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神经元。作者手稿；PMC 2011年12月9日提供。
以最终编辑形式发布为：
神经元。2010年12月9日；68(5): 857–864.
数字对象标识：10.1016/j.neuron.2010.11.036
预防性维修识别码：项目经理3032425
美国国立卫生研究院：美国国立卫生研究院256484
PMID：21145000

外显子序列显示VCP公司突变是家族性ALS的病因

珍妮尔·约翰逊，BS，1,* 杰西卡·曼德里奥利，医学博士，2,* 迈克尔·贝纳塔，医学博士，三，* 叶夫根尼亚·阿布拉姆松,1,* 维维安娜·范·德林，医学博士，4 约翰·特洛伊亚诺夫斯基，医学博士，4 J拉斐尔·吉布斯、理学学士、，5,6 毛拉·布鲁内蒂,7 苏珊·格朗卡，注册护士，三 乔安娜·乌乌、ScM、，三 金辉鼎，博士，5 利奥·麦克卢斯基，医学博士，8 玛丽亚·马丁内兹-年龄,4 达娜·法尔科内，毫秒，4 德纳·G·埃尔南德斯，理学硕士，6,9 桑帕特·阿雷帕利，毫秒，9 肖恩·冲、理学学士、，9 詹妮弗·施米克，博士，1 杰弗里·罗斯斯坦，医学博士，10 弗朗西斯科·兰迪,11 迈克尔·王,12 安德里亚·卡尔沃，医学博士，13 加布里埃尔·莫拉，医学博士，14 马里奥·萨巴泰利，医学博士，15 玛丽亚·罗萨里亚·蒙苏尔，医学博士，16 斯特凡妮娅·巴蒂斯蒂尼，医学博士，17 法布里奇奥·萨尔维，医学博士，18 罗塞拉·斯帕塔罗，医学博士，19 帕特里齐亚·索拉，医学博士，2 朱塞佩·博格罗，医学博士，20意大利，21 朱利安娜·加拉西，医学博士，2 Sonja W.Scholz公司，医学博士，9,22 J.保罗·泰勒，医学博士，12 加布里埃拉·雷斯塔尼奥，医学博士，7,† 阿德里亚诺·奇奥，医学博士，13,†和布莱恩·J·特雷纳，医学博士1,10,†,加利福尼亚州
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

总结

通过外显子组测序，我们在含缬酪肽蛋白(VCP公司)意大利常染色体显性遗传肌萎缩侧索硬化症（ALS）家系的基因。中的突变VCP公司先前在包涵体肌病、佩吉特病和额颞痴呆（IBMPFD）的家族中发现。筛选VCP公司在210例家族性ALS病例和78例尸检证实的ALS病例的队列中，发现了四个额外的突变，包括病理证实的ALS病例中的p.R155H突变。VCP蛋白对含泛素的自噬体的成熟至关重要，突变VCP毒性部分通过其对TDP-43蛋白的影响介导，TDP-43是泛素内含物的主要组成部分，是神经病理学上表征ALS的特征。我们的数据拓宽了IBMPFD的表型，包括运动神经元变性，表明VCP突变可能占家族性ALS的约1–2%，并首次证明运动神经元变性中泛素化/蛋白降解途径存在缺陷。

引言

肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种致命的神经退行性疾病，其临床特征是上下运动神经元功能障碍，导致快速进行性瘫痪和呼吸衰竭死亡。该病的病理特征包括运动神经元丢失导致皮质脊髓束苍白，存活运动神经元内存在泛素阳性内含物，以及病理性TDP-43聚集物沉积(Neumann等人，2006年). 症状出现后的中位生存期为三年，这反映了该病的破坏性以及缺乏有效的疾病改善疗法。

罕见家族型ALS基因的鉴定对我们理解典型ALS的分子机制有着重要影响(Rowland和Shneider，2001年). ALS领域正在进行的许多分子生物学研究都是基于编码基因突变的发现钠1,TDP-43型和保险丝(Kwiatkowski等人，2009年;Rosen等人，1993年;Sreedharan等人，2008年;Vance等人，2009年). 每一个与ALS病因学相关的新基因都为运动神经元变性的发病机制提供了基本的见解，并有助于疾病建模以及靶向治疗药物的设计和测试；因此，鉴定新的基因突变引起了人们极大的兴趣。

基于人群的流行病学研究估计，大约5%的ALS病例是家族性的(Chió等人，2008年). 其中，约15%是由钠1基因(Chió等人，2008年)，另有3-4%的病例是由于TDP-43型和保险丝基因(Kabashi等人，2008年;Chió等人，2009年;Mackenzie等人，2010年). 由于缺乏来自多代大家庭的样本，主要是由于与诊断相关的寿命显著缩短，旨在寻找更多家族性ALS基因的连锁和位置克隆研究变得复杂。

全外显子组测序是一项新技术，它利用下一代平台的大规模并行测序能力，快速识别约1%编码蛋白质的基因组中的罕见变体。外显子组测序的威力源于这样一个事实，即大多数单基因疾病都是由基因组中这个蛋白编码部分的突变引起的，而这项技术发现新致病基因的能力已经得到证明(Choi等人，2009年;Ng等人，2010年;Ng等人，2009年). 此外，全外显子组测序现在是检测小家庭中致病性变体的一种现实策略，因为受影响个体的DNA样本不足，因此无法进行连锁分析。

在本报告中，我们描述了一个常染色体显性ALS表型家族的外显子组测序，其中钠1,TDP-43型和保险丝为了确定导致疾病的潜在遗传损伤，先前排除了突变。

结果

ITALS#1血统描述

我们研究了一个四代意大利家庭（ITALS#1），其中四个人被诊断为ALS。这个家族的血统如所示图1A，其临床特征详见补充数据和总结如下表1简单地说，所有四名ALS患者都出现了肢体运动神经元症状(图1A，个体III:4，III:8，III:12，IV:1）。先证者（II:5）的一名父母死于58岁的痴呆症、帕金森综合征、佩吉特氏病和上肢肌肉无力，该先证者的一名兄弟姐妹（II:4）在51岁死于呼吸衰竭之前使用轮椅。四名ALS患者的临床病程特点是明确的上下运动症状影响所有四肢和延髓肌肉组织，导致进行性四肢瘫痪和残疾。症状出现一年内对个体III:12进行的神经心理测试表明额叶轻度功能障碍。每例患者的神经传导研究和肌电图显示，广泛进行的失神经和慢性神经再支配改变与ALS一致。碱性磷酸酶在正常范围内，因此排除了伴随佩吉特病的诊断。DNA样本来自三个第三代和第四代人，他们被专门研究ALS的神经科医生（AChió和JM）诊断为ALS。ITALS#1血统的任何成员都无法获得尸检材料。

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患有以下疾病的患者的家谱VCP公司突变。突变等位基因表示为公吨，而野生型等位基因由重量。探针用箭头表示。为了保护隐私，血统成员的性别被掩盖。根据Coriell网站上的可用家族史信息，构建了Coriell NINDS存储库中家族样本的谱系(网址：www.coriell.org).

表1

VCP公司ALS发病和病程数据的突变。另请参阅表S2ALS病例和对照的人口统计学和临床详细信息VCP公司突变。

血统*个人ID突变†诊断发病年龄发病部位认知障碍发病后疾病持续时间（生命状态）ALP（单价）CPK（单位/升）
国际贸易术语解释通则#1三： 4个191Q兰特
c.961G>A†		肌萎缩性脊髓侧索硬化症51上肢无减值。
未经正式测试		11个月时通气（29个月时死亡）正常正常
III： 8个191Q兰特
c.961G>A		肌萎缩性脊髓侧索硬化症53上肢和下肢正式测试无减值34个月龄时通风（存活）正常正常
三： 12个191Q兰特
c.961G>A		ALS-FTD公司50下肢正式测试受损活了4.5岁正常385
四： 1个191Q兰特
c.961G>A		肌萎缩性脊髓侧索硬化症37下肢正式测试无减值活到4岁正常500–900
USALS#1三： 4个159G兰特
约864C>G		ALS-FTD公司53下肢在正式测试中受损
无减值。		24个月时通风（存活）#无数据无数据
三： 6个159G兰特
c.864C>G		肌萎缩性脊髓侧索硬化症46下肢未经正式测试
无减值。		5年后死亡高架无数据
科瑞尔#1第13215页191Q兰特
c.961G>A		肌萎缩性脊髓侧索硬化症42下肢未经正式测试
无减值。		活到12岁无数据无数据
科瑞尔#2编号09607第592N页
c.2163G>A		肌萎缩性脊髓侧索硬化症52灯泡未经正式测试
无减值。		一年内死亡无数据无数据
UP731型三： 1个c.853G>A
155H兰特		肌萎缩性脊髓侧索硬化症53上肢未经正式测试39个月时死亡正常正常
*看见图1家谱；
†三： ITALS#1家族的4号是该突变的专性携带者；
#共存肺部疾病加速呼吸衰竭；
三： UP731家族的1是该突变的专性携带者。

ITALS#1家系的外显子序列测定

对从ITALS#1家族两个受影响成员获得的DNA进行外显子组测序(图1A，ITALS#1，III:12和IV:1）使用SureSelect Exome靶富集技术，然后在基因组分析仪IIx上进行配对测序。这为患者III生成了3.48千兆字节的可校准序列数据：12个（中值读取深度=40，读取>10的碱基对=79·9%），而患者IV生成了3.53千兆字节：1个（中值读深度=37，读取>10的碱基对=76·1%）。对两名患者的外显子组的相同部分进行测序（r2=0.92比较每个样本中每个目标序列（诱饵）的读取次数）。筛选后，在1000个基因组或dbSNP数据库中，有75个杂合编码变体和13个杂合代码索引，之前未被识别为变体，并且两个患者共享(图2). 在另一个受影响成员（III:8）中对这些变体进行Sanger测序，将该列表减少到24个变体和9个indels（参见表S1). 其中，根据ITALS#1家系的连锁分析，只有四个变异位于18个基因组区域内，LOD得分大于零（参见图S1,Sobreira等人，2010年)在200例神经系统正常对照样本的外显子组数据中不存在，并且使用SIFT软件分析预测会破坏蛋白质结构。

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筛选应用于通过外显子组测序在ITALS#1家系受影响个体中检测到的变体和indels。LOD评分大于零的区域基于ITALS#1家系的连锁分析（另见图S1). 对200名神经系统正常对照受试者的外显子组数据中发现的变异进行筛选。基于SIFT分析预测变异对蛋白质功能的影响(网址：www.sift.jcvi.org).

这些变异体中的每一个都与家族中的疾病相分离，因此可能是导致疾病的遗传缺陷。在这个列表中，我们确定了一个c.961G>a核苷酸的变化，该变化导致p.R191Q氨基酸在VCP公司基因。这种特殊的突变曾被描述为一种不寻常综合征的病因，其临床特征是包涵体肌病与早发性骨和额颞叶痴呆佩吉特病（IBMPFD）的三联征(Watts等人，2004年)其病理特征是肌肉和额叶皮层神经元中存在TDP-43染色的泛素内含物(Ju和Weihl，2010年). 由于ALS的特征也是TDP-43包裹体的沉积(Neumann等人，2006年)已知已鉴定的突变会改变VCP结构，损害VCP功能，并且对人类具有致病性(Custer等人，2010年;Fernandez-Saiz和Buchberger，2010年;Ju等人，2009年;Ritson等人，2010年;Tang等人，2010年;Tresse等人，2010年;Watts等人，2004年)，我们假设VCP公司该基因也可能导致ALS表型。

额外家族性ALS样本中VCP的突变筛查

为了检验我们的假设并确定VCP公司ALS突变，我们对来自无关家族的210例ALS患者和78例病理证实的ALS患者进行了测序，并在5名诊断为ALS的患者中发现了4个额外的突变(表1). 在569份美国对照样本、636份意大利对照样本、364份非洲和亚洲样本（HGDP的一部分）或dbSNP或1000个基因组数据库中均未发现任何突变，所有这些突变都影响到跨物种高度保守的氨基酸(图3).

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的分布VCP公司在家族性ALS患者中检测到的突变。9号染色体的象形图显示在顶部。的17个外显子VCP公司编号为。家族性ALS病例中检测到的突变以红色表示，而之前描述的导致IBMPFD的突变以黑色表示。显示突变和野生型等位基因的相应色谱图如图所示，底部突出显示了跨物种氨基酸残基的保存（使用ClustalW2在线工具生成，网址：www.ebi.ac.uk/clustalw/). 另请参阅图S2VCP蛋白结构突变的位置。

其他突变包括一个p.R159G突变，该突变与一个美国家族的疾病分离，该家族的各个成员都被诊断为ALS、额颞叶痴呆和佩吉特病（参见图1B谱系结构，以及补充数据用于临床描述）。虽然p.R159G代表了一个新的发现，但涉及相同密码子（p.R159H和p.R159C）的不同突变先前被描述为IBMPFD的病因(Daroszewska和Ralston，2005年;Kimonis等人，2008年a;Schroder等人，2005年). 我们还检测到在ITALS#1家族中发现的p.R191Q突变的第二个例子(图1C). 该患者（ND13215）携带相同的199·8Kb单倍型VCP公司该基因座是ITALS#1家系的受影响成员，根据全基因组基因分型数据进行的逐代同源性分析证实，他与该意大利家族有隐秘联系（ND13215和个人IV之间的PI_hat：ITALS#1的4=0.251，表明这些病例是二级亲属）。在一个单独的ALS家族中检测到一个新的p.D592N突变(图1D). 蛋白质结构分析表明，残基D592直接邻近VCP六聚体形成的中心孔（参见图S2).

最后，我们在一个多代IBMPFD大家庭中发现了p.R155H突变(Watts等人，2004年)，其中的义务承运人VCP公司突变(图1C，III:1）在没有IBM或Paget病证据的情况下被临床诊断为ALS。尸检显示，幸存的前角细胞和TDP-43免疫染色显示脑干和脊髓运动神经元缺失，并伴有布尼娜小体，与ALS的诊断相符(图4、和补充实验程序详细的临床总结和病理描述）。

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来自尸检组织的组织病理学图像，家族UP731，个体III:1。（A） 腰部脊髓切片的血红素-伊红染色低倍镜（100x）显示，前角有大量运动神经元丢失，还有少量运动神经元（箭头所示）。（B） 延髓舌下核的运动神经元具有丰富的圆形嗜酸性细胞质内含物，与布尼娜小体一致（箭头），H&E，200x。（C） （200倍）和（D）（400倍）。舌下核的TDP-43免疫组织化学显示TDP-43阳性点状细胞质内含物，同时两个运动神经元的核染色丢失（箭头所示）。周围正常细胞保持正常核染色。值得注意的是，这次尸检中没有其他组织。当前图像是通过从选定的旧载玻片上取下盖玻片生成的，然后对TDP-43免疫组织化学进行去训练和处理。另请参阅图S3用于来自ITALS#1家族的患者III:4的肌肉活检的组织病理学图像。

携带VCP公司突变总结如下表1.符合VCP公司作为额叶功能障碍的已知原因，至少有一名ITALS#1家族成员和两名携带p.R159G突变的家族成员被诊断为严重认知功能障碍。除了ITALS#1家系先证者的已故父母和USALS#1家系的一名受影响成员外，其他患者均无骨病或肌病的个人或家庭病史。ITALS#1家族患者III:4的胫骨前肌活检组织学检查与失神经和神经再支配一致，没有显示IBM的病理特征（参见图S3). 至少有五名患者患有VCP公司突变有一个快速进展的疾病过程，在症状出现的三年内，他们要么死亡，要么需要机械通气。

讨论

本文中，我们使用全外显子组测序来鉴定致病性VCP公司一个具有ALS表型的常染色体显性意大利家系中的变异，随后发现VCP公司在我们的大样本家族性ALS病例队列中，约有1-2%的患者来自非血缘家庭。虽然频率VCP公司家族性肌萎缩侧索硬化症的突变必须在独立队列中进行确认，这种突变频率与报道的频率相当TDP-43型和保险丝突变(Kabashi等人，2008年;Chió等人，2009年;Mackenzie等人，2010年)强调了该基因作为家族性ALS病因的相对重要性。此外，我们的研究表明，这种新的基因组技术可以成功地应用于发现常染色体显性神经退行性疾病的诱因突变，在这种疾病中，DNA可从数量有限的病例中获得，因此连锁和位置克隆是不可行的。

虽然我们已经提名VCP公司作为我们意大利家族中的致病突变，通过整个外显子组测序过程确定的其他三个共享变体中的一个仍然可能是疾病的真正病因。此外，尽管我们样本中测序覆盖的深度足以识别数千个变体，但由于序列捕获或覆盖的随机变化，或者由于它们位于编码区域之外，其他突变可能会被遗漏。

与此相反，有四条遗传数据支持p.R191Q的致病性VCP公司我们家族中的变种。首先，在ITALS#1家族的三名受影响个体中发现了p.R191Q变体，第四名受影响成员（患者III:4）是义务携带者。其次，我们没有在dbSNP数据库、1000基因组项目数据库或实验室测序的1569名对照受试者（3138条对照染色体）中发现这种突变。第三，在两个大的多代IBMPFD家族中，同样的氨基酸变化以前被描述为致病性(Watts等人，2004年;Spina等人，2008年). 第四，我们发现了其他几个VCP公司家族性ALS病例的突变。这包括在一个明显不相关的家族性病例（Coriell#1）中相同p.R191Q变异的第二个例子，该病例作为ITALS#1家系的受影响成员，在VCP基因座上携带相同的199·8Kb单倍型，表明这些个体具有共同的祖先。除了这些遗传数据外，ALS和IBMPFD有一个共同的病理学特征，这两种疾病都会导致泛素阳性TDP-43内含物沉积在不同的组织类型中，包括额叶皮层的神经元(Ince等人，1998年;Weihl等人，2009年). 此外液泡蛋白分选54，小鼠同源VCP公司是导致ALS动物模型摆动小鼠运动神经元退化的原因(Schmitt-John等人，2005年).

虽然可以追溯到VCP公司是导致ALS的一个明显候选基因，目前还没有关于ALS患者该基因突变筛查的文献。此外，受影响个人携带VCP公司IBM一致认为这些突变是肌肉受累所致，即使它们的临床特征与运动神经元变性明显一致(Kimonis等人，2008b;Kumar等人，2010年). 事实上，到目前为止，在携带VCP公司突变通常被认为是错误的(Kimonis等人，2008年a; Weihl等人，2008年）。值得注意的是，我们研究中用于外显子组测序和后续突变筛选的样本VCP公司被选中是因为他们被诊断患有家族性ALS。在ITALS第一和USALS第一大家族中出现佩吉特病和FTD是在VCP公司发现了突变。

与之前的运动神经元变性被误诊的出版物相比，我们的数据清楚地表明VCP公司该基因可能与典型的ALS表型相关。在这项研究中，我们发现VCP公司根据El Escorial诊断标准，突变显示出与ALS诊断相符的上下运动神经元信号，该诊断标准对ALS具有高度特异性(Chaudhuri等人，1995年). 除了USALS#1家族的一名成员在肌肉无力发作之前患上佩吉特氏病外，所分析的病例中没有一例表现出非典型特征，例如骨疾病的生化或影像学特征。对每名患者的肌电图研究显示，广泛存在的失神经和慢性神经再支配改变是ALS的病理神经生理学特征。在最初的意大利家庭中，有两名患者在症状出现后的两年内经历了一个快速进展的过程，需要进行机械通气。IBM患者没有出现如此快速的进展，他们的预期寿命通常不会显著缩短(Amato和Barohn，2009年). 最后，一名携带p.R155H突变的患者的尸检数据显示，在TDP-43染色和Bunina小体存在的情况下，脑干和脊髓运动神经元丢失，从而从病理学上证实了ALS的临床诊断(Ince等人，1998年;Neumann等人，2006年).

尽管这些临床数据支持暴发性运动神经元变性的存在，但不能排除这些患者同时存在IBM的可能性。肌肉参与ALS的发病机制和进展一直存在争议(Abmayr和Weydt，2005年)，以及VCP公司-相关疾病可能是肌肉和神经同时受到影响的一个例子，因此提供了一个剖析这种关系的机会。至少，我们的数据拓宽了与VCP公司突变包括ALS表型，并建议应监测家族性ALS患者的IBM和破骨细胞功能障碍特征（例如，通过筛查血清碱性磷酸酶升高）。

VCP是一种高度保守的AAA+-ATPase，它介导泛素依赖性地从多蛋白复合物中提取底物，然后通过蛋白酶体进行再循环或降解。通过这种活性，VCP调节多种细胞功能，包括细胞信号传导、细胞循环、细胞器生物发生、自噬和蛋白质平衡的某些方面。突变VCP毒性部分通过改变TDP-43代谢介导(Ritson等人，2010年). 在小鼠模型的脊髓运动神经元中观察到TDP-43病理学改变VCP公司突变(Custer等人，2010年)突变VCP表达导致TDP-43从细胞核重新分布到细胞质在体外和体内(Custer等人，2010年;Gitcho等人，2009年;Ritson等人，2010年).

尽管如此VCP公司基因导致运动神经元变性和IBMPFD综合征的各种特征尚不清楚。众所周知，VCP对含泛素的自噬体的成熟至关重要，并且在VCP公司削弱此过程(Alexandru等人，2008年;Halawani和Latterich，2006年;Ju等人，2009年;Ju和Weihl，2010年). 这些突变可能会破坏其蛋白质去除功能，导致降解蛋白质在细胞内积聚，形成泛素化包涵体。值得注意的是，已知的VCP突变主要集中在分离蛋白质D1和N结构域的缝隙中（参见图S2)，并且可能通过损害这些区域的相对运动来干扰VCP功能，这些区域是在ATP水解反应中发生的(戴和李，2001;Tang等人，2010). 因此，我们的数据可能是第一个直接涉及运动神经元退行性变泛素化/蛋白质降解途径细胞机制缺陷的证据。还需要进一步的研究来证实突变VCP的这一假定的病理生理功能，并确定VCP蛋白中突变的位置是否会影响哪些组织受到泛素沉积的影响，并解释该综合征中存在的异质临床症状(范德泽等人，2009年).

总之，我们的数据证明了外显子组测序在确定家族性神经退行性变的遗传原因方面的实用性，并表明VCP公司基因是家族性ALS的一个原因。对我们数据的另一种解释，与突变VCP公司是家族性ALS的一个原因，是IBMPFD的表型谱比以前认识的更广，并且扩展到包括ALS。我们的研究还可能拓宽与ALS相关的临床范围，包括骨功能障碍和肌病，并进一步深入了解细胞蛋白降解途径在这种致命的神经退行性疾病中的重要性。

实验程序

患者样本

对一个四代意大利家族进行外显子组测序，其中四个人被诊断患有ALS（ITALS#1，图1A). 该家族的临床细节总结于表1有关详细说明，请参阅补充数据.

用于后续的突变筛查VCP公司另外，从无关ALS家族的患者（169例美国病例和41例意大利病例）和78例ALS患者（尸检材料可用）中采集了210份DNA样本。对照样本包括569名神经系统正常的美国个体（相当于1138条控制染色体）和636名神经系统健康的意大利个体（1272条染色体）。人类基因多样性小组（HGDP）的364个匿名非洲和亚洲样本的附加系列(Cann等人，2002年)作为对照纳入突变分析，以评估VCP公司在非高加索人群中。这些样本的人口统计学和临床特征见补充数据和总结如下表S2每个人都获得了基因分析的知情同意，相应的机构审查委员会批准了该研究。

外显子序列测定

根据制造商的方案（1.0版，安捷伦，加利福尼亚州圣克拉拉），使用SureSelect Exome靶向富集技术富集ITALS#1家族受影响个体III:12和IV:1的DNA。在基因组分析仪IIx（Illumina，San Diego，CA，USA）上对富集的DNA进行配对测序。使用基因组分析工具包对参考人类基因组（UCSC hg 18）进行序列比对和变异调用(www.broadinstitute.org/gsa/wiki/index.php/The_Genome_Analysis_Toolkit网站). 在使用Picard软件调用变体之前删除PCR重复项(picard.sourceforge.net/index.shtml). 基于这种罕见家族性疾病的突变在普通人群中不存在的假设，1000基因组项目中鉴定出了SNP(www.1000genomes.org/)或在dbSNP中(www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/，内部版本131）已删除。然后我们排除了两个患者不共享的变体。接下来，使用SIFT软件（4.0版，http://sift.jcvi.org/). 使用定制引物进行Sanger测序，以确定ITALS#1家族其他受影响成员（患者III:8）中是否存在其余变体。作为另一步，根据200名神经系统正常对照受试者的外显子组数据筛选ITALS#1家族中检测到的变体和indels。

联动分析

通过对四个家族成员进行基因分型，对ITALS#1家系进行连锁分析(图1A，个体III:6，III:8，III:12，IV:1）使用Illumina Human660W-Quad基因分型阵列。我们选择了约2%的基因型SNP（12092个常染色体SNP），并将其用于Merlin连锁软件中的参数连锁，假设为显性模型(Abecasis等人，2002年;Sobreira等人，2010年). 连锁分析确定了LOD得分大于零的常染色体上的18个区域（参见图S1) (Abecasis等人，2002年;Sobreira等人，2010年).

突变筛选

所有17个外显子和侧翼内含子VCP公司基因(NM_007126.3号)使用Big-Dye Terminator v3.1测序试剂盒（美国加利福尼亚州福斯特市Applied Biosystems Inc.）进行测序，在ABI 3730xl基因分析仪上运行，并使用Sequencer软件4.2版（美国密歇根州安阿伯市Gene Codes Corp.）进行分析。PCR引物和条件列于表S3.的突变ANG、DCTN1、FUS、OPTN、SETX、SOD1（包括导致包含假外显子的内含子变体(Valdmanis等人，2009年))和TDP-43型在携带VCP公司突变（可根据要求提供引物序列）。

单倍型分析

单倍型VCP公司通过使用Illumina Human660W-Quad基因分型阵列对ITALS#1家系中的IV:1个体和Coriell#1家系中的ND13215个体进行基因分型，比较携带p.R191Q突变的两个不相关家族的基因座，并使用Haploview 4.2对所得SNP数据进行分析(Barrett等人，2005年). 这些全基因组数据还用于通过应用逐次下降算法确定样本的相关性程度（量化为PI_hat度量）(--基因组)在PLINK软件工具集中(Purcell等人，2007年).

补充材料

01

单击此处查看。（2.0M，文档）

致谢

这项工作得到了NIH、国家老龄研究所（Z01-AG000949-02）和NINDS的部分支持。这项工作还得到了霍普金斯大学帕卡德ALS研究中心、奥卢斯ALS研究基金会、意大利联合会Giuoco Calcio（FICG）和德拉礼炮部（Ricerca Santiaria Finalizzata 2007）、肌肉营养不良协会（Grant 4365）、，以及埃默里大学伍德拉夫健康科学中心。本研究的DNA样本部分来自Coriell Cell Repositories的NINDS储存库(网址：www.coriell.org). 我们感谢哥伦比亚大学纽约智库-陶布研究所（联邦拨款编号：P50 AG08702）和迈阿密大学/国家帕金森基金会智库的帮助。这项工作得到了NIH的资助（AG17586）。JQT是William Maul Measey-Truman G.Schnabel，Jr.，老年医学和老年学教授。杰弗里·罗斯斯坦是霍普金斯大学帕卡德ALS研究中心主任。我们感谢为本研究提供样本的患者和研究对象。

附录A

ITALSGEN财团的其他成员：法比奥·贾尼尼（锡耶纳）、克劳迪亚·里奇（锡耶那）、克里斯蒂娜·莫格里亚（都灵）、艾琳·奥斯索拉（都灵，马可·路易盖蒂（罗马）、文森佐·拉贝拉（巴勒莫）、皮耶拉·帕拉迪诺（巴勒摩）、克劳迪娅·卡波内托（基努亚）、保罗·沃兰蒂（米斯特雷塔）、玛丽亚·特蕾莎·马拉索斯（卡利亚里）和玛丽亚·丽塔·穆鲁（卡利阿里）。

脚注

其他作者都没有任何利益冲突。

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。在以最终可引用的形式出版之前，手稿将经过文案编辑、排版和校对。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于期刊的所有法律免责声明都适用。

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