酒石酸抗性酸性磷酸酶缺乏导致具有自身免疫和I型干扰素表达特征的骨发育不良

摘要

我们最初确定了三名与颅内钙化和痉挛相关的广泛自身免疫患者。我们认为免疫性骨发育不良（MIM 271550）是这些病例的鉴别诊断。虽然主要被视为骨骼发育不良¹据报道，SPENCD患者表现出免疫功能障碍和神经系统受累^2，三我们患者的放射学检查显示SPENCD中描述的典型干骺端和脊椎骨病变。因此，我们试图确定这种表型的遗传基础。

共有10名SPENCD患者的人口统计学特征和临床特征总结如下表1，图1、和补充表1四名患者符合美国风湿病学会SLE诊断分类标准⁴这些包括升高的抗核抗体、抗dsDNA抗体、血小板减少症、肾炎或非糜烂性关节炎。此外，患者1表现出系统性硬化、舍格伦综合征和炎性肌炎的重叠特征。另外三名患者的抗dsDNA和抗核抗体滴度显著升高。可能与免疫激活有关，六名患者中有四名出现颅内钙化，这是公认的神经乳头瘤特征⁵。

在单独的窗口中打开

图1

基因突变患者的骨、脑和皮肤受累ACP5型

患者1的尺骨远端和桡骨可见囊性病变，干骺板硬化且不规则（图a）。脊柱侧位X线片显示患者4患有扁平性脊柱炎，椎体终板不规则（图b）。患者1的基底节、丘脑和深回出现致密钙化（图c）。患者1的手显示出明显的硬化变化（图d）。注意几个手指的组织丢失。严重的坏疽性改变导致左手食指截肢。

血亲父母所生的三名无血缘关系患者的全基因组基因分型分析确定了染色体19p13纯合子的重叠区域(图2). 连锁分析显示，在10527380-13214722个基点之间，最大多点lod得分为3.6。该区域共包含95个RefSeq注释基因。患者1的基因分型显示两个相邻标记，一个拷贝数探针（CN_784690）和一个SNP（rs2071484）未能杂交，表明可能存在纯合子缺失ACP5基因基因。该患者的DNA对所有外显子的PCR扩增无效ACP5型尽管非-ACP5型PCR产物，以及单个可用亲本和对照DNA的良好扩增。该患者纯合子缺失的进一步证据来自患者及其母亲DNA短荧光片段（QMPSF）的定量多重PCR和逆转录PCR分析(补充图1). 我们无法通过PCR确定精确的缺失断点。尽管患者1的父母并非有意近亲，但基因型数据显示，在rs4804628和rs318699之间的270kb片段中有35个纯合子SNP，包括ACP5型可能暗示着遥远的共同祖先。

在单独的窗口中打开

图2

突变数据汇总

面板a显示了对五个无关个体（P表示患者）进行全基因组SNP分析后产生的19p号染色体的AutoSNPa输出。在亲缘父母所生的三名患者（4、6和7）中，在10527380-13214722（黑色和黄色条分别表示纯合子SNP和杂合SNP）之间发现了一个共享的纯合子区域（由红框表示）。在这个纯合子区域内，患者1的拷贝数探针和相邻的SNP探针杂交失败。进行QMPSF以确认该患者中存在假定的缺失（图b）。外显子4和6分析的代表性数据表明，使用先证者的DNA未发现任何产物（预测拷贝数为0），与纯合子一致ACP5型基因缺失，而她的母亲如预期携带杂合子缺失（预测拷贝数为1，而对照组的预测拷贝数是2）。父亲的DNA不可用。

第19p号染色体上疾病临界区间的示意图如图c所示。缺失区域包括该基因的序列ACP5型其中发现了单碱基对突变、一个移码突变和两个基因缺失。删除用实线表示，双箭头表示超出所示坐标的延伸。这些缺失中没有其他基因参与。

的完整编码区域的排序ACP5型在另外9名接受测试的患者中发现突变(表1). 在所调查的家族中，所有突变与疾病分离，所有被检测的父母都是相关家族突变的杂合子。所有错义突变均位于含有TRAP的真核生物代表性样本的高度保守残基中(补充图2). 在混合种族对照样本的210个等位基因上没有发现突变。

对八个家族中四个家族的双等位基因零突变的观察表明，SPENCD表型是由于TRAP活性丧失所致。为了进一步探索这种可能性，我们测量了六名患者血浆中总TRAP蛋白及其5a亚型的水平。与五个年龄匹配的对照组以及基因测序中野生型等位基因纯合子患者2和3的未受影响同胞相比，总TRAP蛋白水平可以忽略不计，TRAP5a蛋白无法检测到，这表明受试患者几乎完全缺乏TRAP合成或分泌(图3). 值得注意的是，患者4和9是错义突变的纯合子，患者2和3在一个等位基因上有错义改变，这表明这些错义改变也起到了无效突变的作用，可能是通过蛋白质错误折叠和诱导蛋白质降解。这一假设得到了蛋白质结构生物信息学评估的支持，其中所有四种错义变化都被预测会导致显著的蛋白质不稳定(图4).

在单独的窗口中打开

图3

突变患者TRAP蛋白水平和干扰素α活性ACP5型

我们使用单克隆抗体测量了6例患者血浆中总TRAP蛋白和TRAP亚型5a的水平ACP5型突变，并将其与年龄和性别匹配的对照样本中的水平进行比较（a组）。我们还测试了2号和3号患者的一个未受影响的同胞，他们在基因测序中野生型等位基因纯合子（指定对照001）。所有6名患者仅表现出总蛋白的背景水平和5a蛋白的缺失。

从8名患有ACP5型以及使用抗病毒活性生物测定法测量的干扰素-α水平（b组）。对五名患者进行连续检测，检测点之间的间隔时间超过一个月。只有一次，在任何取样的患者中，干扰素-α水平在正常范围内（<2 IU/ml）。

在单独的窗口中打开

图4

蛋白质结构背景下错义突变的计算分析

四个错义突变中的每一个都是在晶体结构的背景下建模的²²指出了突变侧链和蛋白质其余部分之间的相互作用；粉红色和黄色的尖峰表示不稳定的范德华重叠，绿色的透镜表示稳定的氢键。为了清楚起见，省略了Van der Waals触点。在每种情况下，都显示了最不稳定的侧链构象（“旋转异构体”）。插图说明了野生型残基及其与其他蛋白质的相互作用。a组显示Ile 89突变为Thr；b组Gly 215突变为Arg；c组为Asp 241到Asn的突变，d组为Met 264到Lys的突变。对于每一个突变，范德瓦尔斯重叠都足够大，以至于它们很可能会严重破坏结构的稳定性。此外，对于面板c，失去了在野生型中稳定的氢键，对于面板d，赖氨酸的带电NH3基团被溶剂掩埋，无法进行中和电荷-电荷相互作用，从而进一步破坏突变结构。

尽管ACP5型空白小鼠表现出骨骼发育不良，与人类疾病SPENCD非常相似⁶，他们没有形成明显的自身免疫表型。然而，这些小鼠确实表现出紊乱的巨噬细胞促炎细胞因子生成⁷考虑到细胞因子干扰素α在原型自身免疫性疾病SLE发病机制中的重要性⁸与孟德尔干扰素病Aicardi-Goutières综合征的临床重叠^三，9我们试图评估SPENCD患者的I型干扰素激活情况。值得注意的是，所有8名患者的血清中I型干扰素活性均升高(图3)，在记录了两次或两次以上测量的五名患者中显示持续升高。这种活性在抗干扰素α的抗衰老药物中被完全消除，但在对抗干扰素β的抗衰老药中没有被完全消除(补充表2).

SLE患者经常表现出I型干扰素刺激基因的表达增加，即所谓的干扰素特征¹⁰为了确定SPENCD患者中是否存在类似的特征，我们对三名受影响个体进行了全基因组微阵列分析。这项分析确定了18个基因，与年龄匹配的对照组相比，这些基因在患者全血中的过度表达超过了四倍(图5a，补充图3和补充表3)其中15个被确认为干扰素刺激基因。这些数据通过5例患者的qPCR分析得到了证实。我们没有在患者血清中发现干扰素活性循环诱导剂的证据(补充表4)可能提示通过细胞内机制上调I型干扰素。

在单独的窗口中打开

图5

TRAP缺乏症患者的基因表达分析

对三名患者进行了全转录组微阵列表达分析，并与来自三个年龄匹配的对照样本的数据进行了比较（面板a）。我们确定了18个基因的子集，这些基因在患者中上调了4倍或更多，在比较第页<0.0005，错误发现值<0.2(补充图3). 已知其中15个基因是干扰素刺激的，这是I型干扰素特征。强度图由使用Partek Genomics Solution（版本6.5，版权2010，Partek Inc.，St.Charles，MO，USA）标准化的基因表达值（log 2）生成（每个基因的平均值设置为零，标准偏差为1）。面板b显示了这些上调基因的代表性样本的qPCR数据Ly6E、Mx1、USP18、RSAD2、OAS1、IFI44L、IL-10和白细胞介素12。与对照组相比，患者组中评估的所有基因均显著上调（p<0.001），除了白介素-10和白介素-12，证实了在微阵列分析中所见的1型干扰素特征，并显示没有上调或下调白介素-10和白介素-12.RQ等于2^-ΔΔCtΔΔCt+/-SDs。即相对于校准器的标准化折叠变化。

上述数据表明，在SPENCD患者中，TRAP蛋白的丢失导致干扰素α和I型干扰素刺激基因的显著上调。相比之下，我们发现干扰素γ蛋白水平正常(补充表5)、和白介素-10和白介素-12患者全血中的RNA(图5b). 此外，我们在两名患者（4名和6名）中看到了正常数量的T和B细胞，包括T调节细胞亚群（数据未显示），这表明TRAP缺乏症的自身免疫倾向与调节性T细胞的数量缺陷无关。这些数据表明TRAP在先天免疫中的主要作用，这一观点得到了TRAP由脂多糖诱导的观察结果的进一步支持¹¹以及通过核酸配体以序列非特异性和非TLR9依赖的方式¹²。

骨桥蛋白，由OPN公司基因是破骨细胞衍生TRAP的公认底物体内¹³有趣的是操作网络狼疮患者血清骨桥蛋白水平与干扰素α水平相关¹⁴可能通过骨桥蛋白参与浆细胞样树突状细胞（pDCs）分泌干扰素α的调节¹⁵是I型干扰素的主要来源。由于这些原因，我们分析了患者血清中的总骨桥蛋白，但在患者和对照组之间没有发现统计上的显著差异(补充图4). 此外，尽管我们观察到ACP5型pDC中的表达相当于外周血单个核细胞，巨噬细胞和非浆细胞样树突状细胞中的表达水平更高(补充表6). 值得注意的是，ACP5型人类pDCs的mRNA表达(补充表7)，以及小鼠巨噬细胞和小鼠树突状细胞（数据未显示），在干扰素α刺激后未增加，可能表明TRAP在这些细胞内的简单反馈调节回路中不起作用。然而，TRAP活性的丧失仍有可能导致磷酸化细胞内骨桥蛋白的增加¹⁶在pDC或其他相关细胞类型中，导致循环干扰素α通过尚未定义的途径增加。

SPENCD患者表现出真正显著的自身免疫谱。与SLE相关，以及经典补体途径早期成分的缺乏¹⁷和突变TREX1公司¹⁸，TRAP缺乏现在代表了第三种与狼疮发展相关的单基因疾病，也显示了I型干扰素活性的上调^19，20，21我们的发现揭示了TRAP活性和干扰素代谢之间以前未被认识的联系，并进一步强调了I型干扰素反应在自身免疫中的重要性。

方法

补充材料

致谢

脚注

工具书类