ADAM19在心血管形态发生中的重要作用

摘要

ADAMs（去整合素和金属蛋白酶的助记符）是膜锚定糖蛋白，在受精、神经发生、血管生成、阿尔茨海默病以及从质膜释放蛋白质如表皮生长因子（EGF）受体配体和肿瘤坏死因子家族成员中发挥关键作用(三,4,17,37,39,41). ADAM19（也称为meltrinβ）最初在肌肉细胞中发现，后来发现在其他几种组织中表达，最显著的是在心脏、肺和骨骼中(18,27,52)，在树突状细胞分化期间(13)和Notch诱导的T细胞成熟(9). ADAM19对候选底物的催化活性已通过在细胞中过度表达和纯化重组表达的整个外结构域或前和金属蛋白酶结构域的可溶性形式进行了研究(7,42,49,53). 过度表达的ADAM19增强了神经调节蛋白I-β的两个剪接变异体的外结构域脱落(42)，受体酪氨酸激酶ErbB家族的配体(11). 此外，ADAM19的过度表达增加了肿瘤坏死因子相关激活诱导细胞因子（TRANCE，也称为骨保护素配体[OPGL]）的外域释放(7)，一种在破骨细胞分化、树突状细胞存活和乳腺发育中发挥重要作用的蛋白质(12,25,28).

鉴于ADAM19在心脏和骨骼中的高表达及其切割TRANCE的能力以及神经调节蛋白I-β的剪接变异体，我们有兴趣评估ADAM19的小鼠功能，并强调其在心脏和骨发育中的作用。在此，我们对缺乏功能性ADAM19的小鼠进行了分析(金属蛋白酶19^−/−老鼠）。

材料和方法

结果和讨论

从ES细胞中获得缺乏功能性ADAM19的小鼠，在ADAM19基因中插入分泌基因陷阱（图。​（图11a；见材料和方法）(30). 杂合ADAM19突变小鼠的交配后代在出生时具有目标等位基因的孟德尔分布（28.0%+/+，47.2%+/-，24.8%−/-；n个= 254). 然而，～80%的纯合子金属蛋白酶19^−/−小鼠在出生后的头几天死亡，而杂合子ADAM19突变小鼠是健康和可生育的（出生后第21天的后代分布[P21]，30.8%+/+，64.9%+/−，4.3%−/−；n个= 487).

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图1。

ADAM19基因陷阱构建体。（a） 野生型ADAM19和分泌基因陷阱插入产生的突变形式示意图(30). （b） PCR基因分型结果。（c） 如前所述，分析野生型（+/+）、杂合型（+/-）或纯合型（−/−）ADAM19突变小鼠大脑提取物的蛋白质印迹(50)抗ADAM19胞外区抗体。（d和e）脑提取物的蛋白质印迹金属蛋白酶19^−/−用EndoH或肽治疗的小鼠（d）或野生型小鼠（e）-N个-用抗LacZ（d）或抗ADAM19（e）外结构域的抗体检测糖苷酶（PNGase）（见图。​图1c）。1c） ●●●●。N个-连接的高甘露糖聚糖通过中间高尔基网络转化为复合碳水化合物。复合碳水化合物通常对EndoH治疗有抵抗力，而PNGase治疗可以去除高甘露糖聚糖和复合碳水化合物N个-连接的碳水化合物残基。因此，EndoH耐药性的获得表明，一种糖蛋白已经从内质网中产生并通过了中间高尔基网络。面板d中的箭头标记了突变的ADAM19/LacZ/neo（β-geo）融合蛋白的位置。

大脑提取物的Western blot分析证实，纯合突变小鼠中不存在野生型ADAM19（图。​（图1b1b和c）。使用抗β-半乳糖苷酶抗体检测ADAM19的突变形式（图。​（图1a），1a） ，我们观察到N-连接的碳水化合物残基从未获得对内切糖苷酶H（EndoH）的抗性（图。​（图1d），1d） 表明大多数或全部突变蛋白从未到达高尔基体内侧隔室。相反，成熟的野生型ADAM19获得了对EndoH的抗性，并被转高尔基网络中的前蛋白转化酶裂解（图。​（图1e）1e）(22). 将基因陷阱插入ADAM19富含半胱氨酸的结构域明显阻止了蛋白质的正确折叠，从而导致突变的ADAM19被伴侣保留在内质网（ER）中并随后降解(45). 因此，由于ER和金属蛋白酶19^+/−小鼠没有明显的病理表型金属蛋白酶19^−/−小鼠可能是由于ADAM19功能的丧失，而不是由于突变蛋白的显性负效应。

胸部原位检查金属蛋白酶19^−/−小鼠在右心室前壁发现了异常扩张的充满血液的血管结构（图。​（图22b、 d和e）。对右心室的免疫组织化学评价表明，这些扩张的血管壁由内皮细胞组成（CD31阳性）（图。​（图2d2d和e）。此外，心肌内的血管金属蛋白酶19^−/−小鼠出现异常，平滑肌细胞鞘被破坏（图。​（图2g2g和i；野生型控件如图所示。​图2f2f和h）。心肌内皮细胞的电子显微照片金属蛋白酶19^−/−小鼠，我们经常观察到毛细血管周围水肿，内皮细胞广泛空泡化（图。​（图2k2k和l；野生型控制如图所示。​图2j），2j） 毛细血管和小动脉偶尔破裂，红细胞释放到血管外间隙（数据未显示）。这些超微结构缺陷与在一些患者中观察到的局灶性心肌内出血一致金属蛋白酶19^−/−心脏处于光镜水平（数据未显示）。

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图2。

心脏缺陷金属蛋白酶19^−/−老鼠。新生儿野生型（a）或金属蛋白酶19^−/−小鼠（b）。箭头表示扩张的充满血液的血管结构。（c、d和e）CD31染色证实了异常结构的血管性质（如图d和e中的箭头所示）。（f至i）通过CD31染色（f和g）和α-平滑肌肌动蛋白染色（h和i）血管交叉剖切野生型间隔心肌（f），金属蛋白酶19^+/−（h） 、和金属蛋白酶19^−/−（g和i）动物。面板f和g中显示的部分来自新生小鼠，而面板h和i中的部分来自E17.5胚胎。箭头表示野生型小鼠（f和h）的平滑肌鞘正常，而野生型小鼠血管平滑肌细胞鞘异常或明显缺乏金属蛋白酶19^−/−小鼠（g和i）。注意，α-平滑肌-肌动蛋白还可对h和i中平滑肌细胞周围的心肌细胞进行染色。（j、k和l）通过野生型（j）或金属蛋白酶19^−/−（k和l）心脏（k和1中的星号表示血管周围水肿）。（m和n）新生儿野生型心脏的纵切面（m）或金属蛋白酶19^−/−（n） 小鼠苏木精和伊红染色；主动脉瓣用箭头表示；在图n（o和p）中，主动脉压倒VSD。新生儿野生型心脏的横切面（o）或金属蛋白酶19^−/−（p） 鼠标。在面板o和面板p中，一个箭头指向三尖瓣，显示出三尖瓣缺乏重塑金属蛋白酶19^−/−心脏（p）。在二尖瓣叶旁放置一个星号。（q和r）野生型心脏的肺动脉瓣（q）和主动脉瓣（r）的横截面金属蛋白酶19^−/−心脏。对于每个阀门，显示了三个厚度为10μm的可比较连续截面，间隔三个截面（30μm）。缩写：RA，右心房；LA，左心房；右心室；左心室。

组织学评价金属蛋白酶19^−/−心脏显示膜性室间隔缺损（VSD）（图。​（图2n）2n） 出生时检查的所有心脏的主动脉瓣和肺动脉瓣狭窄，瓣叶异常增厚（12例中的12例；图。​图2q2q和r）。金属蛋白酶19^−/−新生儿表现出心脏流出道中度旋转不良，在某些情况下导致主动脉压低。这些缺陷类似圆锥管畸形，如法洛四联症和右心室双出口，是人类先天性心脏病的重要形式，发病率高。大约一半的患者发现三尖瓣增厚金属蛋白酶19^−/−心形（图。​（图2p），2p） ，三分之一的患者出现了房间隔缺损金属蛋白酶19^−/−心脏（未显示数据）。二尖瓣全部正常金属蛋白酶19^−/−检查心脏（图。​（图2n2n和p），流出道到肺动脉和主动脉的分隔也不受影响（图。​（图2q2q和r）。

E10.5和E13.5之间心内膜垫引起的室间隔和心脏瓣膜的膜面(24,29)促使评估ADAM19在这些发育结构中的表达。原位mRNA杂交显示ADAM19在E10.5和E12.5之间的房室和圆锥心内膜垫中显著表达（图。​（图3三a、 b、e和f；数据也未显示）。这种表达模式与观察到的金属蛋白酶19^−/−老鼠。近端锥管缺损（室间隔缺损、主动脉瓣和肺动脉瓣缺损）的完全外显率与房室缺损（原始口房间隔和三尖瓣缺损）部分外显率的比较金属蛋白酶19^−/−小鼠表明，近端锥管心内膜垫对ADAM19活性的丧失最为敏感。

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图3。

原位mRNA杂交分析心脏和大脑发育过程中ADAM19和神经调节蛋白的表达以及野生型和野生型心脏内膜垫发育的比较金属蛋白酶19^−/−胚胎。用小鼠ADAM19（a、b、E和f）或神经调节蛋白（c、d、g和h）的反义RNA探针探测野生型E10.5（a到d）和E12.5胚胎（E到h）的心脏(51). 在面板b、d、f和h中，星号表示房室内膜垫。在图b和图d中，一个粗箭头指向心房内膜，此处表达ADAM19，但很少表达神经调节蛋白。一个细箭头指向心室内膜，此处有一些神经调节蛋白表达，但很少有ADAM19表达。箭头（b和d）指向锥管流出道的有限背侧区域，此处ADAM19和神经调节蛋白的表达似乎重叠。面板a、c、e和g为亮场；面板b、d、f和h为暗场。（i至n）野生型截面（i和m），金属蛋白酶19^+/−（k） ，或金属蛋白酶19^−/−（j、l和n）E10.5（i和j）、E11.5（k和l）和E12.5（m和n）处的心脏。面板k和l中的切片是用X-Gal染色的杂合（k）心脏或纯合ADAM19突变心脏（l）的E11.5锥管心内膜垫，以检测表达lacZ公司在ADAM19启动子下。位于面板k和l中箭头所示间隙下方的细胞是锥管心内膜垫的一部分。在面板m和n中，心内膜垫用箭头标记。（o至r）用小鼠ADAM19（o和q）或神经调节蛋白（p和r）的反义RNA探针探测E12.5胚胎第四脑室（o和p）或E10.5胚胎发育脊髓（q和r）神经上皮的邻近切片(51). 在图o和图p中，箭头指向第四脑室神经上皮的特定区域中ADAM19和神经调节蛋白共表达增强的区域。在面板q和r中，粗箭头标记背根神经节，细箭头标记脊髓腹角。缩写：A，中庭；V、 心室；锥管心内膜垫；EC，房室内膜垫。

心脏神经嵴细胞对锥管心内膜垫的形态发生有重要贡献，这表明ADAM19可能在神经嵴迁移中发挥作用(24). 此外，相关的ADAM13与神经嵴迁移有关非洲爪蟾(1). 然而，在金属蛋白酶19^−/−小鼠的其他结构依赖于神经嵴细胞的迁移，如胸腺、舌骨、喉和腭，在形态学上表现正常（数据未显示）。此外，金属蛋白酶19^−/−当神经嵴完全迁移到该区域时，野生型胚胎的心内膜垫在E10.5和E12.5处具有相似的形状和细胞数（图。​（图3i，三i、 j、m和n）。最后，当我们用X-Gal染色杂合或纯合突变ADAM19胚胎的心脏切片，以标记表达lacZ公司在ADAM19启动子下，我们发现E11.5处染色细胞的分布没有差异（图。​（图3k三k和l）。这一结果反驳了ADAM19在表达ADAM19的细胞向心内膜垫迁移中的作用。相反，新生儿心脏缺陷金属蛋白酶19^−/−小鼠，尤其是主动脉瓣、肺瓣和三尖瓣增厚和重塑不当的小鼠，更符合ADAM19在表达ADAM19的细胞进入该结构后调节心内膜垫形态发生和重塑的关键作用。

最近的研究表明，缺乏HB-EGF的小鼠也有主动脉瓣和肺动脉瓣增厚(19,20). 此外，缺乏ADAM17的小鼠在处理和激活HB-EGF中起关键作用(34,44)、主动脉瓣和肺动脉瓣增厚缺乏HB-EGF的现象学小鼠(20). 为了测试ADAM19是否也有助于HB-EGF从心内膜脱落，我们在Cos-7细胞中同时表达了这两种蛋白，并比较了在Cos-8细胞中HB-EGF-脱落的情况金属蛋白酶19^+/−和金属蛋白酶19^−/−mEF。为了证实ADAM19在共表达实验中是活跃的，我们包括TRANCE/OPGL，一种破骨细胞分化因子和树突状细胞生存因子，它是ADAM19的已知底物(7)，作为阳性对照（图。​（图44a） ●●●●。当HB-EGF与野生型ADAM19或无催化活性突变体（E>a）共表达时，未观察到组分或PMA诱导的脱落差异（图。​（图4a）。4a） ●●●●。此外，我们在HB-EGF的构成性或PMA刺激的脱落方面与金属蛋白酶19^−/−mEF细胞与杂合对照组相比（图。​（图4b）4b） 或野生型控件（未显示数据）。总之，这些实验反对ADAM19在HB-EGF脱落中的作用。

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图4。

ADAM19在TRANCE、HB-EGF、神经调节蛋白I-β1和神经调节蛋白I-β2的外域脱落中的作用。（a） 碱性磷酸酶标记的候选底物蛋白与野生型ADAM19或催化失活突变体（H电子IGH>HA类IGH；E> A）在Cos-7细胞中。碱性磷酸酶标记TRANCE与野生型ADAM19的共表达与与催化失活突变体共表达相比，显著增加了组分脱落（E>A）。添加PMA只会导致TRANCE脱落的轻微进一步增强，这表明PMA对Cos-7细胞中的ADAM19没有强烈刺激。在平行实验中，与非活性突变体相比，野生型ADAM19与HB-EGF或神经调节蛋白I-β1或I-β2共表达并没有导致成分或PMA刺激的脱落增加。在与白桦等人善意提供的血凝素标记的神经调节蛋白I-β1构建物的共表达实验中也获得了类似的结果(42)（未显示数据）。在所有实验中，候选底物的表达水平以及细胞裂解液中ADAM19的野生型和突变型具有可比性（数据未显示）。（b） 原代mEF中候选底物蛋白的胞外区脱落金属蛋白酶19^−/−或金属蛋白酶19^+/−老鼠。细胞在10岁时被培养⁵（低密度）或3×10⁵（高密度）六孔板的每个孔。相比于金属蛋白酶19^−/−和金属蛋白酶19^+/−低密度或高密度镀mEF（未显示高密度镀表达HB-EGF-和神经调节蛋白I-β2的mEF的结果）。TRANCE脱落在金属蛋白酶19^−/−细胞，可能是因为与其他TRANCE脱落酶相比，这些细胞中ADAM19的表达水平相对较低(40).

ADAM19还与神经调节蛋白I-β的外域脱落有关，神经调节蛋白Iβ是一种对心脏早期发育中适当小梁形成至关重要的蛋白质(26,36,42). 然而，当我们在Cos-7细胞中与野生型或突变型ADAM19共表达神经调节蛋白I-β1或I-β2时，胞外区脱落无明显差异（图。​（图4a）。4a） ●●●●。此外，在稀疏或浓密种子中，神经调节蛋白I-β1和I-β2的组成性或PMA刺激的脱落没有发现明显缺陷金属蛋白酶19^−/−mEFs与杂合或野生型对照组相比（图。​（图4b4b和数据未显示）。当我们比较E10.5和E12.5小鼠胚胎相邻切片中ADAM19和神经调节蛋白的表达模式时，我们发现心内膜垫中很少（如果有的话）同时表达（图。​（图3a三a到h）。神经调节蛋白也与心脏传导系统的发育有关(38)但我们发现新生儿的心电图没有差异金属蛋白酶19^−/−小鼠和野生型小鼠的那些（数据未显示）。综上所述，这些结果表明金属蛋白酶19^−/−小鼠不是由于处理神经调节蛋白I-β1或I-β2的缺陷。ADAM19是否在处理其他神经调节蛋白亚型中起作用尚待确定(11)在这两种蛋白共存的细胞和组织中，例如在心内膜垫上的心内膜和E10.5处发育中心脏流出道的有限部分（图。​（图3b三b和d），第四脑室内神经上皮细胞的一个明确区域（图。​（图3o三o和p），以及脊髓腹角和背根神经节的一部分（图。​（图3q三q和r；另请参阅参考27).

在之前的研究中，已证明ADAM19在骨骼中高度表达(18). 因为ADAM19可以裂解Cos-7细胞中的破骨细胞分化因子TRANCE（见上文和参考文献7)，我们评估了ADAM19是否在骨发育中起作用。原位杂交显示，ADAM19在生长板中紧邻胶原蛋白X表达肥大软骨细胞区的细胞亚群中高度表达（图。​（图55a和b）。ADAM19的表达模式与MMP9相似(48)（图。​（图5a），5a） 此外，在E16.5处，TRANCE似乎与ADAM19共存（图。​（图5b），5b） ，增加了ADAM19参与TRANCE在该特定骨骼区域脱落的可能性。最后，在印度刺猬软骨膜附近和早期肥大软骨细胞远端的高增殖软骨细胞亚群中发现了ADAM19表达的独特域。全贴茜素红和阿尔西安蓝染色以及野生型和非野生型骨切片的形态计量学分析金属蛋白酶19^−/−小鼠在骨发育方面没有发现明显的组织病理学差异（图。​（图5c5c和d以及未显示的数据）。需要进一步研究以评估幸存成人的骨骼金属蛋白酶19^−/−小鼠在骨发育过程中可能不明显的骨重塑中出现更多软组织缺陷。

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图5：。

评估ADAM19在骨发育中的潜在作用。（a和b）野生型E16.5前肢的连续切片与反义探针杂交，以检测ADAM19、基质金属蛋白酶9（MMP9）、印度刺猬（Ihh）、胶原蛋白X（Col-X）（a）和ADAM19或TRANCE/OPGL（b）。ADAM19的表达模式与紧邻肥大细胞区的MMP9（白色箭头）相似，以Col-X的表达为标志。黄色箭头指向Ihh表达域（a）远端增殖软骨细胞中的ADAM19表达。此外，ADAM19的表达与TRANCE/OPGL（b）的表达相似或相同。（c） 全贴茜素红和阿尔西安蓝染色法金属蛋白酶19^−/−,亚当^+/−、和亚当^+/+在E18.5时，同窝出生的三种基因型的骨骼发育情况相当。（d） 茜素红染色全山后爪金属蛋白酶19^+/+和金属蛋白酶19^−/−小鼠在E18.5也表现出类似的发育。

除了心脏和骨骼外，ADAM19 mRNA在肺部也高表达(18). 然而，肺组织病理学分析金属蛋白酶19^−/−,金属蛋白酶19^+/−E14.5和E17.5的野生型胚胎以及所有三种基因型的新生小鼠在缺乏ADAM19的情况下均未显示任何明显缺陷（图。​（图66a到f以及未显示的数据）。

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图6。

在有无ADAM19的情况下，评估肺发育（a到f）和成人心脏（g和h）的超声心动图分析。图a至图f所示部分为野生型（a和c）或金属蛋白酶19^−/−（b和d）胚胎E14.5（a和b；切片用苏木精和伊红[H&E]染色），E17.5（c和d；切片用抗CD34免疫染色以标记血管系统并用苏木素复染），或金属蛋白酶19^+/−（e） 或金属蛋白酶19^−/−（f） 新生小鼠（P1；H&E染色）。a和b中的箭头指向肺组织。肺形态、分支或肺泡极化在金属蛋白酶19^−/−与野生型或金属蛋白酶19^+/−控制。对2个月大小鼠（g和h）成年心脏的超声心动图分析显示金属蛋白酶19^−/−小鼠（h）与野生型对照（g）进行比较。箭头指示面板h和g中心室间隔的位置。缩写：RV、右心室、LV、左心室。

总体分析金属蛋白酶19^−/−小鼠表明，其出生后死亡最有可能是由于室间隔缺损合并主动脉瓣和肺动脉瓣狭窄。出生后，当左右循环正常分离时，持续性室间隔缺损加上肺动脉瓣狭窄会导致右心室容量和压力超载，导致进行性右心室扩张和肥厚。类似畸形（例如，VSD伴肺动脉狭窄和闭锁、法洛四联症）以及主动脉狭窄是人类心衰和死亡的公认原因。观察到的血管异常金属蛋白酶19^−/−小鼠可能会进一步损害心肌灌注。虽然有些金属蛋白酶19^−/−老鼠存活下来，超声心动图显示五只成年老鼠的右心室都扩大了金属蛋白酶19^−/−检查的动物（图。​（图6g6g和h以及未显示的数据）。这与亚致死期心脏缺陷相一致，亚致死期仍与长期但无应激生存相兼容。成人金属蛋白酶19^−/−尽管五分之四的老鼠怀孕了，但它们看起来很健康并且可以生育金属蛋白酶19^−/−小鼠在怀孕后期死亡，可能是由于循环需求增加。事实上，患有类似形式先天性心脏病的成人代表高危产科患者。

先天性心脏病是人类出生缺陷的最常见形式，但对其潜在的分子病因知之甚少(2,8,15,29,43,47). 鉴于小鼠ADAM19在心脏发育中的关键作用，确定某些类型的人类先天性心脏缺陷是否由位于人类染色体5q33.3上的ADAM19突变引起将是一件有趣的事情。迄今为止，只有细胞表面或细胞外基质中的少数蛋白质与心内膜垫的发育有关，包括神经营养素-3(10)，肿瘤生长因子β(5,6)以及相关的BMP6和BMP7(23)，以及最近的HB-EGF和ADAM17(19,20). 现在，我们有兴趣进一步探索ADAM19与这些蛋白以及与心内膜垫转化和/或圆锥管缺损相关的其他分子（如RXRα、smad6和TBX1）之间的潜在功能联系(14,16,21,31,35). ADAM19依赖的细胞-细胞相互作用或通过其细胞质结构域的信号传导也可能有助于其在心脏发育中的作用(39). 我们预计，发现ADAM19在小鼠心脏发育中的重要作用将有助于更好地了解人类先天性心脏病的潜在原因。

致谢

参考文献