即刻早期基因产物网络传播有丝分裂原活化蛋白激酶信号幅度和持续时间的细微差异

摘要

暴露于细胞外刺激后立即早期基因（IEG）的诱导是多种细胞反应发生变化之前的第一个主要转录程序。细胞外信号调节激酶（ERK），c-Jun NH₂-末端激酶（JNK）、p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路以及磷脂酰肌醇3-激酶（PI3-激酶）信号(三,11)，已知能正向调节IEG，从而导致各种细胞结果，如细胞增殖、分化和致癌转化。具体而言，MEK1/2-ERK信号通路通过直接激活IEG启动子结合转录因子在IEG诱导中发挥关键作用(40). 这导致IEG的瞬时转录(12)再过30到45分钟，基因产物出现，如Fos、Jun和Myc家族的转录因子，以及其他转录因子，如Egr-1。

与IEG诱导的生理作用相关的一个令人困惑的特征是，它们的全局表达与多种因素有关，如促有丝分裂生长因子、分化因子和环境损伤，如渗透休克和电离辐射。因此，如果同一组IEG由不同的细胞外因子诱导，这如何导致产生适当的生物学结果？一种可能性是，不同的信号通路诱导特定的IEG亚群，从而促进特定的结果。大量实验证据表明情况并非如此(2,12,24,35). 然而，众所周知，ERK信号的动力学和振幅可以调节各种细胞命运决定(21,39). 该实验室最近展示了c-Fos IEG产品如何作为成纤维细胞ERK信号持续时间的传感器发挥作用(26). c-Fos的表达在翻译后受到信号动力学差异的调节，这控制着c-Fos依赖的增殖和转化。观察到ERK信号传导持续时间的变化决定了c-Fos蛋白是瞬时表达（30分钟）还是以更持续的方式表达（最多4小时），这证明了其基本意义。这表明，信号属性的差异，如持续时间和强度，可以将最初在转录水平上通用的IEG表达程序调节为在翻译后水平上以信号特异方式微调的IEG。

持续ERK信号传导期间c-Fos活性的调节过程分为两个阶段(26). 首先，ERK和90-kDa核糖体S6激酶（RSK）的核定位分别导致c-Fos的COOH末端的Ser374和Ser362磷酸化，这降低了c-Fos降解的速度。在瞬态ERK信号条件下-福斯基因被诱导，但最初刺激后出现的c-Fos蛋白没有被修饰，因此是不稳定的。其次，Ser374和Ser362的磷酸化启动了Thr325的额外磷酸化，在较小程度上启动了Thr 331。后两个残基的有效磷酸化取决于氨基酸（aa）343和346（Phe-Thr-Tyr-Pro）之间的ERK对接DEF（ERK对接位点，FXFP）结构域。重要的是，c-Fos DEF结构域的突变降低AP-1转录并完全阻止c-Fos介导细胞转化的能力(26). DEF结构域在c-Fos功能中的重要作用促使我们目视检查其他IEG产品中是否存在DEF结构区。这表明，除c-Fos外，Fos、Jun和Myc家族的其他IEG产品还包含假定的DEF域，这表明它们也可能用作ERK传感器。大多数ERK传感器由原癌基因编码，因此预计在促进细胞转化方面具有重要作用。在本研究中，我们表明其中几个假定传感器（Fra-2、Fra-1和c-Myc）确实具有功能性DEF域，ERK对接控制生理相关位点的磷酸化。有趣的是，其中一个传感器Fra-1的转录诱导本身受早期表达的c-Fos传感器的直接控制，这表明生长因子诱导基因的产物可以提供有关ERK信号特性的特定长期时间信息。ERK传感器还能够区分因激动剂浓度微小变化而导致的ERK信号强度的微小差异。这最终导致下游基因表达和细胞进入S期的效率发生重大变化。

材料和方法

结果

Fra-1、Fra-2和c-Myc中的功能性DEF域。

c-Fos、Fra-1和Fra-2的COOH末端具有显著的氨基酸同源性（图。​（图1A，1安培，黑体字残留物）。具体而言，在c-Fos中发现的启动磷酸化位点（下划线残基）和DEF结构域（带框残基）在Fra-1和Fra-2中是保守的，这表明Fra-1和Fra-2对ERK信号传导的反应类似于c-Fos。c-Fos的电泳迁移率可用作磷酸化状态的指示（图。​（图1B），1磅)这种迁移率的改变部分是由于Thr325磷酸化的增加（图。​（图1B）1磅)如前所述(26). 与c-Fos一样，Fra-1和Fra-2也会发生生长因子调节的迁移率变化，当用MEK1/2抑制剂UO126预处理细胞时，这种迁移率变化会受到抑制（图。​（图1B）。1磅). 在每种情况下，生长因子调节的c-Fos、Fra-2和Fra-1的迁移率改变伴随着内源性ERK1/2的迁移率变化，表明ERK信号的磷酸化和激活。为了测试假定的DEF结构域在调节Fra-2和Fra-1迁移率变化中的作用，对Fra-2中的Phe282或Tyr284以及Fra-1中的Phe 237或Tyr 239进行了丙氨酸取代。这些突变完全抑制了外源性表达的Fra-2的生长因子调节的迁移（图。​（图1C）1摄氏度)和Fra-1（图。​（图1D），一维)表明DEF结构域控制Fra的过度磷酸化。已发现DEF结构域专门将ERK导向磷酸化仅位于NH的磷酸受体位点₂结合基序的末端(15,26). 推测的磷酸受体位点（Thr-Pro）确实位于NH₂Fra-2和Fra-1中DEF域的终端（图。​（图1A），1安培)，其中一些已知在体内被磷酸化(25,43). 有趣的是，在Fra-1的情况下，其中一个位点（Thr231）控制转录激活(43).

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图1。

Fra蛋白的DEF结构域依赖性调节。（A） c-Fos、Fra-1和Fra-2 COOH末端的对齐显示氨基酸身份（黑体字母）、ERK和RSK启动磷酸化位点（下划线）和DEF域（方框）。这些序列来自大鼠（c-Fos）和小鼠（Fra-1和Fra-2）蛋白质，数字表示氨基酸位置。（B） 用指示的Fos等位基因转染NIH 3T3细胞，去除血清，用EGF（50 ng/ml）处理5分钟。如有指示，在用EGF处理5分钟之前，用UO126（5μM）预处理细胞30分钟。然后用抗c-Fos、抗磷酸-Thr325 c-Fos和，和抗ERK抗体。（C和D）NIH 3T3细胞转染了指示的DEF域突变体Fra-2和Fra-1等位基因，并按照B组所述进行处理。使用抗Fra-2、抗Fra-1和抗ERK抗体进行免疫印迹。

除了Fos家族蛋白外，我们注意到Myc蛋白也包含假定的DEF结构域(26). c-Myc中的DEF结构域位于aa 196和199之间，是生长因子调节的磷酸化位点Ser62和Thr58的COOH末端（图。​（图2A）。2安培). ERK介导的Ser62磷酸化可提高c-Myc的稳定性，但当PI3-激酶信号传导较低时，Ser62磷酸也可启动Thr58的磷酸化，从而促进c-Myc泛素化和降解(34). 鉴于Ser62磷酸化在c-Myc中起着关键作用，c-Myc是一种有效的转化和细胞死亡诱导剂，了解如何有效地实现该位点的磷酸化至关重要。Ser62的磷酸化受MEK-ERK途径调节（图。​（图2B），2B型)与之前的研究一致(34). 用丙氨酸替换关键DEF结构域残基Phe196或Tyr198减少了生长因子调节的Ser62磷酸化增加（图。​（图2C）。2摄氏度). 该观察结果表明aa 196至199包含一个DEF结构域，这是调节c-Myc Ser62磷酸化所必需的。上述观察结果表明，除了c-Fos外，IEG产物Fra-1、Fra-2和c-Myc还含有功能性DEF结构域，表明这些结构域也可以作为ERK信号传导的分子传感器。

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图2。

DEF结构域介导的c-Myc磷酸化调控。（A） 图示详细说明了假定的DEF域（FPYP），NH₂-末端磷酸化位点Thr58和Ser62、Myc-box II（MbII）、碱性DNA结合结构域（B）和螺旋-环-螺旋（HLH）-亮氨酸拉链（zip）结构域。（B） 用c-Myc或对照载体转染NIH 3T3细胞，并按照图的图例进行处理。​图1B。1磅从细胞裂解物中免疫沉淀（IP）.c-Myc，并用抗c-Myc或抗磷酸特异性Ser62（pS62）抗体分析每个样本。用抗磷酸-ERK1/2抗体测定细胞裂解液中ERK激活的Western blot分析。IgG、免疫球蛋白G（C）表达所示C-Myc蛋白的静止细胞用EGF处理5分钟并裂解，然后进行C-Myc免疫沉淀。免疫沉淀物的Western blot分析使用抗c-Myc或抗磷酸化-Ser62抗体，细胞裂解物的分析使用抗c-Myc或ERK抗体。所示数据代表了三个实验。

EGF-和PDGF-刺激IEG诱导动力学。

ERK信号传导持续时间的差异对c-Fos的磷酸化状态和稳定性有深刻影响(8,26,27). 为了确定这种对信号持续时间的反应是否仅限于c-Fos，研究了含有DEF结构域的额外IEG产物的表达动力学。用EGF诱导的ERK瞬时激活处理静止的瑞士3T3细胞（图。​（图3A）3A级)以及c-Fos的瞬时积累（图。​（图3A，3A级，车道1至8）。相反，PDGF治疗与持续ERK活性和c-Fos表达相关（图。​（图3A，3A级，9至15车道）。注意，用EGF或PDGF诱导45分钟后，c-Fos表达水平相似。在瞬时ERK信号的情况下，c-Fos不稳定并消失，而如前所示，稳定c-Fos需要持续的ERK激活(26). c-Fos二聚体伴侣c-Jun的表达与c-Fos的表达相同（图。​（图3A）。3A级). 当信号被瞬时激活时，可重复检测到低水平的Fra-2（图。​（图3A，3A级，泳道3）（数据未显示），这可能表明其在低磷酸化时稳定性降低或EGF的弱转录诱导。相反，PDGF治疗后4小时内观察到较高水平的Fra-2（图。​（图3A，3A级，9至15车道）。Fra-1仅在ERK信号持续时检测到，其表达相对于其他Fos蛋白和c-Jun延迟（图。​（图3A，3A级，9至15车道）。除这些观察结果外，在PDGF诱导后3-4小时，c-Fos、c-Jun和Fra-2的丰度和/或电泳迁移率发生了显著变化（图。​（图3A，3A级车道14和15）。这可能反映了ERK介导的这些蛋白质磷酸化减少，这反过来又影响蛋白质的稳定性和/或流动性。在随后的时间点，Fra-1水平保持升高，电泳迁移率没有变化（图。​（图3A，3A级车道14和15）。

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图3。

IEG的全球诱导。（A） 用EGF（25 ng/ml）或PDGF-BB（20 ng/ml。Western blotting用于可视化Fos家族蛋白和c-Jun的表达，以及ERK激活动力学（下表）。（B） 按照A组所述处理细胞，用抗Egr-1、抗JunB或抗ERK抗体分析裂解产物。（C） 首先从提取物中免疫沉淀C-Myc，然后进行Western分析，以分析C-Myc的诱导作用。用抗磷酸化ERK1/2（αpERK）抗体分析ERK的激活。所有显示的数据都代表了至少四个实验。

另外两种含DEF结构域的IEG产物Egr-1和JunB的表达也与c-Fos的表达相似。两者在EGF处理的细胞中的表达是短暂的，但在PDGF处理的细胞内持续表达（图。​（图3B，3B公司，车道1至13）。虽然60分钟后EGF或PDGF诱导的Egr-1和JunB表达的初始水平是相同的，但这两种蛋白的水平在以后的时间点发生了显著变化（图。​（图3B，3B公司，将第11车道与第5车道进行比较）。当使用PDGF时，JunB的电泳迁移率总是以三重态出现（图。​（图3B，3B公司而EGF诱导与双JunB物种相关（图。​（图3B，3B公司，车道3）。这表明，虽然这两种生长因子最初都诱导JunB表达，但PDGF调节的JunB翻译后修饰导致其稳定。

当分析c-Myc表达时，在EGF处理的细胞中观察到一个短暂而微弱的诱导（图。​（图3C，3C公司，车道1至7），这可能反映了t吨_1/2（～7.5分钟）用于低磷酸化c-Myc(34). 在PDGF的持续ERK信号传导条件下，c-Myc的水平更高，并在实验期间保持（图。​（图3C，3C公司，8至14车道）。

IEG产品的扩展表达需要持续的ERK信号。

上述实验的结果表明，持续ERK信号转导和几个含有DEF结构域的IEG产物的持续表达之间存在强烈的相关性。为了进一步扩展这一点，我们用PDGF诱导了IEG产物的表达，并检查了维持IEG蛋白表达所需的持续ERK活性。如果一些IEG产物的延伸表达需要持续的ERK信号，那么使用MEK抑制剂抑制ERK信号应该会导致其快速转换。因此，将UO126添加到已经用PDGF诱导的细胞中（90分钟），以便将持续信号转换为更瞬态的信号（图。​（图4A，4A级，下部面板，将车道3至7与车道9至13进行比较）。以这种方式操纵ERK信号传导对所检测的所有IEG产物的延伸表达具有强烈的影响。当将UO126添加到PDGF处理的细胞中时，Egr-1、Fra-2、c-Jun和JunB的表达降低（图。​（图4A）。4A级). UO126还降低了PDGF处理2、4或6小时后细胞中检测到的c-Myc水平（图。​（图4B，4B类，将车道3至5与车道7至9进行比较）。将UO126的添加延迟至PDGF处理2小时后，可使c-Myc达到其最大表达水平（图。​（图4B，4B类但在PDGF和UO126存在下培养2和4小时后，浓度随后下降（图。​（图4B，4B类，第12和13车道）。这与对照细胞中保持的最大c-Myc水平相反（图。​（图4B，4B类，车道3至5，以及图。​图3C，3C公司，12至14车道）。由于PDGF在瑞士3T3细胞中没有显著诱导ERK5激活（L.O.Murphy和J.Blenis，未发表的观察结果），UO126对IEG表达的影响（图。​（图4）4)可以完全归因于MEK1/2-ERK通路的抑制，而不是MEK5-ERK5通路，后者的激活也是UO126敏感的(17).

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图4。

IEG产品的持续表达需要ERK途径。用PDGF诱导瑞士3T3细胞90分钟，然后用UO126（5μM）或DMSO（0.1%）再处理120分钟。（B） 在最初用PDGF处理细胞90分钟（通道2至10）或120分钟（通道11至13）后，向细胞中添加DMSO或UO126。c-Myc从细胞裂解物中免疫沉淀并进行Western分析。（C） 用PDGF诱导瑞士3T3细胞5小时，然后在细胞裂解前用UO126处理20或30分钟。对照细胞（−）用二甲基亚砜处理30分钟。αpERK，抗磷酸-ERK。（D）用PDGF诱导的细胞在UO126存在和不存在（DMSO）的情况下再培养5小时。在指定的时间制备细胞提取物，并进行Western分析以检测Fra-1的水平和ERK的激活动力学。所示数据代表了三个实验。

在3T3成纤维细胞中，相对于其他IEG产物，Fra-1的诱导延迟，部分是因为c-Fos表达是初始诱导fra-1型转录(33). 因此，为了确定持续ERK信号是否在G₁-在PDGF处理5小时后添加S转换UO126，这使Fra-1达到其最大表达水平（图。​（图4C）。4摄氏度). 注意，此时c-Fos相对低磷酸化(26)，其水平相对较低（图。​（图3A，3A级，车道15）。UO126仅存在20或30分钟就足以完全抑制Fra-1的迁移率移动，这表明ERK信号在Fra-1翻译后控制中起着重要作用（图。​（图4C）。4摄氏度). 此外，电泳迁移率的这种变化先于Fra-1的完全消失，这表明ERK在Fra-1稳定性中的额外作用（图。​（图4D）。4D（四维）). 在没有UO126的情况下，诱导9到12小时后，超磷酸化Fra-1的水平保持不变（图。​（图4D），4D（四维）)，对应于G₁-瑞士3T3细胞中的S边界。总之，这些数据表明，几种IEG产物（Fra-2、c-Jun、JunB、c-Myc和Egr-1）和Fra-1对ERK信号持续时间表现出与先前描述的c-Fos相同的生化反应(26)提供了强有力的证据，证明这些额外的蛋白质也是ERK信号传感器。

ERK信号强度降低会导致IEG过度磷酸化、稳定性和随后的靶基因表达丧失。

调节ERK信号持续时间的机制尚未完全了解，但可能涉及磷酸酶水平的差异调节(29,32,36,37)受体内化和贩运(30)以及Ras或Rap1激活Raf的可能替代模式(42). 信号幅度和持续时间的差异也可能仅仅是受体密度的结果。受体数量少会导致短暂途径激活，而受体数量多10到100倍则会导致更持久的激活(9,38). 我们假设，通过减少用于治疗静止瑞士3T3细胞的PDGF数量，ERK信号的持续激活将转换为更短暂的激活。如果是真的，那么IEG产品的磷酸化和稳定性将受到不利影响。事实上，将PDGF浓度从10 ng/ml降低到4 ng/ml可以将c-Fos和Egr-1的表达谱从持续转变为暂时（图。​（图5A）。5A级). 此外，虽然诱导10分钟后ERK的初始激活没有因PDGF的减少而显著改变，但ERK信号的持续期是（图。​（图5C）。5摄氏度). 正如预期的那样，与每毫升10纳克PDGF处理的细胞相比，每毫升4纳克PDGF处理细胞中c-Fos的Thr325磷酸化显著降低，尽管事实上这两种情况下c-Fos水平几乎相同（图。​（图5B）。5亿). 因此，与持续ERK信号转导相关的反应（IEG产物的过度磷酸化和稳定）通过激动剂浓度的惊人小幅度降低而转变为短暂反应（低磷酸化和IEG产物瞬时表达）。

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图5：。

ERK信号强度和持续时间的增加减少对IEG产物磷酸化和持续表达有很大影响。（A） 将静止的瑞士3T3细胞用不同量的PDGF处理指定的时间并进行裂解。通过Western blotting测定内源性c-Fos和Egr-1水平以及ERK激活动力学。通过Western blotting检测c-Fos中Thr325的磷酸化和c-Fos的总水平。（C） ERK1从PDGF处理的细胞中免疫沉淀，其激酶活性通过免疫复合物激酶分析进行定量。所示数据为三个独立实验的平均值±标准误差。（D和E）细胞按照A组所述进行处理，并通过Western分析分析Fra-2和Fra-1的水平。这些数据代表了三到四个实验。

当用每毫升10或4 ng PDGF处理的细胞检测ERK1活性时，在诱导后1至2小时，观察到激酶活性显著降低30至40%（图。​（图5C）。5摄氏度). 由于RSK激活依赖于ERK信号，与4 ng/ml相关的ERK活性降低也伴随着RSK磷酸转移酶活性的类似降低（数据未显示）。因此，Thr325磷酸化的差异（图。​（图5B）5亿)可能反映了启动效率（RSK和ERK介导）以及依赖DEF的Thr325调节（ERK介介导）。这些观察结果表明，ERK活性的微小降低导致c-Fos磷酸化状态和稳定性的显著降低。最后，在限制PDGF的条件下也检查了Fra-2和Fra-1的表达（图。​（图5D）。第五天). 在用10ng/ml PDGF处理的细胞中诱导并维持Fra-2表达4小时（图。​（图5D，第五天，车道2至4），以及如上所述（图。​（图3A），3A级)，Fra-2的电泳迁移率在诱导后3到4小时发生变化（图。​（图5D，第五天，车道4）。虽然用每毫升6、5或4纳克PDGF处理的细胞中Fra-2的初始水平与用10纳克/毫升处理的细胞相同（将通道2与通道5、8和11进行比较），但在这些细胞中仅2小时后Fra-2的电泳迁移率发生了变化（将通道3与通道6、9和12进行比较），表明磷酸化状态下降更快。此外，将PDGF的量从10 ng/ml减少到4 ng/ml也将Fra-2的表达从持续转化为暂时（图。​（图5D，第五天，比较车道4和13）。2小时后，所使用的所有浓度的PDGF也同样诱导了Fra-1（图。​（图5D，第五天，与通道2、5、8和11相比），但Fra-1的电泳迁移率在低剂量下更快（通道2与通道5、8、11相比）。此外，用每毫升4 ng PDGF处理的细胞在4、8和12 h后残留的Fra-1水平始终低于用10 ng/ml处理的细胞（图。5D和E).

如果ERK信号强度和持续时间对细胞周期控制的影响是通过IEG编码的转录因子介导的，那么传感器调节的下游基因表达也应受到信号动力学的影响。由于细胞周期蛋白D1基因受AP-1转录复合物的直接控制(5)细胞周期蛋白D1的表达可能代表ERK信号动力学、IEG传感器和细胞周期进展之间的关键联系。如果是这种情况，ERK信号强度会小幅度降低，从而将持续的c-Fos表达转化为更短暂的表达（图。​（图5A）5A级)也会影响细胞周期蛋白D水平。为了验证这一点，将静止的瑞士3T3细胞在每毫升10或4 ng PDGF的存在下培养3、6、9或12小时，并通过免疫印迹法测定细胞周期蛋白D1的表达。尽管两种剂量的PDGF诱导了细胞周期蛋白D1的表达（即4 ng/ml无延迟诱导），但4 ng/ml处理的细胞中的水平显著降低（图。​（图6A）。6A级). 最后，为了确定ERK信号强度的微小下降是否对G产生差异性调节₁-S进展，进行BrdU掺入，并通过荧光激活细胞分选仪（FACS）分析进行定量。两种剂量均在11至13小时后诱导BrdU掺入；然而，在每个时间点，当使用4 ng/ml时，BrdU阳性细胞的数量显著减少（图。​（图6B）。6亿). 定量分析表明，在每毫升含有10 ng PDGF的情况下，12小时后，BrdU掺入量增加了6倍以上，而4 ng/ml仅增加了2.5倍（图。​（图6C）。6摄氏度). 这些观察结果表明，激动剂浓度的两到三倍变化与ERK信号强度和持续时间的细微差异有关。然而，ERK信号计时的这些明显轻微变化被传播到多种IEG产物的磷酸化状态和表达、下游传感器调节基因表达和细胞周期进展的实质性差异中。

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图6。

ERK信号强度影响AP-1靶基因表达和S期进入。（A） 用PDGF（10或4 ng/ml）处理静止的瑞士3T3细胞，并用抗细胞周期素D抗体测量细胞提取物中的细胞周期素D1水平。（B） 用PDGF处理玻璃盖玻片上培养的静态瑞士3T3细胞，并按照材料和方法中的描述分析BrdU掺入。所显示的数据代表了三个独立的实验。DAPI，4′，6′-二氨基-2-苯基吲哚。（C） PDGF诱导静止瑞士3T3细胞11.75 h，BrdU（20μM）处理15 min，然后固定。按照材料和方法中的描述，通过FACS分析对每个治疗组中BrdU阳性细胞的数量进行量化。所示数据为三次测定的平均值±标准误差，代表三个独立实验。

讨论

本研究中的发现显示了ERK信号的强度和总持续时间如何控制几种DEF域IEG产品的全球表达，以及这与二级基因表达和细胞周期进展的关系。首先，我们证明了Fra-1、Fra-2和c-Myc中假定的DEF结构域确实具有功能。与c-Fos一样，在这些转录因子中发现的DEF结构域调节其过度磷酸化，并被预测控制其生物功能。其次，所有检测到的DEF结构域IEG产品对ERK信号的持续时间表现出相同的差异反应，并且需要延长ERK信号，才能通过G持续表达这些IEG产品₁细胞周期的阶段。第三，ERK信号强度的微小降低会导致这些IEG产品的过度磷酸化和稳定性的显著损失。第四，当ERK信号强度和持续时间降低时，AP-1靶基因cyclin D1的表达显著降低。第五，IEG对信号持续时间的表达反应与细胞周期进展的数量差异密切相关。综上所述，这些观察结果表明，IEG产物的翻译后调节为细胞提供了一种机制，以应对ERK信号强度和持续时间的细微变化，从而导致细胞功能的显著变化。

了解持续的ERK和RSK信号如何调节c-Fos提供了一个分子框架来解释信号持续时间的差异如何导致特定生物结果的产生(26). 在持续信号传递期间，ERK和RSK介导的c-Fos COOH末端磷酸化在Thr325和Thr331启动过度磷酸化(26). 高磷酸化还需要一个完整的DEF结构域，当发生突变时，Fos介导的转化被抑制(26). 在本研究中，我们特别证明了Fra-2、Fra-1和c-Myc也具有其过度磷酸化所需的功能性DEF结构域。实验和序列分析表明，由于启动磷酸化位点和DEF结构域介导的磷酸化位点在其COOH末端的存在，Fra-2和Fra-1的翻译后控制可能与c-Fos非常相似。有趣的是，当Thr231突变为丙氨酸时，Fra-1的反式激活潜能被完全抑制(43)，我们的研究结果表明，该残留物受DEF结构域的调控。对于c-Myc，DEF结构域调节Ser62的ERK依赖性磷酸化。由于Ser62的磷酸化促进了c-Myc的稳定性，ERK与c-Myc依赖于DEF的对接将导致c-Myc稳定。有趣的是，DEF域和NH₂-末端磷酸化位点Ser62和Thr58位于名为Myc-box II（MbII）的区域两侧。MbII是组装含有转化-转化域相关蛋白（TRRAP）和TIP49/TIP48的高分子量复合物所必需的(23,41). 这种复合物是Myc依赖性转化所必需的，可能参与Myc靶基因的染色质修饰(10). 除了直接磷酸化Ser62外，ERK与c-Myc的对接也可能在调节TRRAP复合物的募集和/或活性方面发挥作用。

其他一些IEG产品具有Fos和Myc家族传感器所特有的表达模式。例如，信号持续时间的差异可以像c-Fos一样调节c-Jun的表达。然而，根据序列分析，预测c-Jun不包含功能性DEF结构域(26). 然而，众所周知，ERK通路可以在PC12细胞持续信号传导期间控制Ser63和Ser73的磷酸化(19). 在缺乏DEF结构域的情况下，如何通过持续的ERK信号调节c-Jun的表达？一种可能性是，Fos相关ERK对Ser63和Ser73的转磷酸化将增加c-Jun的稳定性和转录激活。为了支持这一点，已经证实了c-Jun二聚体伴侣的JNK介导的转磷酸化(16). 另一种可能性是Fos家族蛋白的稳定性间接控制Jun蛋白的稳定性，因为Jun/Fos二聚体比Jun/Jun二聚体更稳定(1).

JunB中Thr102和Thr104的磷酸化被认为主要受JNK而非p38或ERK调节(20). 有趣的是，这些氨基酸是Th2淋巴细胞中JunB-驱动白细胞介素-4表达所必需的(20)，位于NH₂6月至假定DEF域的终端(26). 在不同的细胞类型和适当的伙伴蛋白存在下，DEF结构域可能促进JunB的ERK依赖性磷酸化，需要进一步研究这种可能性。最后，ERK介导的PC12细胞分化需要Egr-1转录活性来增加第35页，一个Egr-1靶基因(14). 虽然Egr-1 DEF结构域在这一过程中的作用目前尚不清楚，但ERK对接可能控制Egr-1的稳定性和/或转录活性。有趣的是，几个推测的ERK磷酸化位点（Ser-Pro）位于NH₂此DEF域的终端(26)，Egr-1本身在体内被磷酸化(6).

本研究中的观察结果阐明了一种全球机制，该机制负责控制细胞对ERK信号持续时间的反应。该机制考虑了信号动力学和信号强度的影响。我们认为，在几种生长因子诱导的传感器中，DEF域的存在使细胞能够对信号强度的微小增加或减少作出响应。Fra-1对持续ERK信号的响应最能说明这一概念。在瑞士3T3成纤维细胞中，尽管ERK在G₁-S边界仅为初始刺激10分钟后测量值的10~20%，但足以促进Fra-1的过度磷酸化。这一证据和其他证据强烈表明，DEF结构域在持续信号传递期间将活性ERK局部集中到Fos、Jun、Myc和Egr-1传感器，这导致靶磷酸受体位点的有效磷酸化。

转录诱导fra-1型可由c-Fos直接调节(4)结果是在c中妥协了-福斯^−/−破骨细胞和成纤维细胞(22,33). 这表明，除了ERK信号直接作用于Fra-1蛋白外，信号持续时间对c-Fos传感器的影响也可以决定fra-1型虽然Fra-1表达仅在ERK信号持续时发生（即用PDGF而不是EGF处理的细胞），但c-Fos仍短暂表达，并且在EGF处理细胞中磷酸化程度较低，但不足以诱导Fra-1。这意味着生长因子诱导的fra-1型表达需要事先ERK介导的c-Fos磷酸化和/或稳定。这个重要的观察结果区分了c的绝对要求-福斯用于诱导fra-1型表达式，如c的行为所示-福斯^−/−细胞，以及ERK信号在这一过程中的重要翻译后作用。对后一种机制的进一步支持来自信号强度降低的实验。在低剂量PDGF的情况下，尽管c-Fos的表达相对短暂，但其磷酸化程度高于EGF处理正常相关的磷酸化程度，关键是，这先于瑞士3T3细胞中Fra-1的表达。我们认为，在最初的c-Fos依赖诱导后fra-1型(33)，Fra-1蛋白被ERK过度磷酸化，这主要有助于Fra-1在G₁因此，c-Fos-Fra-1通路是两个具有重叠表达谱的传感器如何向细胞提供ERK信号幅度的时间信息的一个例子。

单个细胞对细胞外刺激物浓度微小变化的反应能力是控制胚胎发育、细胞形态、迁移、分化和增殖过程的基础。在成纤维细胞中，PDGF浓度的两到三倍变化可以导致ERK信号强度的适度降低。然而，ERK信号的这种微小变化导致IEG编码的传感器的表达动力学和磷酸化以及细胞周期进展的巨大差异。这种对激动剂浓度的反应类似于果蝇属和爪蟾胚胎到形态发生。在这些系统中，形态原浓度只有两到四倍的变化就可能导致基因表达和细胞命运结果的数量差异(13). 许多形态原，如螺旋和激活素，独立于正在进行的蛋白质合成，控制“早期”靶基因的快速激活(13)类似于IEG对细胞外刺激的反应。形态因子也与“晚期”靶基因的延迟表达有关，有人提出细胞内信号和早期蛋白的存在可以调节晚期基因的表达(28). 在胚胎发育期间，IEG传感器样机制可以让单个细胞解释其在形态发生梯度中的位置，因此需要产生特定的细胞命运。

总之，含有DEF结构域的IEG产物对ERK信号持续时间和强度差异的一致反应表明，这些基因产物可以共同充当ERK信号的传感器。由于IEG产物是由不同范围的细胞外刺激诱导的，这些蛋白质可能具有解释ERK以外信号通路动力学差异的一般能力。因此，这个模型可能有助于解释复杂的细胞内信号是如何被解码并最终转化为细胞行为的表型变化的。

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参考文献