免疫Lett。作者手稿；PMC 2011年2月7日发布。
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坏死细胞释放的内源性信号增强细菌内毒素的炎症反应
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拉巴·埃尔·梅扎延
一美国北卡罗来纳州温斯顿萨勒姆市医学中心大道维克森林大学医学院医学系，邮编：27157
穆罕默德·加扎尔
一美国北卡罗来纳州温斯顿萨勒姆市医学中心大道维克森林大学医学院医学系，邮编：27157
迈克尔·C·Seeds
一美国北卡罗来纳州温斯顿萨勒姆市医学中心大道维克森林大学医学院医学系，邮编：27157
查尔斯·麦考尔
一美国北卡罗来纳州温斯顿萨勒姆市医学中心大道维克森林大学医学院医学系，邮编：27157
斯蒂芬·德雷斯金
b条科罗拉多大学健康科学中心医学系，美国科罗拉多州丹佛市东九大道4200号，邮编80262
马克·尼科尔斯
b条科罗拉多大学健康科学中心医学系，美国科罗拉多州丹佛市东九大道4200号，邮编80262
一美国北卡罗来纳州温斯顿萨勒姆市医学中心大道维克森林大学医学院医学系，邮编：27157
b条科罗拉多大学健康科学中心医学部，美国科罗拉多州丹佛市东九大道4200号，邮编80262
*通讯作者：美国北卡罗来纳州27157温斯顿萨勒姆市医学中心大道维克森林大学医学院分子医学部电话：+1 336 716 8622；传真：+1 336 716 1214。ude.cmbufw@azzaglem（加扎先生） 摘要
处于坏死状态的应激细胞释放出作为内源性危险信号的分子，以提醒和激活先天免疫细胞。HMGB1和HSP70均在活化的单核细胞/巨噬细胞中诱导，也从应激或损伤的细胞中释放。我们研究了坏死单核细胞/巨噬细胞释放的HMGB1和HSP70是否可以作为危险信号，介导对细菌内毒素或脂多糖（LPS）的促炎细胞因子反应。我们发现，从坏死细胞中获得的细胞裂解物直接刺激人类单核细胞/巨噬细胞细胞系THP-1中的促炎细胞因子和趋化因子反应，如TNF-α、IL-6和IL-8 mRNA表达和蛋白生成的诱导所示。在存在LPS的情况下，坏死细胞裂解物诱导所有三种蛋白质的更强劲增长。我们发现HMGB1和HSP70确实存在于坏死细胞裂解物中，并对促炎细胞因子表达的显著诱导起作用，当用两种蛋白的抗体中和时，可以阻止LPS刺激的细胞与坏死细胞裂解物孵育后细胞因子生成的增加。我们还发现，髓系细胞表达的新识别的触发受体1（TREM-1）参与调节HMGB1-和HSP70诱导的细胞因子产生。用重组嵌合体阻断THP-1细胞上的TREM-1可阻止细胞因子产生的增加，而同时阻断TLR4和TREM-1则完全消除了促炎反应，表明TREM-1与TLR4协同调节来自坏死细胞的此类信号的作用。此外，同时阻断HMGB1或HSP70和TREM-1并没有进一步降低细胞因子水平，证实TREM-1参与调节HMGB1和HSP70的作用。尽管HMGB1和HSP70与TREM-1的相互作用诱导了IκBα和p38的表达，而这两者都是炎症细胞因子表达所必需的，但如Western blot分析所示，阻断TREM-1并不影响IκBα的表达，而是显著降低了p38的激活。总之，这些结果表明，坏死细胞释放的HMGB1和HSP70作为内源性危险信号，增强单核细胞/巨噬细胞的促炎反应，并且TREM-1将这些信号传递给细胞因子表达级联。这种机制可能有助于细菌感染炎症反应的放大和持续。
关键词：内源性信号、HMGB1、HSP70、细胞因子、炎症、巨噬细胞
1.简介
众所周知，最佳免疫反应是在有佐剂的情况下产生的[1,2]。在感染中，细菌脂多糖等微生物成分提供了这种佐剂，可以增强对树突状细胞（DC）和巨噬细胞等固有免疫细胞的刺激[1,三]产生细胞因子和炎症介质。然而，在某些情况下，免疫反应可以在缺乏外源性佐剂的情况下发生，例如在自身免疫和肿瘤反应中。这导致了一种假设，即细胞应激或死亡可能导致释放内源性危险信号，这些信号作为佐剂刺激免疫反应。先前的研究表明，例如，树突状细胞对承受压力或坏死死亡的细胞释放的内源性危险信号作出反应[4]。当与坏死但非正常细胞共同培养时，树突状细胞被激活[5]。最近，已经证明，与抗原共同注射到动物体内的垂死细胞为激活T细胞反应提供了佐剂作用[6,7].
先前的研究表明HMGB1蛋白是炎症和内毒素致死的晚期介质[8,9]。HMGB1由LPS刺激的单核细胞/巨噬细胞释放[8]。它也可以从受伤或坏死的细胞中释放出来，在那里它刺激坏死诱导的炎症[9]。重组HMGB1在体外激活单核细胞并诱导释放促炎介质，包括TNF-α、IL-6和IL-8[10]HMGB1抗体可防止内毒素诱导的致死[8]。HSP70属于热休克蛋白家族，在正常生理条件下低水平表达[11]，但由细菌内毒素和其他促炎因子等应激刺激显著诱导[12]。尽管包括HSP70在内的热休克蛋白的主要功能是稳定蛋白质折叠，但人们对其免疫功能越来越感兴趣。例如，创伤患者和感染性休克儿童的HSP70水平升高[13]。此外，外源性表达的HSP70刺激人单核细胞的炎症反应，上调IL-6、IL-1β和TNF-α的表达[14].
大多数关于HMGB1和HSP70促炎作用的研究要么使用纯化的重组蛋白，要么使用在转染细胞中异位表达的蛋白。我们假设坏死细胞释放的HMGB1和HSP70可能作为内源性危险信号直接调节促炎细胞因子级联。使用人类单核细胞/巨噬细胞样细胞THP-1，我们确定HMGB1和HSP70为两种此类信号，并确定它们在TREM-1介导的单核细胞和巨噬细胞对细菌内毒素的反应中的作用，细菌内毒素是导致慢性炎症的原因。
2.材料和方法
2.1. 细胞培养和治疗
人类单核细胞系THP-1和U-937是从美国型培养物收集中心（弗吉尼亚州马纳萨斯）获得的。将细胞维持在补充有2mM的RPMI 1640培养基（Invitrogen，Carlsbad，CA）中我-谷氨酰胺、10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100µg/ml链霉素（Invitrogen），置于含5%CO的湿化培养箱中237°C时。在实验中，用0.5µg/ml革兰氏阴性细菌脂多糖（LPS，大肠杆菌055:B5；西格玛，密苏里州圣路易斯）。
2.2. 坏死诱导
细胞在1×10的完全培养基中培养6细胞/ml，并用0.5µg/ml LPS刺激，以驱动HMGB1和HSP70的表达。12小时后，用无菌PBS清洗细胞两次，然后在1×10的完整培养基中重新悬浮6此时，通过台盼蓝排除法测定的细胞存活率超过95%。通过重复（6个周期）用液氮冷冻并在37°C下解冻，立即将这些细胞用于坏死诱导。通过15000 rpm离心20 min获得坏死细胞裂解物（NCL）。
将50%（v/v）的NCL添加到新鲜培养的细胞中，即50%新鲜培养基和50%NCL，并将细胞密度调整为1×106细胞/ml。
2.3. 阻塞实验
为了研究TLR4、HSP70和HMGB1在NCL诱导促炎细胞因子中的作用，用8µg/ml抗TLR4（eBioscience，加利福尼亚州圣地亚哥）、抗HSP70（R&D Systems，明尼阿波利斯，明尼苏达州）或抗HMGB1（Abcam，剑桥，马萨诸塞州）抗体以及同型对照物处理培养物。为了研究RAGE和TREM-1受体在炎症细胞因子反应中的参与，分别以8和2µg/ml的浓度将抗RAGE抗体或重组TREM-1融合嵌合体（rTREM-1/Fc）（R&D系统）添加到培养物中。在用NCL重建培养物前1小时，添加所有抗体（包括同型对照）和重组蛋白。
2.4. 细胞因子和趋化因子分析
根据制造商的协议（明尼阿波利斯研发系统公司），使用ELISA试剂盒测定培养上清液中的TNF-α、IL-6和IL-8蛋白浓度。样品和已知标准品分两份进行分析。TNF-α、IL-6和IL-8的检测下限分别为5.1 pg/ml、0.7 pg/ml和7.5 pg/ml。
2.5. 定量实时PCR
使用TRIzol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA）从THP-1细胞中提取总RNA。RT反应在42°C下进行1小时，总体积为50µl，包含2µg RNA和上标逆转录酶II（Invitogen）。使用与人类TNF-α、IL-6和IL-8基因相对应的特异性引物和探针组进行实时PCR（Applied Biosystems，Foster City，CA）。每组包含两个引物和一个内部荧光探针，该探针用荧光染料羧基荧光素（FAM）标记为报告染料N、 N，N′，N′-四甲基-6-羧基罗丹明（TAMRA）作为猝灭染料，如下所示：TNF-α正向5′-TCTCTCGAACCGAGTGA-3′，反向5′-GGAGCTGCCTCAGCTT-3′，内探针5′-FAM-AGCTGAGCCATGTAGCACCT-TAMRA-3′；IL-6正向5′-CGACGTCTGTACTGTGAGT-3′，反向5′-ACTCCACGGTACGTAAA-3′，内探针5′-FAM-TAACCGCGTCAGCCCCCTGGTCAG-TAMRA-3′；IL-8正向5′-CTGGCTGTCTCTCTTG-3′，反向5′-CCTTGGCAAAACTGCACCTT-3′，内部探针5′-FAM-CAGCCTTCCTGATTTCTTGCAGCTCGT-TAMRA-3′。PCR反应重复进行。反应混合物（25µl）包含5µl cDNA、12.5µl 2×TaqMan通用母体混合物、400 nM每个引物和200 nM内部探针。使用ABI棱镜7700序列检测系统，反应条件为50°C下2 min、95°C下10 min和40个循环，在95°C和60°C下15 s和1 min（组合退火和延伸），该系统通过发射荧光分析实时监测扩增产物。作为内部对照，还扩增了GAPDH mRNA（使用GAPDH-TaqMan试剂盒；Applied Biosystems）。样品数据归一化为GAPDH mRNA，并以相对于培养基对照的折叠变化表示。
2.6. 蛋白质印迹分析
收获经处理或未经处理的细胞，在冷磷酸盐缓冲盐水（PBS）中洗涤一次，然后在含有50mM HEPES（pH 7.5）、150mM NaCl、1mM EDTA、1.5mM MgCl的缓冲液中裂解2、10%甘油、1%Triton X-100和100µg/ml PMSF。通过离心法清除细胞裂解物，并通过Bradford方法（加州Hercules Bio-Rad）测定蛋白质浓度。在等体积的样品缓冲液（125 mM Tris·HCl，pH 6.8，4%十二烷基硫酸钠，15%甘油和10%2-巯基乙醇）中煮沸等量（50µg）5分钟。将样品在冰上冷却，并在8-16%的凝胶（伊利诺伊州罗克福德皮尔斯市）上分离，然后使用Novex Xcell MiniGel系统将其电吸附到PVDF膜（伊利诺伊州罗克福德皮尔斯生物技术公司）上。隔夜用适当稀释的抗IκB、p38 MAPK和GAPDH的初级抗体对膜进行检测（加州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司）。用TBS/0.05%吐温20洗涤两次后，应用适当的过氧化物酶偶联二级抗体。印迹清洗两次，并在增强化学发光检测试剂中培养（Amersham Bioscience，Piscataway，NJ）。通过X射线胶片曝光，可以看到特定的条带。剥离膜并用磷酸化IκBα和p38（Santa Cruz）特异性抗体进行复制。
2.7. 数据分析
根据Student’st吨-测试。数据表示为至少三个独立实验的平均值（S.E.M.）的平均值±标准误差。第页<0.05被认为是显著的。
3.结果
3.1. 活化THP-1细胞产生促炎细胞因子和趋化因子
细菌内毒素诱导单核细胞/巨噬细胞产生促炎细胞因子[15,16]LPS已被证明能刺激单核细胞/巨噬细胞产生细胞因子TNF-α、IL-6和趋化因子IL-8[17,18,14]。为了证明LPS诱导THP-1中促炎细胞因子的能力，用0.5µg/ml的LPS刺激细胞6小时，并用ELISA测定培养上清中的TNF-α、IL-6和IL-8分泌。在这些条件下，LPS诱导的分泌(第页<0.05）TNF-α、IL-6和IL-8的数量().
LPS诱导THP-1细胞中促炎细胞因子和趋化因子的表达。用0.5µg/ml LPS刺激细胞6 h。用ELISA测定培养上清液中TNF-α、IL-6和IL-8蛋白的产生*第页与中等水平对照组相比，<0.05。
3.2、。坏死细胞裂解物在LPS存在下增加促炎细胞因子的表达
坏死细胞已被证明能激活DC和T细胞的免疫功能。我们研究了坏死细胞产物（NCL）是否会影响THP-1细胞中促炎细胞因子的表达。用LPS刺激THP-1细胞12小时后，诱导其坏死，并用NCL调节新鲜培养的THP-1。如所示，与培养基对照相比，以50%（v/v）添加到THP-1培养物中6小时的NCL显著增加了细胞因子的产生。然而，这种增加仍然远远小于LPS单独诱导的增加。当细胞在LPS存在下与NCL孵育时，我们测量到TNF-α、IL-6和IL-8水平的增加更为强劲。这种增加是单用LPS刺激后的两倍多。
坏死细胞裂解物（NCL）含有HMGB1和HSP70，可上调LPS诱导的促炎细胞因子和趋化因子的产生。在存在或不存在抗HMGB1或抗HSP70或两者的情况下，用NCL或NCL加LPS培养细胞6小时。（A） ELISA测定的蛋白质产量。（B） 实时PCR测定mRNA表达。数据归一化为GAPDH mRNA，并表示为相对于培养基对照的折叠变化（指定为一个折叠）*第页<0.05 vs.仅LPS**第页与阳性对照组（LPS加NCL）相比<0.05。
我们希望确定NCL中可能负责增强LPS诱导的细胞因子生成的分子。据报道，HMGB1和HSP70均由活化细胞、应激细胞或坏死细胞释放，其重组蛋白已被证明能激活天然免疫细胞。我们使用特异性抗体中和NCL中可能存在的HMGB1或HSP70活性。在将NCL添加到THP-1培养物中之前，用抗体处理NCL 1小时。结果()与LPS加NCL处理的细胞相比，抗HMGB1或抗HSP70显著降低了NCL诱导的所有三种蛋白的生成增加。此外，与单独阻断HMGB1或HSP70后相比，HMGB1与HSP70同时阻断后，细胞因子产生没有任何显著变化，表明没有加性或协同效应。与LPS加NCL相比，使用同型控制抗体治疗未表现出任何显著变化（数据未显示）。这些数据表明，坏死细胞产物的HMGB1和HSP70在LPS诱导THP-1细胞分泌TNF-α、IL-6和IL-8的上调中发挥了作用，至少部分是这样。U-937细胞的细胞因子水平相似().
NCL对LPS诱导的U-937细胞细胞因子产生的影响。如图例所述，对细胞进行处理，并对细胞因子的产生进行分析. *第页<0.05 vs.仅LPS**第页与阳性对照组（LPS+NCL）相比，<0.05。
我们通过实时PCR分析mRNA表达，进一步检测NCL诱导的细胞因子是否在基因表达水平上介导。在LPS存在下，NCL显著增强细胞因子mRNA的表达(). 培养物中HMBG1和HSP70抗体的存在显著(第页<0.05）降低与NCL孵育后观察到的mRNA表达增加。总之，这些结果表明HMGB1和HSP70存在于NCL中，并作为共同信号上调LPS诱导的TNF-α、IL-6和IL-8基因表达和蛋白生成。
3.3. TREM-1介导HMGB1和HSP70上调LPS诱导的细胞因子生成
Toll样受体4（TLR4）参与固有免疫途径的激活，如炎症和细胞因子的产生[19,20]这归因于TLR4介导的LPS识别[21]。由于我们的数据表明HMGB1和HSP70参与了LPS存在下细胞因子生成的增强，因此我们研究了TLR4对LPS加NCL处理细胞的细胞因子生成增加的贡献。用抗TLR4抗体阻断TLR4可显著降低但不能完全阻止LPS加NCL处理细胞的细胞因子诱导()，表明在NCL存在的情况下，一种额外的途径可能参与细胞因子产生的信号传导。与阳性对照组相比，用对照抗体治疗没有显示出显著差异（数据未显示）。
阻断TREM-1可减少NCL介导的LPS诱导细胞因子产生的增加。在有或无rTREM-1和抗HMGB1、抗HSP70或抗TLR4的情况下，用LPS、NCL或LPS加NCL处理细胞6小时。6小时后测定培养上清液中的蛋白质水平*第页与仅NCL相比<0.05**第页与LPS加NCL相比<0.05。
HMGB1已被证明与晚期糖基化终产物（RAGE）受体结合并引发炎症[22]。然而，用抗RAGE抗体治疗THP-1细胞时，LPS加NCL诱导的细胞因子没有变化（数据未显示）。另一方面，髓系细胞上的触发受体-1（TREM-1）是一种新发现的在中性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞上表达的受体[23]。TREM-1已被证明与TLRs协同作用，以放大LPS引发的炎症反应[24]并诱导TNF-α和IL-8的产生[23]。我们研究了阻断TREM-1对LPS和NCL反应中细胞因子产生的影响。如所示用TREM-1融合蛋白（rTREM-1/Fc）阻断TREM-1并不影响LPS介导的细胞因子的产生。在阻断HMGB1或HSP70的同时阻断TREM-1也不会影响细胞因子的产生。相反，阻断TREM-1可消除NCL诱导的细胞因子产生，而同时阻断TREM1和HMGB1或HSP70活性则无额外作用。这些结果表明，TREM-1不是LPS诱导的细胞因子产生所必需的，但对介导NCL的作用至关重要。我们还研究了阻断TREM-1是否会影响向LPS处理细胞中添加NCL后细胞因子生成的增加。用rTREM-1处理THP-1细胞后，所有三种蛋白均显著降低，而用抗HMGB1或抗HSP70的rTREM1处理与单独使用rTREM-1相比，没有任何显著变化(). 同时阻断TREM-1和TLR4完全抑制细胞因子的产生。数据显示在提示TREM-1虽然不是LPS诱导细胞因子产生所必需的，但参与介导HMGB1和HSP70的促炎作用，并通过NCL增强LPS诱导的细胞因子产生。
3.4. 阻断TREM-1可减弱p38 MAPK的表达，但不影响NF-κB的活化
先前的研究报道，MAP激酶和NF-κB通路对单核细胞/巨噬细胞的激活和对各种刺激的反应产生促炎细胞因子至关重要[25,26]。NF-κB由其细胞质抑制剂IκBα调节，当其被激活时，释放NF-kb B迁移到细胞核并激活靶基因[27]。事实上，通过稳定mRNA，TNF-α、IL-6和IL-8的表达由NF-κB转录调节，而转录后由p38 MAPK调节[28–32,17]。此外，重组HMGB1和HSP70通过涉及NF-κB和p38的机制诱导炎症细胞因子[14,33]。由于TREM-1参与了LPS刺激下NCL上调细胞因子生成，我们检测了这两条通路是否参与了NCL增强细胞因子的生成，以及阻断TREM-1是否通过NF-κB或p38通路对NCL增强的细胞因子的产生产生影响。Western blot分析表明，NCL诱导IκBα的表达和磷酸化类似于LPS。然而，阻断TREM-1并没有显著影响IκBα途径（数据未显示）。此外，虽然NCL单独诱导p38表达并增加LPS诱导的p38表达，但它在LPS存在下显著磷酸化并激活p38(). 仅NCL轻微激活p38。这些结果表明，坏死细胞释放的HMGB1和HSP70可作为信号增强LPS诱导的p38激活和细胞因子产生。
NCL激活THP-1细胞中的p38 MAPK通路。在rTREM-1存在或不存在的情况下，用NCL和/或LPS处理细胞6小时。对蛋白质进行分馏、印迹，然后用特定抗体进行检测，以确定p38 MAPK的总表达和磷酸化表达。磷酸化p38。
4.讨论
坏死细胞通过诱导细胞因子表达激活树突状细胞[34]。这项研究表明，炎症过程中的细胞损伤或死亡会产生内源性信号，从而放大和延长炎症反应。我们检测了坏死细胞产物在THP-1细胞mRNA和蛋白水平诱导促炎细胞因子和趋化因子的能力。在该实验模型中，与培养基对照组相比，坏死细胞裂解物（NCL）在6小时时诱导了相当水平的TNF-α、IL-6和IL-8。细菌脂多糖存在时，这些炎症介质的诱导作用显著增强。
以前的研究表明HMGB1和HSP70都是炎症介质[8,14]。因为在某些压力条件下，如细胞损伤和炎症，其水平会增加[8,9,12,13]它们可能作为内源性信号促进和加剧炎症反应。我们的阻断实验表明，HMGB1和HSP70都是坏死细胞产物的一部分，因为用特异性抗体阻断这两种蛋白会显著降低LPS和NCL诱导的细胞因子表达。我们的结果支持先前的一项研究，该研究表明HMGB1−/−坏死细胞促进炎症的能力大大降低，TNF-α的表达降低就证明了这一点[9]。此外，外源性表达的HMGB1和HSP70已被证明可以激活人单核细胞并诱导TNF-α、IL-6和IL-8的表达[12,10,14]。HSP70在炎症中的作用一直存在争议。虽然一些研究表明，它作为内源性信号促进炎症[28,35,36]，其他研究表明，它可能在应对组织损伤或炎症损伤时发挥保护作用[37,38]。一种解释是，HSP可能具有不同的作用，这取决于它们呈现给免疫系统的环境。例如，细胞内HSP72已被证明减少促炎细胞因子的表达，而细胞外HSP72则增加其表达[39,40]。在THP-1细胞中，我们的数据显示，NCL中的HSP70是促炎性的，因为它增强了细胞因子和趋化因子的表达。同时阻断HMGB1和HSP70的发现并没有产生加性效应，这表明两种蛋白都可以诱导类似的效应，并且不需要与另一种蛋白相互作用。
我们进行了阻断实验，以确定参与NCL诱导细胞因子表达的受体。HMGB1已被证明与RAGE结合并引发炎症[23]。我们的数据（未显示）表明，阻断RAGE对LPS处理细胞中NCL上调细胞因子生成没有影响。关于这一点，以前的一项研究表明，RAGE-blocking抗体并没有完全阻断HMGB1对细胞的激活，并提示可能存在除RAGE外的其他HMGB1-binding受体[41]。此外，TLR4可能影响巨噬细胞的HSP70信号传导和激活[36]。阻断TLR4并没有消除细胞因子的表达，这表明其他细胞表面分子可能介导NCL中HMGB1和HSP70对细胞因子诱导的影响。
虽然其配体未知，但TREM-1刺激促炎细胞因子和趋化因子的分泌，并增强TLR启动的炎症反应（在[23]) [24]。此外，使用感染性休克模型，阻断TREM-1可以保护小鼠免于死亡[24]。TREM-1与激活TLR的微生物配体结合可协同增加TNF-α和IL-8的产生[42,43]。我们的结果表明，阻断TREM-1可显著降低NCL上调LPS诱导的细胞因子表达，而阻断TREM1和TLR4可完全阻断细胞因子的产生，表明TREM-1参与了THP-1细胞中细胞因子表达的增强。先前的研究表明，TREM-1融合蛋白降低了脓毒症患者血清激活单核细胞的能力，并提示脓毒症病人血清中可能存在TREM-1未识别的配体[44]。我们的研究支持了先前的观察结果，并表明NCL中的HMGB1和HSP70蛋白可能激活TREM-1，从而上调THP-1细胞的促炎反应。我们发现，用HMGB1或HSP70同时阻断TREM-1对LPS加NCL诱导的细胞因子产生的影响与单独阻断TREM1的作用相似，表明HMGB1和HSP70利用相同的（TREM-1）途径来增强LPS诱导的细胞激素产生。此外，TREM-1以外的途径或NCL中的其他内源性信号可能有助于增强LPS诱导的细胞因子生成，因为单独或同时阻断TREM-1与HMGB1或HSP70并不能将LPS加NCL诱导的细胞激素降低到单独阻断TLR4时的水平。
p38 MAPK的激活有助于IL-6、IL-8和TNF-α的产生[45,33]p38和NF-κB磷酸化的减弱下调THP-1细胞产生IL-8和TNF-α[33]。我们的结果表明，NF-κB由NCL和LPS诱导，但在LPS和NCL存在的情况下，不被TREM-1的阻断所抑制，这表明NCL激活NFκB，而NF-κ子B的激活发生在没有TREM-1时。这种双重激活可能足以诱导细胞因子表达，而无需TREM-1协同信号。另一方面，p38被NCL轻微激活。在存在LPS的情况下，其激活显著增强，通过阻断TREM-1而降低，这表明TREM-1参与了NCL增强LPS诱导的细胞因子生成。这一点非常重要，因为它表明NCL及其HMGB1和HSP70成分可能确实充当TREM-1的配体。此前有报道称，TREM-1和TLR协同促进炎症[25]通过NF-κB和MAP激酶激活[23].
这项研究表明，坏死细胞含有促进炎症的内源性信号。HMGB1和HSP70这两个信号通过激活NF-κB和p38信号通路直接上调内毒素诱导的促炎细胞因子和趋化因子。本研究将TREM-1确定为受体组装途径的一部分，该途径将促炎性内源性信号转导至细胞因子基因表达级联。
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