介绍
突触重量和神经元兴奋性的变化被认为是记忆记忆的神经基质(Johnston和Narayanan,2008年;马伦卡和熊,2004年). 利用Schaffer侧支CA1突触的细胞外场记录和场刺激进行的研究导致了突触标记和捕获(STC)模型。该模型表明,诱导任何形式的LTP(即持续时间较长的蛋白质合成依赖型L-LTP和持续时间较短的蛋白质合成诱导型e-LTP)的突触以蛋白质合成依赖的方式被标记。L-LTP的诱导导致蛋白质合成,所有标记的突触都可以使用产生的塑性相关蛋白产物(PrPs)来表达L-LTP(弗雷和莫里斯,1997年,1998). 这种促进作用是有时间限制的,无论E-LTP诱导刺激是否先于L-LTP诱导的刺激,反之亦然(弗雷和莫里斯,1997年). 然而,关于促进作用的时间和空间限制以及影响其强度的各种参数,仍有很多未知之处。重要的是,一些模型假设STC通过神经元内突触可用的体合成PrP发挥作用(Barrett等人,2009年;Clopath等人,2008年;弗雷,2001;弗雷和莫里斯,1997年;Okada等人,2009年). 反过来,这将导致在单个细胞水平上,在分散在树突树突中的突触上形成记忆印记。然而,另一种模型将STC与局部活性诱导的蛋白质合成现象结合起来(Martin和Kosik,2002年;Steward和Schuman,2001年)即聚集塑性假设(CPH)(Govindarajan等人,2006年),预测STC倾向于发生在靠近的脊椎之间。这将导致记忆印迹优先形成于树突小室内聚集的突触,如分支(Govindarajan等人,2006年). 突触间限制PrP的竞争将进一步限制印迹到这样一个树突隔室,因为靠近翻译位点的脊椎将耗尽限制PrPs,并降低其在较远脊椎的浓度(Govindarajan等人,2006年). CPH的优点包括提高长期记忆形成和提取的效率,以及为单个神经元提供更大的记忆存储容量(Govindarajan等人,2006年).
对给定脊椎E-LTP水平与其突触标签强度之间的联系、STC发生的空间限制以及单个受刺激竞争脊椎STC的时间动力学的研究需要一种允许刺激和监测单个脊椎反应的方法。然而,过去用于研究STC的场刺激和场记录方法测量了一群未知受刺激突触的平均反应。因此,我们开发了一种方法,在CA1锥体神经元近端顶端树突状分支上的单个棘上使用双光子谷氨酸开盖,以检查参与STC的棘之间的关系。通过荧光蛋白Dendra的双光子成像检查脊柱体积来检测L-LTP的表达(Gurskaya等人,2006年)以及一些实验中的穿孔斑贴电生理学,以测量突触后对谷氨酸去激活反应的变化。我们发现STC在时间上是不对称的,在空间上是局部化的,并且倾向于发生在位于同一树突分支上的受激棘之间。此外,虽然强刺激棘有助于在相邻弱刺激棘诱导L-LTP,但受刺激棘随后会竞争L-LTP的表达。最后,我们证明了在单个树突分支上诱导L-LTP的倾向,而不是在跨分支上诱导。因此,我们提供了支持聚集可塑性假说的第一个实验证据,该假说表明,在单细胞水平上,树突状分支是长期记忆印迹存储的主要单位。
结果
L-LTP和STC可在单脊柱水平诱导和监测
急性切片中的L-LTP可通过使用多间隔电击痛诱发(Frey等人,1988年;Huang和Kandel,1994年). 众所周知,这种L-LTP依赖于多巴胺受体1(D1R)类激活(Frey等人,1991年;Frey等人,1990年;O'Carroll和Morris,2004年;Otmakhova和Lisman,1996年;Sajikumar和Frey,2004年;Sajikumar等人,2008年;Smith等人,2005年;Swanson-Park等人,1999年)和PKA途径(Abel等人,1997年;Huang和Kandel,1994年). 破伤风传递过程中出现的任一途径的拮抗剂只会导致E-LTP的表达。可能是电刺激激活了切片中的VTA终端(O'Carroll和Morris,2004年). 因此,多间隔tetani可能会导致两种平行现象——一种是蛋白质合成依赖的E-LTP,另一种是蛋白合成依赖的LTP,我们称之为L-LTP,它们是可分离的。相反,D1R的使用(O’Carroll和Morris,2004年;Otmakhova和Lisman,1996年;Smith等人,2005年),PKA(Frey等人,1993年)和β肾上腺素能激动剂(Gelinas和Nguyen,2005年)以及微弱的电刺激或BDNF的使用(Kang和Schuman,1995年,1996)导致诱导和表达纯蛋白合成依赖的LTP,而不同时诱导E-LTP。
由于我们有兴趣研究单个视觉识别的脊椎的L-LTP和STC,我们选择针对单个脊椎的谷氨酸去盖,而不是对Schaffer侧支轴突的微弱电刺激。具体地说,我们在缺乏镁的情况下,结合了谷氨酸破伤风无盖疗法(30 4ms脉冲,0.5Hz)+2(哈维和斯沃博达,2007年;Harvey等人,2008年)在沐浴时应用PKA途径激动剂forskolin(我们将其称为GLU+FSK刺激)以诱导L-LTP。该方法提供了一种不同于E-LTP诱导方案的单一刺激L-LTP诱导方案,即在只有一种成分(即毛喉素)不存在毛喉素的情况下的破伤风(我们将其称为GLU刺激)。这使我们能够在不改变多个参数的情况下探索L-LTP和E-LTP之间的相互作用。与诱导E-LTP和L-LTP的多重电强直刺激方案不同,GLU+FSK刺激方案预计只诱导L-LTP(Frey等人,1993年). 因此,我们能够在不同时诱导E-LTP混杂的情况下,研究特定脊髓的L-LTP诱导对其他脊髓的影响。
GLU+FSK刺激引起受刺激脊椎体积的显著变化,而不影响邻近脊椎(,S1A–B、E,躯体电位变化对无盖脉冲的响应如所示S1G系列). 这种体积变化伴随着兴奋性突触后电流(uEPSC)振幅的变化,使用穿孔贴片技术测量(,S1B级)表明我们的方案导致了LTP,而不仅仅是脊柱体积的改变。我们的发现支持了这一点,即脊柱体积的变化与uEPSC振幅的变化具有良好的相关性(图S1C–D). 正如预期的那样,蛋白质合成(翻译)抑制剂茴香霉素或环己酰亚胺的存在完全消除了脊椎体积的变化(),镜像现场记录刺激数据(Frey等人,1988年). 这些数据证实GLU+FSK刺激方案诱导了L-LTP,而不是蛋白合成诱导的E-LTP(Frey等人,1988年;Kelleher等人,2004年). 与之前的研究一致(哈维和斯沃博达,2007年;Harvey等人,2008年;Honkura等人,2008年;Lee等人,2009年;松崎等人,2004年;Yasuda等人,2006年),我们发现GLU刺激(体细胞电位改变,以响应无盖脉冲S1G系列)导致了E-LTP的诱导,即脊柱体积的强大的不依赖蛋白质合成的增加(). 然而,诱导的E-LTP在2.5小时内恢复到基线水平,而GLU+FSK刺激诱导的L-LTP表达至少维持了4小时(,S1E–F级).
L-LTP和E-LTP可在单个脊髓诱导A)在GLU+FSK刺激前(t=0')和刺激后80',强直脊柱(实心圆)和相邻脊柱(开放圆)的示例。B)来自4个脊椎的汇总数据显示,受刺激脊椎的脊椎体积和uEPSC强度同时增加,但相邻脊椎没有增加。C类–D)来自5个实验的汇总数据显示,在实验期间,茴香霉素或放线菌酮的处理抑制了脊椎生长。E)GLU刺激诱导的E-LTP持续时间短于L-LTP,且对茴香霉素不敏感(每个实验8次)。山霉素仅在用开放圆圈指示的实验期间使用。F)来自5个脊椎的汇总数据显示,GLU+SKF刺激后脊椎体积增加。蓝色和绿色条分别代表福斯科林(F中为SKF38393)和茴香霉素。蓝色和红色箭头代表无盖提塔尼。*:相邻钢筋之间p<0.01。†:与相应基线相比p<0.001。GLU:单脊柱谷氨酸破伤风(30次脉冲,每次4ms,0.5Hz);这在图1中使用–,FSK:forskolin(浴用),VEH:载体,ANI:茴香霉素,CHX:环己酰亚胺,SKF:SKF38393。比例尺代表10μm。电生理示踪标尺代表10ms和15pA。标准化以每个脊椎平均基线值的百分比执行。所有数据均为+/-SEM。
如上所述,D1R激动剂SKF38393的浴敷结合弱电刺激已被证明通过激活PKA通路诱导强大的L-LTP(O'Carroll和Morris,2004年;Otmakhova和Lisman,1996年;Smith等人,2005年). 根据这些先前的报告,当我们在特定脊柱上应用SKF38393而不是forskolin和破伤风谷氨酸去套管(GLU+SKF刺激)时,刺激的脊柱增大的程度与GLU+FSK刺激引起的L-LTP增大的程度相似().
在寻找支持CPH的证据时,我们必须首先确定STC可能发生在单个脊椎并确定其参数。因此,我们将GLU+FSK刺激应用于一个脊柱(L1),然后在40分钟后在茴香霉素的存在下对第二个脊柱(L2)进行GLU+FS刺激()或环己酰亚胺(图S2B). 在这两种情况下,L2表现出与L1相同的生长水平(,S2B型). L2的生长依赖于L1刺激诱导的蛋白质合成,因为如果在整个实验过程中使用茴香霉素阻止蛋白质合成,则L1或L2都没有生长()或环己酰亚胺(图S2C). 未刺激的脊柱体积没有变化(数据未显示)。L-LTP的单棘诱导和单棘STC现象都不是切片培养系统的伪影,因为它们也可以在急性海马切片中诱导(图S2D–E). 这些数据表明,STC发生在单脊柱刺激条件下。
STC发生在单个脊椎A)使用GLU+FSK刺激2个脊椎的STC实验示意图,第二个脊椎存在茴香霉素(L1,L2)。B)L1刺激前(t=0')、L2刺激(t=35')和实验结束时(t=100')显示STC的L1、L2棘的示例。C)来自8个实验的汇总数据显示,STC位于L2。D)在L1和L2刺激(5个实验)期间应用樟柳霉素消除STC。E)GLU+FSK刺激脊椎1(L1)后,使用GLU刺激脊椎2(E2)的STC示意图。F)6个实验的汇总数据显示,STC位于E2。G)E2的STC对L1刺激期间存在的茴香霉素敏感,而对E2刺激不敏感(5个实验)。H)5个实验的汇总数据表明,当L1受到GLU+SKF刺激时,E2处发生STC。一)在GLU+SKF刺激L1期间,茴香霉素在L1和E2处阻断了L-LTP(5个实验)。J)GLU+FSK刺激(L2)之前使用GLU刺激(E1)的STC示意图。K)7个实验的汇总数据显示,STC位于E1。L)E1的STC对L2刺激期间存在的茴香霉素敏感(5个实验)。蓝色和红色箭头表示未治愈的破伤风。蓝色和绿色条分别代表forskolin(H,I中的SKF38393)和茴香霉素。*:相邻钢筋之间p<0.01。†:与相应基线相比p<0.001。GLU:谷氨酸破伤风,FSK:福斯科林(浴用),VEH:载体,ANI:茴香霉素,CHX:环己酰亚胺,SKF38393。比例尺代表10μm。标准化以每个脊椎平均基线值的百分比执行。所有数据均为+/-SEM。
我们想确认,在L1和L2刺激下观察到的脊柱体积变化与电生理测量的变化相关。由于在多个小时内保持电池处于穿孔修补状态的技术挑战很大,因此我们采用了不同的技术。我们给不同大小的棘发出单次非鞘脉冲,通过全细胞膜片钳电生理(电压灯)测量棘的突触后反应,即uEPSC振幅,并将其与棘头的体积进行比较。我们发现,与公布的数据一致(Asrican等人,2007年;Matsuzaki等人,2004年;Smith等人,2003年)在脊椎测得的uEPSC振幅与其体积成正比(图S3A-E). 由于此关系在切片内的各个单元格之间保持不变(图S3BE;(Smith等人,2003年)),脊椎的初始突触后强度可通过从切片内不同细胞获得的脊椎体积到uEPSC振幅校准函数进行计算。因此,我们记录了与感兴趣细胞(细胞2)相邻的细胞(细胞1)沿着树突分支的不同棘的uEPSC振幅,以确定棘体积到uEPSC振幅校准函数。然后,我们通过刺激细胞2中类似分支上的两个棘L1(GLU+FSK刺激)和L2(在茴香霉素存在下GLU+FSK刺激)在细胞2中诱导STC,然后在实验结束时对细胞2中的L1、L2和相邻棘进行全细胞记录和单棘刺激,以确定受刺激和邻近脊椎的强度。我们通过将最终uEPSC振幅归一化为初始uEPSC幅度来估计L1和L2的增强作用,初始uEPSC-幅度是使用先前计算的来自细胞1的校准函数从L1和L2的初始脊柱体积估计的。我们发现L1和L2都经历了增强(,图S3F–G)而相邻脊髓的体积和uEPSC估计振幅均无变化。将这些数据与和S1B–D级以及来自文献的数据(田中等人,2008年),我们得出的结论与E-LTP的情况类似(Asrican等人,2007年;哈维和斯沃博达,2007年;松崎等人,2004年)我们在接受GLU+FSK刺激的脊椎和发生STC的脊椎观察到脊椎体积增加,这表明增强作用发生了变化。因此,在剩下的实验中,我们使用脊柱体积变化作为L-LTP和E-LTP的测量值。
表1
(也绘制为图S3F–G):生长的脊柱也显示uEPSC振幅增加来自八个受刺激脊椎的数据表明,体积增加的脊椎也增加了uEPSC强度。通过将最终uEPSC标准化为文本(第8页)中所述的估计初始uEPSC,确定uEPSC变化百分比。阴影成对的行表示同一实验中的两个不同的受刺激脊椎。
Δ体积(%) | ΔuEPSC变化(%) | 相邻ΔVol(%) | 相邻ΔEPSC(%) | 刺激类型 |
---|
177 | 296 | 95 | 92 | L-LTP(60英尺) |
195 | 278 | 94 | 109 | L-LTP(60英尺) |
156 | 170 | 101 | 98 | LI(100英尺) |
167 | 178 | 101 | 98 | L2(100英尺) |
164 | 181 | 95 | 93 | LI(100英尺) |
183 | 197 | 95 | 93 | L2(100英尺) |
189 | 193 | 100 | 94 | LI(100英尺) |
155 | 179 | 100 | 94 | L2(100英尺) |
102 | 98 | 104 | 102 | E-LTP(270英尺) |
93 | 116 | 97 | 98 | E-LTP(270英尺) |
97 | 107 | 107 | 110 | E-LTP(270英尺) |
199 | 197 | 103 | 113 | 李(270’) |
233 | 249 | 103 | 113 | E2(270英尺) |
187 | 229 | 107 | 102 | 李(270’) |
231 | 298 | 107 | 102 | E2(270英尺) |
203 | 238 | 107 | 105 | 李(270’) |
195 | 205 | 107 | 105 | E2(270英尺) |
类似于使用现场记录和刺激从一群突触中获得的数据(弗雷和莫里斯,1997年)我们发现在一个脊柱(L1)处的GLU+FSK刺激,然后在第二个脊柱(E2,)导致L-LTP不仅在L1而且在E2表达,再次证明了STC在我们的单脊柱刺激系统中(,S2A公司). 这种效应不是由于福斯科林在L1刺激中的残余效应引起的,因为当L1没有给予去盖脉冲时,E2没有表达L-LTP(图S4A). 这种增加与E2刺激引起的蛋白质合成无关,但依赖于L1刺激引起蛋白质合成(). 当L1被给予GLU+SKF刺激而不是GLU+FSK刺激时,也获得了类似的数据(). 此外,使用上述uEPSC-电位估计方法,我们发现E2脊椎体积的这种变化伴随着突触强度的增加(,图S3F–G). 与在人群水平上测量的STC类似(弗雷和莫里斯,1998年),单脊柱水平的STC在时间上是双向的,因为在GLU+FSK刺激第二脊柱(L2;)导致L-LTP在两个脊髓的表达(). L-LTP的表达需要L2的蛋白质合成().
STC的时间双向性是不对称的
STC的一个重要组成部分是突触标签和速率限制PrP的寿命都有限(弗雷和莫里斯,1997年,1998). 然而,还没有确定这两种寿命有多不同,这是理解STC时间双向性动力学的关键点。为了确定速率限制性PrP的寿命,我们对两个棘(L1,L2)施加GLU+FSK刺激,仅在L2刺激期间存在茴香霉素,并改变L1和L2刺激之间的时间。L2的STC效率与速率限制PrP的浓度成正比(Frey和Morris,1997年)与L1和L2刺激之间的时间呈负相关()只有在L1刺激后90分钟内刺激L2时才会发生STC。这些数据表明,速率限制PrP在90分钟内衰减。当我们用不含茴香霉素(E2;). 为了确定突触标签的寿命,我们先对一个脊椎(E1)进行GLU刺激,然后再对第二个脊椎进行GLU+FSK刺激,改变E1和L2刺激之间的时间。我们发现STC效率,这被认为是标签强度的衡量标准(弗雷和莫里斯,1998年)与E1和L2刺激之间的时间间隔呈负相关,STC在90分钟内完全发生,但在3小时内消失(). 因此,STC的时间双向性与标签的寿命(大约120分钟,)与速率限制PrP的寿命不同(约90分钟,). 这些数据表明,信息到达枝晶的时间顺序对于确定其作为稳定印迹的一部分是如何巩固的很重要。
STC的时间双向性不是对称的A类–B)改变L1(GLU+FSK刺激)和L2(GLU+FSK与山莨菪碱刺激)刺激之间的时间(A类)或L1(GLU+FSK刺激)和E2(GLU刺激)刺激(B)证明了速率限制PrP的寿命,由L2的STC效率测量(A类)或E2(B),不到90分钟。(A、 B类:两者p<0.001;n=3(每个时间点)C)改变E1(GLU刺激)和L2(GLU+FSK刺激)刺激之间的时间显示,用E1的STC效率测量突触标记的寿命大于90分钟,小于180分钟。(p<0.001;每个实验n=3)D)L2刺激前的E1体积和实验结束时的E1之间的强相关性表明,L-LTP诱导或表达稳定了之前诱导的E-LTP表达,而不会改变其大小。E)阈下刺激对脊柱体积没有影响(6个实验)。F)GLU+FSK刺激一个脊柱(L1)导致第二个脊柱(S2)STC,随后进行阈下刺激(6个实验)。G)早期进行阈下刺激时,GLU+FSK刺激一个脊柱(L2)不会导致第二个脊柱(S1)出现STC(6个实验)。黑色和蓝色箭头分别表示阈下(1ms)和正常(4ms)无电流破伤风。蓝色条代表forskolin。*:相邻钢筋之间p<0.01。†:与相应基线相比p<0.001。GLU:谷氨酸破伤风,FSK:福斯科林(浴用)。标准化以每个脊椎平均基线值的百分比执行。所有数据均为+/-SEM。
在单个脊柱水平诱导和观察STC的能力也使我们能够将单个脊柱E-LTP表达的大小与突触标记的强度联系起来。这是不可能的,因为现场记录和刺激可以测量一组突触的平均反应。我们发现E-LTP表达强度(在L2刺激前测量为E1体积)与突触标记强度(在L2刺激后测量为E13小时的体积)之间有很强的相关性,认为这与突触标签强度成正比;). 这表明当GLU刺激先于GLU+FSK刺激时,突触标签的强度与E-LTP表达水平密切相关。在这些条件下,给予GLU刺激的脊髓的L-LTP水平通常低于给予GLU+FSK刺激的脊髓(). 另一方面,当GLU刺激紧接着GLU+FSK刺激时,给予GLU刺激的脊柱L-LTP(E2)的大小与给予GLU+FS刺激的脊柱的L-LTP的大小相似().
因此,我们假设PrP在稍后刺激的脊椎处增强标签,而不是更早。为了验证这个想法,我们使用了一个亚阈值刺激(每个非触发激光脉冲持续1ms,而不是4ms),这与之前报道的数据一致(Harvey和Svoboda,2007年),没有引起脊柱体积的变化(). 当在GLU+FSK刺激另一脊椎(L1)后对脊椎(S2)进行该刺激时,L1和S2的脊椎体积均显著增加(). 类似于L1–L2刺激()和L1-E2刺激()实验表明,这种生长依赖于L1刺激期间的蛋白质合成,而不是S2刺激(数据未显示)。然而,当在GLU+FSK刺激第二个脊柱(L2)之前,对一个脊柱进行相同的阈下刺激(S1)时,S1处没有生长,而L2生长正常(). 这些数据支持这样一种假设,即PrP增强了在其产生后刺激的脊髓处的标签,而不是早期刺激的脊髓。因此,尽管STC在时间上是双向的,但这两个方向是不同的,这不仅是因为突触标签和限速PrP的寿命不同,还因为L-LTP的诱导或表达似乎有助于在较晚刺激的棘处形成标签,而不是在较早刺激的棘处形成标签。
STC支持CPH的空间定位和树枝分支偏倚
在单脊柱水平建立STC并揭示其不对称双向性后,我们接下来研究了STC发生的空间跨度,这是CPH的核心问题(Govindarajan等人,2006年). 参与STC的脊椎之间的空间关系无法使用场刺激进行研究,因为它会激活许多未识别的脊椎。但是,在我们的系统中,可以通过改变两个棘之间的距离来研究它,这两个棘都被给予GLU+FSK刺激(L1,L2),只有L2刺激在茴香霉素存在下进行。这使我们能够确定STC发生的距离是否有限制。我们发现STC的效率与距离成反比,当两个受刺激脊髓之间的距离达到70μm时,STC几乎无法检测到(). 当L2处用茴香霉素刺激GLU+FSK被不含茴香霉肽的GLU刺激取代时,也得到了同样的结果(E2;).
STC的空间定位证明了簇状塑性假设(CPH)A)左侧面板显示了间距为50μm的同一分支上受激的两个棘的示例(沿树枝晶测量),而右侧面板显示了相邻分支上间距为48μm的两个受激棘的示例。在这两种情况下,对脊髓(L1,L2)进行GLU+FSK刺激。在茴香霉素存在下于45分钟刺激L2。B)几个实验的量化表明,STC的效率随着距离的增加而降低,并且受刺激的棘位于不同的分支上。C)用GLU刺激取代L2证实,STC效率随着受刺激脊髓之间距离的增加而降低。比例尺代表10μm。标准化以每个脊椎平均基线值的百分比执行。所有数据均为+/-SEM。
接下来,我们重复了相同的实验,但将L2移动到了一个姊妹分支。L1和L2始终位于三级树突上,刺激之间的时间间隔保持不变,为45分钟。我们发现,在这种受刺激脊柱对的配置中,STC的效率显著降低,并且当L1和L2之间的距离为50μm或更大时,没有看到STC(). 这与上述来自同一分支上两个棘的数据一起表明,正如CPH预测的那样,STC很可能是一个优先在树枝状分支水平上运行的局部过程(Govindarajan等人,2006年). 这种对STC更有效地发生在单个分支上的偏向可能是由于分支点处新合成的蛋白质被稀释而被动发生的,也可能是通过分支点处存在的某些特定生化机制发生的。
STC表达竞争也支持CPH
如果PrP在有限的树突状隔间内有限的时间内可用,在短距离和时间内刺激多个输入是否会导致限制PrP的竞争?事实上,CPH还预测,受刺激突触之间对限制性PrPs的竞争将进一步导致记忆印迹以空间聚集的方式存储,因为限制性PrPs将被靠近翻译位点的棘所耗尽(Govindarajan等人,2006年). 以前已经证明,使用场刺激和场记录方法,当蛋白质库受到限制时,不同的输入可以竞争PrP(Fonseca等人,2004年)通过应用翻译抑制剂。然而,在更多生理条件下(即在没有翻译抑制剂的情况下),蛋白质库是否确实会受到限制尚待确定。我们还想使用我们的单脊椎方法来研究在多刺激脊椎可能竞争限制PrP的情况下,单个脊椎变化的时间动力学。为了达到这些目的,我们用GLU+FSK刺激同一分支(标记为L1和L2)上相隔一分钟的两个10μm和20μm的棘,目的是增加刺激棘的数量,直到L-LTP表达受到抑制。我们发现,与只刺激一根脊椎相比,只刺激两根脊椎已经使两根脊椎达到最大体积的速度变慢(与相比,S1A–B,以量化). 通过分析竞争性脊椎的时间动力学,我们发现在最初的30分钟内,L1和L2的体积在刺激后的时间段内出现了较大的相关波动,因此一个脊椎的增长伴随着另一个脊柱的收缩(示例如,S4B–D系列,以量化). 相反,在基线期和刺激后40分钟或更长时间点之间没有显著相关性。此外,受刺激的脊椎和未受刺激的相邻脊椎之间也没有相关性()表明竞争是特定于受刺激的脊椎。这些数据表明,在一定时间内树突状隔室中产生的蛋白质数量有限,因此,在空间和时间上紧密刺激的两个棘可能会竞争可用的蛋白质,从而竞争L-LTP的表达。这可能是由于树突分支的翻译机制和/或mRNA相对有限(与体细胞相比)(Schuman等人,2006年). 活性诱导的mRNA降解也可能导致这种现象(Giorgi等人,2007年). 这些结果还表明,脊椎生长是一个双向而非单向的动态过程。
脊椎之间的竞争A)7个实验的汇总数据表明,与刺激一个脊柱(GLU+FSK刺激)相比,刺激两个脊柱(间隔10μm–20μm;L1,L2;GLU+FS K刺激)1min会导致两个脊柱的生长较慢。B)当刺激单个脊柱时,比较两例患者的脊柱生长(和图S1A)或连续刺激间隔10μm~20μm的两个棘。C)代表性实验显示,刺激后30分钟内,但35分钟后,生长和收缩是互补的。D)L1脊柱体积的变化与L2脊柱体积每5min的变化之间的相关性表明,L1和L2在刺激前和刺激后35min独立增长。然而,在刺激后的最初30分钟内,一根脊椎以另一根为代价生长。图表上的每个时间点表示使用6个独立实验的脊椎的两个连续时间点之间的体积差异。E)与…对比D类在0–30分钟内,受刺激的棘与其相邻棘之间没有相关性,这表明竞争是受刺激棘特有的。F)来自6个实验的汇总数据表明,GLU刺激(E3)刺激的第三个脊椎可以与早期GLU+FSK刺激的脊椎竞争生长(L1,L2)。G)通过比较E3刺激后30分钟L1和L2的平均增长与无E3刺激时L1和L2的平均增长(从).H)在稍后的GLU刺激之前,用GLU+FSK刺激两个脊柱(L1后的E3,L2)降低了稍后刺激的效率,相比之下,在稍后的刺激之前,只刺激一个脊柱(从). 蓝色、青色和红色箭头代表未经雕刻的提塔尼。蓝色条代表毛喉素。*:相邻钢筋之间p<0.01†:图5B中30'时间点1和2个脊柱的比较p<0.05。GLU:谷氨酸破伤风,FSK:福斯科林(浴用)。标准化以每个脊椎平均基线值的百分比执行。所有数据均为+/-SEM。
后期受刺激的脊椎还能与早期受刺激的脊柱竞争吗?为了解决这个问题,我们对第三根脊椎(E3)进行了GLU刺激,距离L1 5μm到15μm,30分钟后,L1和L2都增长了,但没有达到最大水平。我们发现,E3的刺激减缓了L1和L2的生长()与之前只刺激L1和L2的E2相比,之前刺激L1或L2会降低E3的生长(). 当E3处的GLU刺激被GLU+FSK刺激替换为茴香霉素(L3)刺激时,也得到了类似的结果;图S4E–G). 因此,我们证明,在单个脊椎水平上,脊椎可以相互竞争L-LTP的表达,可能是由于对PrP的竞争。
L-LTP诱导的树枝状分支偏倚
NMDA谷氨酸受体(NMDAR)是诱导多种形式突触可塑性所必需的,只有在不被镁阻断时才能被激活+2离子(马伦卡和熊,2004年). 这种受体的解封被认为是发生的体内通过多个AMPA谷氨酸受体协同激活引起的去极化(马伦卡和熊,2004年). 在迄今为止所描述的实验中,我们使用了0mM Mg+2在不刺激多个脊椎的情况下激活NMDAR。因此,我们能够研究STC,而无需在多个脊髓处诱导L-LTP的混杂。然而,在生理条件下,镁的浓度+2为0.8–1.2毫米(Chutkow,1974年). 为了模拟这种条件,我们试图建立一个协议,允许在1mM Mg存在的情况下诱导LTP+2以假同步方式刺激多个脊椎(Losonczy和Magee,2006年;Losonczy等人,2008年). 该方法使用更高浓度的MNI谷氨酸(10mM)和更短的脉冲(0.1ms)来快速激活多个棘。我们首次证实,在0mM Mg条件下使用谷氨酸去壳法可以诱导L-LTP、E-LTP和STC+2使用单脊柱刺激方案(图S5A-C).
然后,我们尝试通过假同步(<6ms)刺激单个斜三级树突分支内的多个棘来诱导L-LTP(Losonczy和Magee,2006年;Losonczy等人,2008年)含1mM Mg的ACSF+2,2mM钙+2和100μM的D1R激动剂SKF38393(GLU+SKF刺激)。由于技术原因,脊椎必须位于同一z平面上,彼此之间的距离不得超过20μm。由于不知道以这种方式诱导L-LTP需要刺激多少棘,所以在不同的实验中刺激了不同数量的棘。当我们在所有实验中编制归一化脊柱体积的频率分布时,我们发现刺激后脊柱体积的分布由双峰分布描述(图S5D). 大多数数据点是一种模式的一部分,该模式与基线期间所见波动导致的脊柱体积分布无法区分。然而,有些数据点是第二种模式的一部分,具有更高的归一化体积(图S5D). 我们将这些数据点定义为增强的棘,并发现这些数据点是由一小部分受到刺激的棘体积显著增加(例如,插入,以量化). 我们还量化了增强的脊椎数量,作为受刺激脊椎数量的函数,并确定当12个或更多的脊椎受到刺激时,一小部分受刺激的脊椎被增强,而当10个或更少的脊椎受刺激时,没有脊椎被加强(). 这种增强作用依赖于蛋白质合成,因为当刺在茴香霉素的存在下受到刺激时,这种增强作用被消除了(图S5E). 未经刺激的脊椎从未增强(数据未显示)。
刺激多个脊髓诱发的L-LTPA)具有14个受刺激脊椎的分支示例(标有*)。插图中包含了脊椎强化(右侧)和非强化(左侧)的示例。B、 C)来自81个脊椎的汇集数据显示了增强脊椎(13个脊椎)和非增强脊椎之间的差异(68个脊椎。增强脊椎被定义为脊柱体积双峰分布中较大模式的一部分,如图S5D并在文本中进行了描述。D)来自81个脊椎的汇总数据显示了随着时间增强的脊椎数量。每个数据集都是一个单独的实验,其图例显示了实验期间刺激的脊椎数量。因此,当刺激不到10个棘时,没有棘被增强。E)例如,在两个姊妹枝上有14个受刺激的棘(标有*)。F)来自56个脊椎的汇总数据表明,当受刺激的脊椎在树枝上分裂时,没有脊椎增强。每个数据集都是一个单独的实验,其图例指示了实验期间刺激的脊椎数量。蓝色条表示添加SKF38393的时间(持续5分钟),蓝色箭头表示未接种破伤风疫苗的时间(100次脉冲,每次0.1ms,2Hz)(图6中表示为GLU)); 破伤风的每一次“脉冲”都会在<6ms内刺激所有脊椎)。†:受刺激状态和基线状态之间p<0.05,*:增强状态和非增强状态之间(B)或<=10个棘和>10个棘之间(D)p<0.05。比例尺代表5μm。标准化以每个脊椎平均基线值的百分比执行。所有数据的平均值为+/-SEM。
我们重复了这个实验,但这次将受刺激的脊椎分成两个姊妹三级尖斜支(例如). 在这些条件下,我们无法在任何脊柱处诱导脊柱体积变化(). 因此,除STC外,L-LTP本身的形成倾向于更多地发生在单个树枝状分支上,进一步支持集群塑性假说。
L-LTP、E-LTP和STC伴多棘刺激
然后我们比较了多棘刺激诱导的L-LTP和E-LTP的表达。在这些实验中,通过GLU+SKF刺激(用于L-LTP诱导)或GLU刺激(用于E-LTP诱导。我们发现,在这两种情况下,脊椎可以分为两个种群——增强型和非增强型(). 正如预期的那样,表达E-LTP的脊柱体积在3小时内下降到基线()而在整个实验过程中,表达L-LTP的脊髓体积保持升高(). 有趣的是,表达E-LTP的脊椎的比例高于表达L-LTP的脊柱的比例().
多棘刺激诱导的L-LTP、E-LTP和STCA)来自5个实验的汇总数据表明,D1R激动剂SKF38393的浴敷结合14个棘的假同步刺激导致增强和非增强棘之间的棘体积存在显著差异。脊柱体积的增加在整个实验过程中持续。B)来自5个实验的汇总数据表明,对14个脊椎的假同步刺激导致增强型和非增强型脊椎的脊椎体积存在显著差异。然而,增强的脊髓体积在3小时内恢复到基线。C)数据的量化A、 B类显示脊柱体积增加具有统计学意义。D)来自5个实验的汇总数据表明,在我们的条件下,接受L-LTP的脊椎数量少于接受E-LTP的脊柱数量。E)当SKF38393与14个棘(L1)的假同步刺激一起浴敷时,40分钟后再对另一组14个棘进行假同步刺激(E2),可以看到4组增强的棘(为了清楚起见,图中未显示无触角的棘)。在整个实验过程中,一些L1棘(蓝色实心圆圈)增强,而一些在E2刺激前增强的L1脊(蓝色开放圆圈)不久后恢复到基线。在E2刺激增强的脊髓中,也有两组。大多数棘突(红色开放棘突)恢复到基线,但一些(红色实心圆圈)在其余实验期间保持增强。F)来自5个实验的汇总数据显示了属于四组的脊椎数量D类注意,在30'和270'时增强的L1棘的数量存在统计差异,并且在270'处增强的E2棘的数目与0显著不同。此外,在30'和270'增强的脊椎总数之间没有统计差异。G)脊椎从非触角状态过渡到增强状态的概率图(上半部分),反之亦然(下半部分)。在E-LTP的情况下,在5分钟时有一个初始的增强爆发,然后是120分钟到180分钟的非抑制期。在L-LTP的情况下,在刺激后的前60分钟内,增强和非增强都发生了显著的量。因为增强的棘的数量是恒定的(D),这支持了脊椎之间的竞争。蓝色条表示添加SKF38393的时间(持续5分钟),蓝色、红色箭头表示破伤风解封时间。†:后期时间点和基线条件之间p<0.05,*:增强和非增强状态之间p<0.05(图7C),60分钟到240分钟之间(图7D)或30分钟到270分钟之间(见图7F)。SKF:SKF38393。谷氨酸脱羧酶:谷氨酸脱羧酶引起的破伤风。标准化以每个脊椎平均基线值的百分比执行。所有数据均为+/-SEM。
当一组14个脊髓在另一组14条脊髓给予GLU+SKF刺激(L1s)40分钟后接受GLU刺激(E2s)时,我们发现了STC的证据。如所示在整个实验期间,E2组中有一个脊椎亚群的脊椎体积增加(STC;,填充红色圆圈,,填充红色条)。因此,以类似于我们之前在0mM Mg中使用单一脊柱刺激方案进行的实验的方式+2、L-LTP、E-LTP和STC均可由生理镁作用下多个棘的协同激活诱导+2条件。
当我们检查接受GLU+FSK刺激的脊椎集合(L1)时,我们注意到有一个脊椎亚群在E2脊椎GLU刺激前增强,但在给予GLU刺激后不久其体积恢复到基线(,打开蓝色圆圈)。这些数据得到了这些实验中增强的脊椎数量的量化支持。作为显示,E2的刺激导致增强的L1棘的数量减少,同时伴随着一组E2棘,这些E2棘现在在整个实验的剩余时间内表达LTP。有趣的是,E2刺激前增强的脊髓总数与实验结束时增强的脊髓总量在统计学上无法区分。这支持了我们的模型,即诱导E-LTP的脊椎可以与诱导L-LTP的脊柱竞争,这反过来又进一步支持CPH。
通过对个体脊柱动力学的详细检查,获得了L-LTP表达期间竞争的进一步证据(示例如图S5F–H)L-LTP和E-LTP表达期间。我们研究了从非触角态到增强态的跃迁概率,发现在L-LTP诱导后的前60分钟内,许多棘从非触手态过渡到增强态(,上半部,蓝线)。这由数量大致相等的脊椎进行相反的过渡来平衡(,下半部,蓝线)导致恒定数量的增强棘(). 相反,在E-LTP诱导后,有一个最初的增强爆发(,上半部,红线),然后是120分钟的时间段,在此期间脊椎体积保持稳定,然后是120-180分钟的放松期(,下半部,红线)。因此,我们的数据表明,脊髓之间存在L-LTP竞争,但E-LTP表达没有竞争。