图1

ULK1是AMPK的保守底物。（A）ULK1中的四个保守位点和ULK2中的两个位点与最佳AMPK底物基序匹配的晶体排列。（B）将ULK1和GST或GST-14-3-3表达载体转染到人胚胎肾（HEK）293T细胞中，并将其置于含有20µM STO-609（STO）、载体（veh）或5mM苯乙双胍（Phen）的培养基中1小时。如图所示，对细胞裂解物和GST下拉物进行免疫印迹。（C）用myc-标记的催化失活（KI:K46I）ULK1或myc-标签的野生型猛禽进行体外激酶分析，这些猛禽是从HEK293T细胞中免疫沉淀出来的，并用作纯化活性AMPK的底物，存在于³²P-γ-ATP。（D）将转染myc标记的野生型ULK1或丝氨酸-丙氨酸ULK1突变体的HEK293T细胞用载体或1mM苯甲酸处理1h，或与组成活性AMPKα1（aa1-312）哺乳动物表达载体联合转染(11). 如图所示，用磷酸特异性抗体对裂解产物中的蛋白质进行免疫印迹。（E）使用上述myc-ULK1和纯化AMPK进行体外激酶分析。用指示的磷酸特异性抗体免疫印迹检测myc-ULK1的磷酸化。（F）用2mM AICAR或载体处理小鼠原代胚胎成纤维细胞（MEFs）1h。所示的裂解物免疫印迹，包括检测内源性ULK1 P-Ser₅₅₅