内皮生长因子或凝血酶在体内外诱导的新生血管已被认为依赖于NOX2[42]——[45]此外，最近的一项研究表明，NOX4和NOX2特异性抑制剂阻断了体内血管瘤（即内皮细胞源性肿瘤）的生长[33]其他实验室发现NOX4负责基础内皮活性氧的产生和细胞增殖[46]NOX2和NOX4在血管生成中的功能可能取决于刺激类型，并通过与NOX1不同的机制进行操作，因为这两种酶都参与内皮细胞增殖，而NOX1介导内皮细胞迁移和萌发，而不是增殖。

我们的结果揭示了NOX亚型的显著特异性。很明显，内皮细胞表达NOX1、NOX2、NOX4，并且——至少在人类中——也表达NOX5。然而，它们的功能似乎是非冗余的。NOX亚型的特异性依赖于几种元素，包括不同的亚细胞定位（NOX4主要位于细胞内，而NOX1则定位于小窝[47])不同的激活机制（NOX4表现为组成性激活，而NOX1和NOX2依赖于激活，[10],[48])，并且NOX mRNA在对给定刺激的反应中也存在异构体特异性上调。很可能有三种元素对NOX1在血管生成中的独特作用有贡献：i）其在小窝内的定位接近其他信号分子，ii）为了介导VEGF信号，它应该是一种激活诱导酶，而不是组成活性的酶，如NOX4；和iii）如图2，其mRNA确实对VEGF有上调反应，这增加了系统的特异性。因此，我们的研究提供的对哪些NOX亚型与血管生成相关的理解增加了对氧化还原生物学的新理解。然而，精确识别特定病理生理过程中涉及的NOX亚型也将是开发特定靶向NOX抑制剂的关键[49]。

在肿瘤生长方面，我们观察了NOX1缺乏小鼠和接受NOX抑制剂治疗的野生型小鼠之间的差异。事实上，虽然NOX1缺乏小鼠和NOX抑制剂可有效降低栓塞和肿瘤诱导的血管生成，但后者在降低肿瘤生长方面明显更有效。这种差异最可能的解释是肿瘤细胞内的NOX酶有助于肿瘤生长，NOX抑制剂以这些酶为靶点。事实上，文献中有大量证据表明NOX酶在促进肿瘤细胞生长中的作用[50]——[53]此外，我们发现缺乏内源性NOX1表达的B16肿瘤的血管化显著减少，而NOX1缺失的小鼠中表达NOX1的LLC1肿瘤通常血管化。这种明显的差异与文献一致，表明外源性活性氧对内皮细胞增殖、迁移和管形成的影响[54]——[56]诱导血管生成可能是由于LLC1肿瘤表达NOX1，在肿瘤微环境中产生大量ROS并调节内皮细胞功能。这一数量的活性氧似乎足以刺激内皮细胞增殖和迁移，在肿瘤内形成新血管。在GKT136901治疗的小鼠中，肿瘤细胞不能刺激ROS介导的血管生成，因为抑制剂也阻止LLC1肿瘤细胞产生ROS(图S6c). NOX1缺乏小鼠和NOX抑制剂之间的另一个明显区别是，除NOX1外，GKT136901还能有效抑制NOX4。这一点特别相关，因为之前的研究表明NOX4与血管生成机制有关。为了理解这些明显的差异，血管生成反应应细分为缺氧组织的近端反应（HIF1α激活和VEGF生成）和内皮细胞的远端反应（VEGF诱导新生血管）。我们的结果(图1)明确证明NOX4不参与内皮细胞的远端反应。然而，我们的研究结果并不反对NOX4在缺氧组织近端反应中的作用。事实上，根据文献[57],[58]，我们认为NOX4可能发挥这种作用。

在稳态条件下，活性氧水平由清除剂和抗氧化酶平衡。正如在某些病理学中一样，这种平衡被解除了管制，并已投入大量精力开发ROS生成抑制剂[59]由于大多数与ROS相关的疾病仅由一种NOX亚型介导，因此具有亚型特异性的新型抑制剂将是非常宝贵的。为此，开发了新型GenKyoTex抑制剂GKT136901，该抑制剂似乎对具有类似亲和力的NOX1和NOX4具有特异性。在体外，该抑制剂阻断由促血管生成因子诱导的活性氧生成，并抑制内皮细胞迁移。更重要的是，这种抑制水平与NOX1缺陷细胞中观察到的水平相当。然而，对于NOX4缺乏的内皮细胞，我们没有观察到迁移减少。从这些数据中我们得出结论，内皮细胞迁移是NOX1依赖性和NOX4非依赖性的。此外，还证明了GKT136901作为NOX1/4特异性抑制剂在预防肿瘤血管生成中的潜力。

当NOX1不表达时，我们观察到PPARα表达增加；表明NOX1活性构成性抑制PPARα表达。如前所述，在没有NOX1表达的情况下，内皮细胞迁移和形成管状结构的能力较差，我们表明使用PPARα拮抗剂可以逆转这种作用。此外，在NOX1缺陷的内皮细胞中，VEGF或bFGF刺激后，NFκB没有被激活。用PPARα拮抗剂治疗可逆转这种效应。此外，NOX-1缺乏可上调抗氧化剂和抗迁移基因，下调促血管生成基因。这些基因表达的差异取决于PPARα反式激活，它们解释了NOX1缺陷内皮细胞迁移表型和管形成的减少。PPARα活性本身控制PPARα的表达，可以通过NOX1的催化活性直接调节。事实上，PPARα活性是由一些转录后修饰（如磷酸化或SUMO化）调节的[60],[61]，可能对ROS敏感[62]先前已经证明ROS可以灭活磷酸酶[63],[64]并激活SUMO化[62],[65]因此，上调NOX1缺陷细胞中PPARα的表达和活性可阻断内皮细胞迁移、发芽和血管生成所需的血管生成信号。

目前，抗血管内皮生长因子抗体贝伐单抗（Avastin）和几种小分子VEGFR酪氨酸激酶抑制剂被用作治疗晚期癌症患者的抗血管生成药物[66],[67]抗血管生成治疗以非转化内皮细胞为靶点，导致向肿瘤细胞输送营养物质和氧气的减少。然而，为了获得生存优势，需要同时进行化疗。新的证据表明，经抗血管生成治疗的肿瘤通过诱导替代性血管生成因子的产生而引起代偿反应。因此，出现了一个问题，即抗NOX治疗是否可能成为抗VEGF治疗的补充治疗方法。事实上，在血管生成转换期间，NOX分子在血管内皮和肿瘤细胞中的表达受到诱导，并且使用强效NOX1抑制剂GKT136901抑制宿主和肿瘤细胞的NOX1，导致肿瘤血管生成和肿瘤生长减少。此外，NOX1似乎形成了一种常见的血管生成途径，至少在VEGF和FGF诱导的信号传导方面是如此。因此，抑制NOX1可以绕过抗VEGF治疗激活的潜在代偿机制。

总之，我们已经确定NOX1是一种新的血管生成介质，并且是癌症抗血管生成治疗的候选治疗靶点。

材料和方法

老鼠

NOX1、NOX2、NOX1/2、NOX4缺陷小鼠在C57BL/6J背景下近交6代以上。PPARα阴性动物最初描述于[68]所有动物程序均按照日内瓦动物护理机构伦理委员会和州兽医局的规定执行。日内瓦动物护理机构伦理委员会和州兽医局通过实验ID（31.1.1005-3456-0、1005-3325-1、1005-3229-2）特别批准了本研究。

细胞和试剂

内皮细胞系（胸腺衍生内皮瘤[69])在添加10%FCS、100 U/ml青霉素/链霉素和100 U/ml谷氨酰胺的Dulbecco改良Eagle培养基中培养。原代肺内皮细胞在补充20%FCS、100 U/ml青霉素/链霉素、100 U/ml谷氨酰胺、100µg/ml肝素（Sigma-Aldrich）、10µg/ml内皮细胞生长补充剂（Upstate）的DMEM/HAM F-12培养基中培养。从第4代到第6代使用MLEC。在实验室分离人脐静脉内皮细胞（HUVEC），在Bullet试剂盒（Lonza）中培养，并从第4代到第6代使用。明胶、纤维结合蛋白、纤维蛋白原和抑肽酶是从Sigma Aldrich获得的。生长因子降低的Matrigel来自Becton Dickinson。小鼠和人bFGF、人和鼠VEGF来自Peprotech。抗磷酸化p42/44 MAPKinase、总MAPKinase、磷酸化Thr308 Akt和总Akt的抗体购自Cell Signaling Technology。NF-kB p65抗体购自SantaCruz Biotechnology，抗肌动蛋白抗体由Christine Chaponnier博士善意提供。DC101水螅是从ATCC（弗吉尼亚州马纳萨斯）购买的，DC101抗体在洛桑EPFL的蛋白表达设施中表达和纯化。

体内血管生成测定

7~10周龄雌性大鼠皮下注射400 ml的生长因子减少型Matrigel，并补充500 ng/ml的bFGF。一周后，使用Micro-CT（Skyscan-1076）对小鼠进行扫描。在经眶后注射400ml碘化脂质体（BR22，BracoResearch，Plan les Ouates）之前和之后对小鼠进行扫描，以观察塞子中的血管密度，如前所述[70],[71]。

MLEC隔离

如前所述分离小鼠肺内皮细胞[27]简单地说，用0.1%的I型胶原酶（Gibco）消化整个小鼠肺。将消化肺置于明胶/胶原蛋白/纤维连接蛋白涂层烧瓶上，在DMEM/HAM F-12培养基中添加20%的FCS、100 U/ml青霉素/链霉素、100 U/ml谷氨酰胺、100µg/ml肝素（Sigma-Aldrich）、10µg/ml内皮细胞生长补充剂（Upstate）。第二天，使用大鼠抗鼠FcgRII/III抗体结合抗鼠包被磁珠（Dynal），通过阴性选择从培养物中去除巨噬细胞。然后使用内皮标记物PECAM-1对细胞进行两次阳性筛选(图S3)。

定量RT-PCR

使用RNeasy minikit（Qiagen）提取处理细胞的总RNA。用上标III第一链RT-PCR试剂盒（Invitrogen）逆转录总RNA。在第一步加实时PCR机器（Applied Biosystems）上，使用SybrGreen主混合液（应用生物系统）进行定量实时PCR。引物序列列在材料和方法S1。

超氧化物检测

内皮细胞接种在玻片上，并用二氢乙锭（DHE）染色。使用倒置显微镜捕获图像，并使用Metafluor成像软件（MDS Analytical Technologies）进行分析。通过测量每片至少50个内皮细胞的荧光强度进行量化。

GKT136901无细胞检测中的NOX抑制作用和药理特征

如前所述，从表达NOX2的PMN细胞或过度表达NOX1或NOX4的细胞制备膜[29]在超声缓冲液（11%蔗糖，120 mM NaCl，PBS中1 mM EGTA，NOX4表达细胞的pH值为7.4）或放松缓冲液（10 mM管道，3 mM NaCl，3.5 mM MgCl2，0.1 M KCl，pH值7.4）中重新悬浮后，通过超声破碎细胞并离心（200 g，10 min）。将上清液加载到17/40%（w/v）的不连续蔗糖梯度上并离心（150000 g，持续30分钟）。收集膜组分并将其储存在−80°C下。如前所述，测定了表达不同NOX亚基的膜的ROS生成量[30]使用Amplex Red方法（Invitrogen）。从未转染的细胞制备的膜没有显示NADPH诱导的ROS产生（数据未显示）。

基因沉默

对于小鼠细胞，使用Amaxa技术（Lonza）对siRNA进行核感染。通过定量RT-PCR评估核感染48小时后的基因沉默。对于HUVEC，使用Amaxa对shRNA载体（SABiosciences）进行核感染。通过定量RT-PCR评估核感染48小时后的基因沉默。

伤口愈合分析

如前所述进行伤口愈合分析[72]简单地说，内皮细胞被镀在Matrigel（Becton Dickinson）预涂96孔板中。电镀一天后，细胞单层被刮伤，形成一个规则的伤口。细胞可以在夜间迁移。然后使用Metamorph程序（MDS Analytical Technologies）测量并计算迁移面积。

内皮细胞发芽试验

如前所述进行发芽试验[72]简单地说，内皮细胞被镀在96孔板中，每孔8000个细胞，在3D纤维蛋白凝胶中。在凝胶上方，含有10%FCS的DMEM被200 KIU/ml抑肽酶（Sigma）补充。使用变形程序评估分支的长度。结果以骨架长度/细胞数量的mm表示。

细胞核和细胞质提取

刺激后，根据Tauzin等人。[73]简单地说，细胞在TKM缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.4，25 mM KCl，5 mM MgCl）中培养2和1 mM EGTA），含1%Triton和蛋白酶抑制剂混合物CLAP[10µg/ml凝乳抑素、亮氨酸蛋白酶、安替比林和胃蛋白酶抑素A（Sigma）在冰上30分钟，超声2分钟，5000 g离心30分钟。将颗粒和上清液分离并溶解在样品缓冲液中。

蛋白质印迹

将细胞刺激指定的时间，然后在TNT缓冲液（50 mM Tris，150 mM NaCl，0.5%Triton X-100）中溶解，并辅以蛋白酶抑制剂混合物CLAP和磷酸酶抑制剂混合物[25 mM NaF，20 mMβ-磷酸甘油酯，5 mM HEPES，2.5 mM EDTA，0.5 mM正钒酸]。在含有0.5%BSA的PBS中封闭膜，并与不同抗体杂交。用过氧化物酶偶联二级试剂（Jackson Immunoresearch）显示印迹，然后用ECL，并用Image J软件通过密度测定进行定量。

肿瘤生长测定

五点一零5在小鼠背部皮下注射LLC1或B16F0。用NOX抑制剂GKT136901或载体（羧甲基纤维素，CMC）每天40 mg/kg口服或静脉注射，抗VEGFR2抗体（DC101）每2天0.8 mg。当对照肿瘤长约1厘米时，处死小鼠，切除肿瘤，称重并冷冻。用抗PECAM-1抗体（大鼠单克隆抗体、，[74])。

统计分析

所有统计分析均采用多变量分析的Anova和成对分析的Student t检验*（p=0.05），**（p=0.01），***（p=0.001）。

支持信息

表S1

抑制剂GKT 136901对ROS生成酶、氧化还原敏感酶和其他蛋白质的抑制作用。

（0.03 MB文件）

图S1

从WT和NOX缺陷小鼠中分离MLEC。a.分离的MLEC上内皮表面分子的流式细胞术分析。MLEC中PECAM-1、VE-Cadherin、ICAM-2和Meca-32的表达水平。b.WT、NOX1-KO和NOX4-KO MLEC的PECAM-1免疫荧光染色。蓝色的细胞核（DAPI）和紫色的PECAM-1（Cy5）。使用40x/1.3数字孔径透镜采集图像，并使用LSM510 Meta显微镜（卡尔蔡司）进行分析。

（6.76 MB TIF）

图S2

GKT136901和DPI对NOX依赖性ROS生成的抑制作用。a.GKT136901对NOX1（x）、NOX2（λ）、NOX4（ξ）和黄嘌呤氧化酶（XO）（□）的浓度响应曲线。b.DPI对NOX1-（x），NOX2。数值以平均值±标准误差表示。

（2.02 MB TIF）

图S3

NOX依赖性ROS阻断剂可有效阻断内皮细胞迁移和分支能力。a.通过伤口愈合试验分析内皮细胞在不同抑制剂存在下的迁移情况，这些抑制剂阻止NADPH依赖性ROS的生成。b.管状结构的形成是通过使用小鼠内皮细胞系在存在不同抑制剂的情况下进行三维培养来测量的，这些抑制剂可以阻止NADPH依赖性ROS的产生。结果以控制±s.e.m的%表示，n=3。

（5.89 MB畅通节能法）

图S4

NOX1过表达增强了内皮细胞迁移和管状结构的形成。a.使用转染NOX1表达载体的内皮瘤细胞系，通过创伤愈合试验分析体外迁移。b.通过用表达NOX1的载体转染的内皮细胞瘤细胞系的3D培养来测量管状结构的形成。使用Student t检验，结果以控制±标准偏差的%表示*p<0.05。

（5.88 MB畅通节能法）

图S5

AKT但ERK 1/2激活受NOX1缺乏的影响。NOX1缺乏的MLEC在bFGF刺激后不会激活Akt，但ERK1/2激活没有差异。a.用20 ng/ml bFGF刺激10分钟后，对WT和NOX1缺陷MLEC中Akt磷酸化进行Western blot分析。该图显示了通过密度测定法测定的磷酸化Akt相对于总Akt±s.e.m的丰度。n=3.b.用20 ng/ml bFGF刺激WT和NOX1缺乏的MLEC 10分钟后ERK1/2磷酸化的Western blot分析。该图显示了通过密度测定法测定的磷酸化ERK1/2相对于总ERK1/2±s.e.m的丰度。n=3。

（6.13 MB畅通节能法）

图S6

NF-κB核转位在没有NOX1的情况下受到抑制，并且依赖于PPARα的激活。VEGF或b-FGF刺激内皮细胞可诱导p65 NF-κb移位至细胞核。NOX1缺陷细胞中未观察到这种核移位，但通过PPARα拮抗剂治疗（GW6471）可以恢复。在存在或不存在GW6471（10mM）的情况下，用VEGF或bFGF刺激MLEC（a）和内皮瘤细胞系（B）的免疫荧光、抗p65 NF-κB。NF-κB呈绿色（Alexa 488），细胞核呈蓝色（DAPI）。比例尺代表20 mm。图像是用一个40x/1.3数字孔径采集的，并使用LSM510共焦显微镜（卡尔蔡司）进行分析。

（7.09 MB TIF）

图S7

GKT 136901对肿瘤细胞的作用。a.与10μM GKT136901孵育24h后，通过EdU掺入和碘化丙啶染色检测LLC1和B16F0细胞增殖。b.用10μM GKT136901孵育24小时后，用AnnexinV/PI染色检测LLC1细胞凋亡。c.LLC1产生的ROS水平被GKT136901抑制。与10μM抑制剂孵育1h后，用DHE底物定量ROS生成。***p<0.001（学生t检验）。

（6.11 MB畅通节能法）

图S8

GKT 136901对小鼠器官无毒性作用。在8天内，以40 mg/kg/天的速度口服溶媒或溶媒加GKT136901抑制剂治疗的小鼠的心脏（a）、肾脏（b）、肝脏（c）和肺（d），并用血毒素/曙红染色。比例尺表示整张照片上的100μm，变焦上的20μm。使用20x/0.8数字光圈采集图像，并使用Mirax（卡尔蔡司）进行分析。

（8.38 MB畅通节能法）

材料和方法S1

实时PCR引物序列表。

（0.05 MB DOC）

致谢

我们要感谢C.Chaponnier（日内瓦中央医科大学）赠送的抗肌动蛋白抗体；N.Deblon（日内瓦中央医科大学）就PPARa提供建议；N.Imaizumi（CePO和洛桑大学，洛桑），感谢她在Matrigel塞子分析方面的协助；B.Lee（日内瓦中央医科大学）感谢他在手稿编辑方面的协助。

脚注

竞争利益：GKT136901正在申请专利，PP为发明人，GenKyoTex为专利所有人。PP、CS和K-HK持有GenKyoTex的股份。fulvene-5正在申请专利，JLA是发明者，埃默里大学是专利所有人。这并不会改变作者对所有PLoS ONE数据和材料共享政策的遵守程度。

基金：这项工作得到了瑞士癌症联盟KPS-OCS 01812-12-2005和瑞士国家科学基金会FNS-310030-120184的支持。这些资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。本研究也由GenKyoTex S.A.作为部分作者的雇主资助。该资助者参与了研究设计、数据收集和分析、出版决定或手稿准备。

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