开发动态。作者手稿；PMC 2011年1月28日发布。
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斑马鱼胚胎后发育的正常表：活鱼的外部可见解剖分期
华盛顿大学生物系，华盛顿州西雅图351800信箱，邮编98195
作者贡献：DMP、数据分析、图形构成、阶段定义、手稿撰写、拨款支持；骨生成的MRE、成像和评分；MGM、成像和后期尺寸；TNG、性状评分和验证；鱼类个体REE、brightfield图像序列和特征评分
*通信地址：华盛顿大学西雅图351800号信箱生物系，邮编：91895
摘要
斑马鱼是一种主要的模式生物，但缺乏将胚胎后鱼类划分为发育阶段的系统。为了提供这样一个分期序列，我们描述了在明亮的光照下或通过活体染色和荧光照射可以看到的几个性状的胚胎后变化。这些包括鱼鳔、中鳍和腹鳍、色素图案、鳞片形成、幼虫鳍褶和骨骼。我们进一步确定了将胚胎后鱼类放入离散阶段的里程碑。我们将这些里程碑与体型和年龄的变化联系起来，并表明体型比年龄更能反映发育进展。我们还研究了大小和发育进程之间的关系如何随着温度和密度的变化而变化，并记录了组织学处理对大小的影响。为了便于胚胎后分期，我们提供了已达到特定发育里程碑和已确定大小的参考个体的图像。最后，我们为报告阶段提供了指南，这些报告提供了增长和发展中离散和持续变化的信息。
关键词：达尼奥雷里奥、斑马鱼、正常阶段、骨骼、鱼鳔、屈曲、色素图案、鳍、鳍折叠
生活历史阶段定义
长期以来，人们一直在争论如何定义硬骨鱼的广泛生活史阶段(巴隆，1999年;亨塞尔，1999;科瓦奇和科普，1999年;韦伯，1999a;Urho，2002年;Snyder等人，2004年). 在本研究中，我们采用了以下定义和考虑因素：
胚胎：经典地说，后代在孵化或出生之前被视为胚胎。虽然孵化具有深刻的生态和行为后果，但它在斑马鱼和许多其他生物中的发生时间范围很广[例如，受精后48–72小时（hpf）]和发育形态。因此，我们遵循Kimmel等人（1995年）定义胚胎期的任意结束，特别是通过实现突出口阶段（28.5°C时约72 hpf）。 拉瓦：不再是胚胎但尚未成为青少年的个体。
少年：在没有性成熟的情况下获得大多数成人特征的状态。这里定义为获得完整的鳞片模式（鳞片化）和完全失去幼虫鳍褶。在我们的实验室中，根据品种和饲养条件，幼期从受精后约4周持续到受精后6-12周。
成人：由处于繁殖状态的鱼类产生可存活配子和出现第二性征来定义。
胚胎后发育：大体上，这可以定义为胚胎发生后的任何时期；包括广泛生长，以及成年形态发育和维持期间的模式和形态发生。斑马鱼胚胎后发育中的许多此类变化可能与哺乳动物的后期器官发生以及胎儿和新生儿发育相同或同源。
定性和定量解剖学特征
要评估胚胎后斑马鱼的发育进展，需要确定在此期间发生了足够变化的性状，以便对达到规定的发育状态进行潜在诊断。斑马鱼幼虫具有多种这样的特征，在具有明亮视野透射或入射光的立体显微镜下，可以在相对较低的放大率下看到。这些包括质量特征（如尾鳍形状），以及连续和经向数量特征（如身高和鳍射线计数）。和提供评估或测量这些特征的标准。
胚胎期后斑马鱼的特征可能对分期有用。SL，标准长度。HAA，臀鳍前部的高度。FL°，脊索屈曲角。aSB，膀胱前叶。pSB，膀胱后叶。鳍：A，肛门；C、 尾侧；D、 背侧；P、 骨盆。刻度，1 mm。
表1
| 标准长度1（SL） | 距离2从鼻子三到尾脚4.在没有尾垂的前屈幼虫中，距离
从鼻子到脊索后尖5. |
| 喷嘴-排气长度（SVL） | 从鼻子到喷口后缘的距离。6 |
| 鼻盖长度 | 口鼻到鳃盖最后点的距离。 |
| 颈部高度 | 从腹部到背部的距离，紧靠头部后部，垂直于由标准长度定义的轴。 |
| 臀鳍前部高度（HAA） | 从腹面到背部的距离，由臀鳍前缘的汇合处在腹面确定
腹膜腔和肌节腹缘；垂直于标准长度定义的轴。在老年人中
幼虫，腹面边缘由肌节的腹面点在最前面的臀鳍线插入处定义。 |
| 眼睛直径 | 眼睛最长轴处的距离（由样本方向确定）。 |
| 弯曲角度（FL°） | 沿前脊索（或脊柱）画的水平线与画的线之间的角度测量
沿着脊索（或脊椎）向上翻的尾部的中心向下。用透射光检查。 |
| 游泳膀胱（SB）瓣 | 分为前叶和后叶；根据存在的叶数进行评分（0、1、2） |
游泳膀胱前叶
直径 | 描述前（第二形成）膀胱叶最长轴的距离。 |
| 游泳膀胱叶角度（SB°） | 绘制的线之间的角度测量，以指示每个膀胱叶的最长轴线。 |
| 中央翼褶皱 | 胚胎中发育的简单中间鳍褶，全部或部分持续到幼年期；这里分为
大叶和小叶。 |
| 翅芽外观 | 对于骨盆鳍，这是第一次从腹部观察到鳍芽。用于背鳍或肛门鳍，记为第一鳍
可观察到间充质的凝结，在鳍形成的地方形成凸起。 |
| 鳍射线外观 | 这是首次观察到由一个或多个鳍片组成的骨鳞毛症。 |
| 翅片射线数 | 尾鳍、背鳍、肛门鳍或骨盆鳍末端的鳍射线计数。融合射线分别计数。
用透射光检查。 |
| 鳍射线段 | 尾鳍、背鳍、肛门鳍或骨盆鳍中最长鳍射线中的鳍射线段数量。从翅片底部到顶端计算，
计数中包含任何部分光线段。用透射光检查。 |
| 变形黑素细胞图案 | 变性黑素细胞模式的定性分数（0-5；见正文） |
除了在亮场中可见的性状外，荧光活性染料还可以评估其他一些性状的发育情况，包括骨骼和侧线感觉系统。例如，钙黄绿素显示骨骼骨化(Du等人，2001年)主要发生在胚胎后发育期间()(库贝奇和马比，1996年;Bird and Mabee，2003年;Elizondo等人，2005年). 重要污渍所显示的特征与亮场照明可见的特征相辅相成。
钙黄绿素染色显示发育中幼虫的外部特征和相同个体的内部骨化。幼虫不按比例生长。
发展速度
受精后的时间是在标准温度和标准培养基中培养的胚胎发育阶段的方便替代物，尽管即使在这些条件下，个体也表现出发育变异性，最好根据不同的形态学标准命名阶段(Kimmel等人，1995年). 随着孵化后仔鱼的发育，自由摄食的仔鱼、遗传和环境因素及其相互作用对生长和发育速度变化的贡献越来越大。例如，显示了单独饲养的幼虫生长速度的广泛差异。这些观察结果表明，dpf不足以进行分期。
幼虫的生长差异很大。每条轨迹显示单独饲养的单条鱼的连续SL(N个=54）分三批。左，轨迹在3–280 dpf之间。对，同样的轨迹扩展为3–84 dpf。
在斑马鱼和其他鱼类中，标准长度（SL；定义见和)有时用作发育阶段的代表(库贝奇和马比，1996年;Fuiman等人，1998年;Bird and Mabee，2003年;Campinho等人，2004年). 为了比较SL和dpf作为发育进展指标的效用，我们拟合了与以下所示幼虫的几个性状相关的模型：.比较决定系数(R（右）2)跨越13个特征()结果表明，与SL相比，dpf解释的发育差异显著较小（配对Wilcoxon符号库检验：P（P）<0.0005; 中值的R（右）2：dpf=0.73，SL=0.94）。这些发现表明，SL比dpf更适合作为斑马鱼发育进展的指标。
表2
| 特质2 | 建模类型 | 数字功率因数R（右）2 | SL公司R（右）2 |
|---|
| FL°（飞行高度层） | 连续的 | 0.81 | 0.97 |
| 黑素细胞图案 | 依次的 | 0.29 | 0.57 |
| SB波瓣 | 依次的 | 0.64 | 0.86 |
| 某人 | 连续的 | 0.64 | 0.81 |
| A射线 | 连续的 | 0.76 | 0.95 |
| A段 | 连续的 | 0.77 | 0.95 |
| C射线 | 连续的 | 0.83 | 0.89 |
| C段 | 连续的 | 0.86 | 0.97 |
| D射线 | 连续的 | 0.73 | 0.90 |
| D段 | 连续的 | 0.78 | 0.96 |
| P芽 | 名义上的 | 0.70 | 0.94 |
| P射线 | 连续的 | 0.70 | 0.93 |
| P段 | 连续的 | 0.63 | 0.95 |
幼体尺寸的测量
虽然发育过程中的异速生长变化可以改变这些关系，但不同的尺寸测量值通常具有高度相关性。我们研究了SL与其他尺寸测量值的关系(,). 其中，吻-唇长度和吻-盖长度与SL平行。由于描述沿着背-腹轴的幼虫大小是有用的，我们还检查了与颈背高度和臀鳍前缘高度（HAA）的相关性。结果表明，尽管在某些尺寸范围内（例如HAA）存在适度的线性偏差，但所有尺寸测量值都与SL（以及彼此）高度相关。
尺寸测量具有高度相关性。显示了在发育过程中反复检测的幼虫的几个易测性状与SL的关系。鼻-盖长度与SL和眼直径与SL的关系略呈曲线，而HAA与SL的关系在小尺寸时呈曲线（可能是由于小幼虫不能平躺），但在大尺寸时呈合理的线性。用于尺寸测量的幼虫是生长轨迹显示在.
通常有用的尺寸测量应能抵抗测量误差，这要求地标易于识别，并且测量本身应足够大，以在典型放大倍数下执行。综合考虑这些问题，我们建议SL用于前后测量，HAA（当HAA>0.5 mm时）用于背腹测量。中提供的回归将SL和HAA与其他定量大小度量联系起来。
表3
通过其他定量测量预测SL和HAA，并估算组织学处理后的初始尺寸。1
| 受抚养人 | 预测器 | 回归 | R（右）2 |
|---|
| SL公司 | HAA公司2 | SL=（3.56×HAA）+4.40 | 0.98 |
| SVL公司 | SL=（1.48×SVL）+0.55 | 0.99 |
| 鼻盖三 | SL=（3.29×鼻盖）+0.73 | 0.98 |
| 眼直径三 | SL=（9.49×眼径）+0.22 | 0.98 |
| 颈背深度 | SL=（4.12×颈背深度）+1.62 | 0.99 |
| C段 | SL=（0.58×C段）+4.62 | 0.93 |
| SL后固定 | SL=（1.00×SL修复后) + 0.29 | 1 |
| ISH后SL | SL=（1.42×SLISH后) + 0.46 | 0.99 |
| HAA后固定 | SL=（4.05×HAA修复后) + 3.71 | 0.99 |
| HAA ISH后 | SL=（5.20×HAAISH后) + 3.38 | 0.94 |
| HAA公司 | HAA后固定 | HAA=（1.02×HAA修复后) + 0.00 | 1 |
| HAA ISH后 | HAA=（1.36×HAAISH后) - 0.18 | 0.98 |
选择性状的发育
除了幼虫的大小，其他一些性状也表明它们是发育进展的指标。在这里，我们简要回顾了其中几个方面的胚胎后变化。统计分析表明，SL与发展进程之间存在高度相关性()，我们指的是通常观察到的与SL相关的以下变化。下图中的图像面板为所示个人提供了SL。提供这些值是为了便于参考，并且由于个体的可变性，不应将其解释为精确阶段或总体平均SL，后者在本节之后提供。
头部形状
虽然胚胎头部有点方形，嘴位于腹部，但在胚胎发育早期，嘴的运动增加了背部和前部(，4.8毫米SL）。与此同时，头部变得更加三角形，前部突出。前面已经描述过孵化期口腔位置的变化(Schilling和Kimmel，1997年). 根据颈背深度、鼻盖距离和眼睛直径测量，头部尺寸随后相对线性增长（数据未显示）。值得注意的是，长时间的麻醉会使原本光滑的头部背表面产生肿胀。
头部发育。在胚胎-幼虫过渡期发生明显的形状变化，在后期发育期间还有其他更细微的变化。所示个体的SL在每个面板的左下方以红色显示。所示图像的放大倍数逐渐减小。比例尺：3.4和9.6250μm。
颅骨骨骼成分的进行性骨化如图所示为了量化这一进展，我们确定了容易看到的骨骼或骨骼复合体，并在侧视图或腹视图中进行了评分。对这些发育单位的定量分析表明，发育进程相对有序()早在约4.2 mm SL（背眶复合体和下颌舌骨）和约6.0 mm SL时（枕上），就出现了侧面可见的变化。从腹侧观察，我们在~4.8 mm SL（腹侧玻璃下）和~5.3 mm SL处观察到明显的转变，在后期发育过程中可以观察到其他变化（例如脊索延伸复合体和尿透明长度）。
钙黄绿素染色显示颅面骨骨化。侧视图和腹视图是相同的个体；不同的个体跨阶段显示（每个面板右下角的SL）。所有图像都是使多个焦平面变平的投影。选定的骨骼元素用箭头表示（除非另有说明，否则每个面板中的注释都是从左到右提供的；下面的红色箭头和常规类型=定量评分；下面的黄色箭头和斜体类型=未评分的其他骨骼）。叠加表示骨骼单位得分.答：4.0,方形、舌鳎、，颈支膜5; 5.0,角叉2，角叉3; 5.2，原耳，基枕；7.2，侧筛，翼磷脂；7.8，眶上，蝶骨；8.0，红色覆盖=背眶复合体[DO1，侧筛；DO2，翼磷脂，DO3，眶上]，绿色覆盖=脊索延伸复合体[NX1，枕基；NX2，原耳；NX3，蝶骨]；蓝色覆盖=舌骨；黄色覆盖=枕上。B类：4.0,齿状、眶下、角质玻璃、舌骨（侧视计分）；5.0,角叉4；5.2，腹侧下玻璃细胞，基底玻璃细胞；6.2，尿透明；8.0,眶下1，齿状，角质，黄色覆盖=基透明，红色覆盖=腹侧下透明，绿色覆盖=鳃骨射线复合物[BR，鳃骨线]，蓝色覆盖=尿透明。
SL骨化进展。显示的是钙黄绿素染色显示的颅面部骨骼明确的外侧和腹侧单位的得分。为了清晰起见，所有的分数都是垂直抖动的，除了近端鳃骨射线的长度（底部）。每个点代表所示SL的单个鱼的值。评分基于以下标准，0总是表示没有染色；在没有给出更多定性描述的情况下，个别骨骼的钙黄绿素染色开始用以下“+”表示：背眶复合体，1=筛外侧+，2=翼蛋白+，3=眶上+；脊索伸展复合体，1=枕基部+，2=原发性+，3=蝶骨+（开始从内侧向后延伸到单个圆形末端），4=蝶骨++（染色扩大到两个圆形末端）；舌骨，1=窄环染色，2=染色向骨背突扩展，3=染色向腹突扩展，背突增宽；枕上的，1=首次出现，2=后伸和侧弯；基部的，1=首次出现；腹侧下玻璃细胞，1=第一块骨头骨化，2=第二块骨头骨化；鳃骨射线复合体，分数表示染色的骨骼数量[成对的鳃骨射线加上成对的副鳃骨；虽然通常只有三对鳃骨线，但有些个体会出现四对(Cubbage and Mabee 1996年)];尿透明的，染色区的前后长度，无染色=0。
诺托字屈曲
在幼虫早期，脊索后部向后弯曲，这一过程称为弯曲，通过透射光很容易看到（图。,). 该过程从约4.5 mm SL开始，由约6.5 mm SL完成，最终弯曲角度约为45°。
单个患者的诺托字屈曲。在每个面板中，弯曲度显示在左下角，对应的SL显示在右下角。随着脊索弯曲，SL增加的速度会短暂下降（例如，15–23°）。
在幼虫发育过程中反复检测SL与脊索屈曲角、鱼鳔特征和骨盆鳍芽外观之间的关系。如上所示为相对于SL的近似HAA，如和为了表现的清晰，鱼鳔叶和骨盆鳍芽这两个优秀的特征被抖动了。
游泳用球囊
在胚胎发育和胚胎后发育期间，可以看到鱼鳔（或“气囊”）的一些变化（图。,) (Robertson等人，2007年). 孵化后不久，约3.7 mm SL出现游泳膀胱充气和“浮起”现象。此时，一个单身，膀胱后叶很明显。一秒钟，前游泳膀胱叶在~6.0 mm SL处出现，最初为紧靠后叶前背的小隆起。在此期间，后叶变长，最终从相对对称的椭圆形变为后部腹侧弯曲。这种弯曲表现在前叶和后叶的主要（即最长）轴之间的角度减小。在后期发育过程中（>8.5 mm SL），鱼鳔部分被成年初级腹侧黑素细胞条纹遮住（见下文）。
鱼鳔形态的变化。图中为从腹外侧观察的单个个体（SL位于每个面板的右下方）。幼虫最初有一个单一的后囊叶。第二个是前叶，它是一个与后叶相邻的芽，然后在短时间内膨胀。所示图像的放大倍数逐渐减小。比例尺：6.1和7.9，250μm。
中央分隔带散热片
尾鳍首先发育。屈曲开始后不久，脊索最后部腹侧出现明显的间充质凝集；第一条鳍射线（鳞翅目）随后很快出现，通常约4.9 mm SL（图。,). 一旦形成第一个鳍射线段，最长的鳍射线的段数就会相对线性增加(). 在射线出现后的早期，鳍的背部略长于腹部(，5.6毫米SL，5.9毫米SL.）。逐渐地，背部和腹部区域的长度变得相似(，6.0毫米SL），背侧和腹侧叶开始出现(6.4毫米SL；). 这些叶中的射线比中间缝隙中的射线有更多的节段(Goldsmith等人，2006年).
早期尾鳍发育。所示为多个个体，每个面板右下角具有相应的SL。箭头：4.5，未来鳍底部的间充质冷凝；4.9，尾鳍射线第一节完全形成；5.0，未来背鳍和腹鳍射线之间的分裂（在4.9处也很明显）。箭头：6.0，指示光线的第一段和第二段之间的接缝。6.4，指示射线的第一段、第二段和第三段之间的接头。所示图像的放大倍数逐渐减小。比例尺：3.5和6.4250μm。
在发育过程中反复检测幼虫鳍特征与SL的关系。上面是在每个指示的鳍中观察到的鳍射线数。下面是每个鳍内最长光线中的鳍光线段数。为了清晰起见，所有的值都是有价值的，并且都是抖动的。胸鳍没有刻痕。
尾鳍发育较晚，色素形成较晚。所示为单个个体（SL位于每个面板的左下方）。一个最初圆形的鳍逐渐发展出一个中间的裂缝，背部和腹部有更长的裂片。鳍色素图案的出现是从最初均匀的黑色素体区域开始的，到散布的黄色素体的发展，以及随后分离成最终的成虫条纹（详情见正文）。10.1中的箭头：身体和鳍上暂时分离出黑色条纹。1V，身体上的成年腹侧初级黑素细胞。M1，首先出现尾鳍黑素细胞条纹；M2d，M2v，第二条出现在尾鳍背侧和静脉的黑素细胞条纹；X1d，X1v，第一次出现尾鳍黄色体间质。所示图像的放大倍数逐渐减小。比例尺：6.1和34.8，0.5 mm。
钙黄绿素染色也可以显示尾鳍射线的发育，更大的内部分辨率可以区分脊索轴腹侧和背侧的鳍射线（图。,). 我们称这些射线为耳弦下的和脊索上的分别为。耳下索射线开始发展约4.9 mm SL，而脊索上索射线出现的时间要晚得多，>6.0 mm SL。钙蛋白染色还显示鳍基部骨骼的进行性骨化（“枕下复合体”），在5.2–6.5 mm SL之间。
钙黄绿素染色显示尾核复合体骨化进程。显示的是多个个体（每个面板右下角的SL）。从左到右为每个面板提供箭头注释；覆盖图是得分单位4.6，最后骨化椎体，第一骨化射线段；5.0，第一段多发骨化鳍射线；5.2，菌丝；7.2，脊索上鳍射线；8.5，c=中央，pu=胸膜前，hspu=来自胸膜前的血管棘，phy=副胸膜，hy=胸骨前，绿色覆盖物=末端中央复合体[6个椎体后部中央和胸膜前（pu）2和3]；蓝色覆盖=菌丝复合体[菌丝（hy）1-5，副菌丝（phy），以及源自pu2和pu3的血管棘（hspu）]，橙色覆盖=脊索上射线[脊索背面出现的背前射线]，粉红色覆盖=耳蜗下索射线[包括背叶和腹叶的主要尾射线以及由hspu2、hspu3和phy支持的腹前向射线]。终端中心计数（如)最好是前后进行，hspu2和hspu3作为其相应中心的标志物；这些血管棘的染色发生在中央染色之前。在早期阶段，末端体节边界可用于识别与pu2和pu3相对应的片段。
SL对中间翼片进行骨化处理。为了清晰起见，所有分数都垂直抖动。评分基于以下标准：尾鳍射线（脊索下和脊索上），简单计数；地势复合体，染色的骨骼总数（参见图例）；背鳍、臀鳍射线和桡骨，简单计数。
臀鳍是第二个发育的。肛门后鳍褶（见下文）内可见凝缩的间质(，5.4毫米SL）。这种间充质将在鳍基部生成桡骨。鳞癌在~6.3 mm SL处变得明显，同时出现多条射线的骨骼。所有射线都以~8.5 mm SL展开，射线段的添加通过~11.0 mm SL相对线性地进行（图。,). 钙蛋白染色更清楚地显示出桡骨骨化，通常开始于~7.0 mm SL（在第一个尾鳍节段已经骨化之后）（图。,).
早期背鳍和臀鳍发育。所示为单个个体（SL位于每个面板的右下方）。箭头：5.2，臀鳍冷凝；5.4，黑素细胞（箭头所示，鳍褶中的凸起预示着背甲素凝结）；5.5，冷凝散热片；5.7，背鳍冷凝；6.3，臀鳍射线；7.0，背鳍射线。所示图像的放大倍数逐渐减小。比例尺：5.3和7.0，250μm。
晚期背鳍和臀鳍发育和色素图案形成。单个个体以多种尺寸显示（SL位于每个面板的左下方）。箭头：6.1，背鳍和肛门鳍中的第一个黑素细胞；6.5，尾鳍黄色素出现；16.0，混合的黑素细胞和黄色细胞在肛门鳍的远端持续存在。M1，M2，第一和第二臀鳍黑素细胞条纹；X1，第一个尾鳍黄色柄间熟。所示图像的放大倍数逐渐减小。比例尺：6.1250μm；16.0500微米。
钙蛋白染色显示肛门鳍射线和桡骨骨化。显示了多个个体（右下方为SL）。
背鳍的发育稍晚于臀鳍，首先在背鳍褶内可见浓缩的间充质(，5.7毫米SL）。鳞癌在~6.5 mm SL处出现()尽管个体骨化的精确时间不同（例如。，6.7毫米SL）。对于其他翅片，射线段的添加相对线性地进行（图。,). 钙化蛋白染色显示鳍射线段骨化早在5.8 mm SL，放射状骨化开始较晚，约7.2 mm SL（图。,)
钙蛋白染色显示背鳍射线和桡骨骨化。显示了多个个体（SL位于右下角）。5.8，箭头显示射线的初始骨化。
脊椎骨化和胸膜肋骨
钙化蛋白染色显示椎体骨化的前后顺序(). 末端（后部）中央骨化的数量提供了4.5-6.5 mm SL之间发育进展的额外测量值（图。,). 同样，胸膜肋骨的发育开始于约5.8 mm SL的前后（图。,).
末端中心和胸膜肋骨骨化的量化。两者都是简单计数（另请参见).
钙黄绿素染色显示胸膜肋骨和盆腔鳍片骨化。多人（右下方为SL）。
骨盆鳍
成对的骨盆鳍芽从腹外侧体壁、后鱼鳔的腹侧到后极部明显呈圆形突起(，7.5毫米SL）。当外生芽变得长而宽后，第一道射线在近端区域变得明显(，8.8毫米SL）。通过10–12 mm SL（图。,). 注意，胸鳍的大部分发育发生在胚胎发生期间，如下所述Kimmel等人（1995年）; 由于这些鳍的诊断价值降低，而且与胸鳍和中鳍相比，在这些阶段检查这些鳍更加困难，因此我们不包括胚胎后发育过程中的鳍数据。
骨盆鳍发育和鳍褶小叶退化。图中显示的是一个人（右下角的SL）。答：低倍视图显示小鳍折叠（箭头）、通风口和臀鳍。小鳍褶的细微吸收首先在约9.1 mm SL（箭头）处出现，并且在9.3 mm SL处明显发生，此时骨盆鳍的远端尖端遮挡鳍褶边；在9.8 mm SL（箭头）和10.2 mm SL处，只有小的鳍褶残留物存在于通风口前面。B类：骨盆鳍芽发育的细节，首先在7.5mm SL处可见（箭头）。芽从体壁延伸（8.3 mm SL），8.8 mm SL（箭头所示）可见三条鳍射线，每条鳍射线包含单个发育节段。第二段（大箭头）和段之间的第一个接头（小箭头）在10.2 mm SL下清晰可见。所示图像的放大倍数递减。比例尺：7.5和10.2，0.5毫米。
中央翼褶皱
通过透射光很容易看到中间的鳍褶皱()尽管在搬运过程中容易损坏。我们定义了两个鳍折叠区域。这个主叶在卵黄延伸的前后水平处背侧升起，在出口的后缘腹侧升起；它从后躯干和肛门后尾向外延伸，并包围后尾尖。这个小叶位于卵黄囊腹侧和发泄口前部之间，从卵黄延伸部下方向外延伸。
幼虫鳍褶和鳍褶子吸收。显示了多个个体（右下方为SL）。3.4、鳍折主要瓣叶（箭头）和次要瓣叶（箭头）的初始形状；4.2，尾部后部明显收缩（箭头）；5.6，背鳍间充质凝集物（箭头）上方的背鳍褶皱处有明显隆起；6.4，背鳍后面的缺口表明鳍褶早期吸收（箭头），脊索上鳍射线上明显有隆起（箭头）；6.8，背鳍前部和后部的吸收继续进行（箭头）；7.7，吸收发生在尾部越来越靠后的区域（箭头）；8.3，小叶的腹后缘变平（箭头；另见).
大叶和小叶都出现在约3.2 mm SL处，在孵化之前，尾尖正前方的大叶有轻微收缩。两个肺叶都向外扩张，小叶变得越来越圆(，4.2毫米SL）。在背鳍发育开始的间充质凝结处，主叶从身体进一步凸出(，5.6毫米SL）。此后不久，主叶开始吸收；背鳍正后方有缺口的早期迹象(6.4毫米SL）。大叶吸收从前向后进行，相对同时发生在背鳍前部和背鳍和臀鳍后部。主叶的残余部分大约覆盖了尾部后部的三分之二（约7.4 mm SL），只有大约三分之一的尾部（约8.3 mm SL。
在骨盆鳍射线出现之前，小叶的吸收并不明显，首先是在骨盆翅水平处的凹陷，然后是前后吸收(). 在骨盆鳍射线发育第二节之前不久，小叶几乎消失约10毫米SL；只有在排气口的前缘有一小层表皮褶皱。
正方形化
鳞片在约8.1 mm SL处从尾部外侧表面的后部开始发育，并从该位置向前部发展(Sire等人，1997年;Sire和Akimenko，2004年). 当用透射光观察时，可以看到鳞片在尾部皮肤上形成细微的隆起(，9.6毫米SL），但随后变得更加独特(9.9毫米SL）。同时，在臀鳍前面的背上可以观察到间充质的细微收缩，随后不久便有明显的鳞片形成(12.0毫米SL）。
透射光显示的鳞片发展。图中显示了一个人（右上角的SL）。8.9，最初背部光滑。9.6，出现隆起的隆起脊（箭头所示）表明后鳞片形成；9.9，鳞片的后部形状良好（箭头），并且开始向前发展（箭头）；12.0，刻度在前面完成（箭头）。
颜料图案：主体
的模式胚胎/早期幼虫黑色素细胞由沿着肌节的背侧和腹侧边缘，在水平肌隔处，以及排列在卵黄囊背侧和腹面上的条纹组成(Kelsh等人，2008年). 成人黑素细胞模式的转变始于~6mm SL，出现了一些变性黑素细胞在背侧和腹侧肌节上() (约翰逊等人，1995年;巴黎和肿瘤，2003年). 当前两种情况下，分散的变性黑素细胞的数量增加了~9 mm SL主条纹成人的（1D，1V）开始可辨别，从水平肌隔膜偏移约5°。当分散的黑素细胞迁移到这些条纹上时，这些条纹变得更加明显，并且在这些条纹中有更多的黑色素细胞分化。沿水平肌隔的胚胎/早期幼虫黑素细胞丢失或迁移以加入初级条纹。随着主条纹变得更加清晰间熟的该地区也变得越来越独特。通过约12 mm SL，主条纹完整。第一个二次条纹（2V）在腹部增加了约14 mm SL，另一条次要条纹（2D）在背部增加了约16 mm SL(). 随着鱼的继续生长，添加了额外的二级条纹。
身体黑素细胞模式。答：单个个体（右下角为SL）的色素模式变态，左下角相邻的每个黑色素模式状态都有定性得分。发育是自下而上的，与B.1中的图相匹配。在色素模式变态开始时，一些变性的黑素细胞散布在肌节上（图B中放大倍数较高的方框区域显示，变性的黑色素细胞用箭头标记）。2，变性黑色素细胞广泛分布在侧翼，在水平肌隔膜处有残留的胚胎/早期幼虫黑色素细胞（箭头）。3、成人的发黑斑纹开始明显（箭头），与越来越无发黑的中间层相邻。横条表示水平肌间隔。4、随着间隙的填充，条纹变得越来越明显。5、幼年期色素图案，包括前两个初级成体条纹（1D，1V）和第一个次级条纹（2V），以及覆盖在背和鳞片（箭头）上的色素细胞。B类：黑素细胞模式与SL之间的关系。鱼类被分为A类或这些类的中间类。为清晰起见，点垂直抖动。
鳞片上黑素细胞图案的发育。图中显示了多个个体（左下方为SL）。最初（10.7），黑色素细胞沿着鳞片的轮廓组织，随后在每个鳞片的远侧边缘发现（15.4，箭头）。体重秤下方出现了2D（16.0，箭头所示）的身体黑素条纹。所示图像的放大倍数逐渐减小。比例尺：10.7和22.9，0.5毫米。
幼虫的背部也被变质的黑素细胞所覆盖。这些是分散的，但随着规模的发展而组织起来(，10.7毫米SL）。鳞片最初在其远端边缘显示单行黑素细胞(，15.4 mm SL），在后期开发过程中产生额外行。
虹彩虹彩也有助于成人的身体色素模式。在胚胎/早期幼虫色素模式中，虹彩出现在黑素细胞条纹内并覆盖在鱼鳔上(Kimmel等人，1995年;Kelsh等人，2008年). 在靠近鱼鳔的肌体的腹侧半部分发育额外的变质虹彩藻(，5.0 mm SL），标志着第一次间熟。随后，这些细胞在前面和后面进一步被发现，并出现第二块虹膜孔(5.7 mm SL）。此后，一条微弱但连续的虹彩线从头部后方延伸至尾鳍底部，并逐渐变得更加独特().
虹彩纹的发育。显示的是多个人（右下角的SL）。答：前躯干新生间质中虹膜孔的发育。4.5，虹彩首先只出现在内部，覆盖着鱼鳔（箭头）。5.0，皮肤下的虹彩首先出现在鱼鳔附近，在一些肌节的腹外侧表面。5.7–7.3，初始斑块更向后扩散（箭头表示后向反射细胞）。B类：当前部的细胞和尾部基部的一个贴片相邻时，形成了连续的虹膜柄间成熟。抄送：脊索屈曲部位附近虹膜柄斑的发育（箭头所示的最前面的反射细胞）。
黄色黄色素在入射光照射下的白色背景上最容易观察到。它们最初被发现与虹彩有关，并广泛分布于发黑斑纹之间(Maderspacher和Nusslein-Volhard，2003年;Quigley等人，2005年). 由于很难直观地观察到黄色素，我们在此不详细描述它们的发展。
颜料图案：翅片
尾鳍的色素图案是伴随鳍的生长而形成的。沿着腹侧肌节的胚胎/早期幼虫的黑素细胞条纹中有一个明显的缺口，在那里将出现间质的尾鳍凝集(，3.5毫米SL）。当这种凝集变得更加明显时，这个地区就会出现一些黑素细胞(，4.5毫米SL），随后，额外的黑色素细胞覆盖了正在发育的鳍射线(，5.6毫米SL）。在黑素细胞之后不久，可以看到微弱的黄色素细胞，最初有两种细胞类型散布在其间(，6.2毫米SL）。在背叶和腹叶的基部附近，黄色体逐渐变得更加明显，这些区域越来越缺少黑色体。在鳍的底部，黑素细胞集中在身体条纹1V的后部最靠近的区域，该区域将形成第一条尾鳍黑素细胞条纹（M1），两侧是第一条尾翼黄色细胞间成熟区（X1d，X1v）。身体条纹1D和2V附近出现了额外的黑素细胞条纹，其间有黄色细胞条纹，黄色细胞条纹内出现了虹彩。M1从1V瞬时偏移（例如。，，10.1 mm SL），尽管身体和鳍条后来看起来相对连续。
在肛门鳍发育过程中，在早期的间充质冷凝过程中经常观察到一些黑素细胞(5.4毫米SL），随着鳍射线的发展，会出现更多的黑色素细胞(，6.7毫米SL；). 随着鳍的生长，黑素细胞最初出现在远端区域。黄色素首先出现在鳍的后部，随后被广泛发现，并与黑素细胞混合。渐渐地，靠近鳍基部的黑素体条纹（M1）变得独特，以及更远处的黄色体条纹（X1）。随着鳍的生长，会形成额外的条纹，在鳍的末端散布着黑色素细胞和黄色素细胞。
随着第一条射线的发育，背鳍显示出黑素细胞（图。,). 此后不久便出现黄色体。与尾鳍和肛门鳍相反，黑素细胞和黄色素细胞大部分仍然相互交织，没有形成条纹。
侧线感觉系统
侧线感觉系统在胚胎后发育过程中经历了几个变化(Ledent，2002年). 这包括增加新的神经乳腺和迁移现有的神经乳腺，以细化现有的侧线并形成额外的侧线(). 在青少年和成年人的发育过程中，会出现一簇神经瘤，形成缝合线。
用活性荧光染料FM1-43标记显示侧线发育。图中显示的是多个个体在亮场（左侧）和反向荧光（右侧；SL在右下方）。3.5、后侧线神经肥大（箭头），靠近尾部底部有一簇；对侧可见额外的神经肥大。5.8，在主外侧（L）线（箭头）的原有神经桅杆之间出现了额外的神经桅杆，而尾鳍神经桅杆则位于尾鳍底部逐渐垂直的线上（箭头）。7.4，在次级外侧（L'）线（箭头）和背鳍底部（箭头）可见神经肥大。8.6，在第二外侧（L'）线（箭头）和尾鳍本身（箭头）上可以看到额外的神经肥大。
与规模相关的发展里程碑
前面对几个特征的回顾表明，有一些里程碑可以表明发育进展。为了将这些里程碑与规模联系起来，我们使用了两种互补的方法。
首先，我们使用单独饲养并在整个发育过程中成像的幼虫，回顾性地确定了在所讨论的里程碑之前和之后的个体的平均大小：我们在发育过渡的前一天确定了SL和HAA，然后在观察到过渡后的第一天也确定了SL和HAA。因此，这些“纵向”测量包括发展里程碑发生时的大小。
其次，我们对不同密度和食物供应量饲养的鱼类群体的个体进行成像，并确定其大小以及是否达到了特定的里程碑。为了确定里程碑发生的时间，我们在多元logistic回归分析中将每个发展转变视为一个序数变量。我们使用得到的回归系数来估计50%的个体“高于”或“低于”相关里程碑的大小。因此，这些“横截面”测量提供了在一系列条件下鱼类群体中发生里程碑的大小估计。
主要发展里程碑见，提供SL和HAA中的尺寸（对于HAA>0.5 mm的值，其中该测量是线性的；). 下面提供了最近实现这些里程碑的鱼类的示例图像（请参阅第节：参考个人). 里程碑是基于在明场或透射光照下，活鱼很容易辨别的特征。纵向数据集和横截面数据集之间的发育过渡规模估计值非常一致。
表4
里程碑
| | | 纵向的1
| 横截面2
|
|---|
| 缩写。 | 说明 | 图 | SSL协议三 | SL公司之前 | SL公司邮递 | HAA公司之前 | HAA公司邮递 | SL公司P（P）=0.5 | HAA公司P（P）=0.5 |
|---|
| pSB公司 | 膀胱（pSB）充气 | 33 | 3.5 | 3.4 ± 0.1 | 3.7 ± 0.1 | —4 | — | 未注明日期。5 | — |
| FLe（飞行高度层） | 早期屈曲0<25° | 35 | 4.5 | 4.4 ± 0.2 | 4.7 ± 0.1 | — | — | 未注明日期。 | — |
| CR公司 | C翅片射线外观 | 36 | 4.9 | 4.9 ± 0.1 | 5.1 ± 0.1 | — | — | 4.9 ± 0.2 | — |
| 自动控制 | 翅片冷凝 | 37 | 5.4 | 5.2 ± 0.2 | 5.5 ± 0.2 | — | — | 5.4 ± 0.1 | — |
| 直流 | D翅片冷凝 | 38 | 5.7 | 5.5 ± 0.2 | 5.8 ± 0.1 | — | — | 5.8 ± 0.1 | — |
| MMA公司 | 变性黑素细胞外观 | 40 | 5.9 | 5.9 ± 0.2 | 6.3 ± 0.2 | 0.52 ± 0.03 | 0.58 ± 0.03 | 6.0 ± 0.1 | 0.51 ± 0.02 |
| 美国证券交易委员会 | aSB外观 | 41 | 6 | 5.9 ± 0.1 | 6.2 ± 0.1 | — | — | 6.0 ± 0.1 | — |
| 应收账 | 鳍射线外观 | 43 | 6.2 | 6.3 ± 0.1 | 6.4 ± 0.2 | 0.53 ± 0.02 | 0.56 ± 0.02 | 6.1 ± 0.1 | 0.51 ± 0.01 |
| 博士 | D鳍射线外观 | 45 | 6.4 | 6.5 ± 0.1 | 6.6 ± 0.1 | 0.58 ± 0.02 | 0.62 ± 0.03 | 6.4 ± 0.1 | 0.58 ± 0.02 |
| PB（聚丁二烯） | 翅片芽外观 | 47 | 7.2 | 7.2 ± 0.1 | 7.5 ± 0.1 | 0.78 ± 0.02 | 0.85 ± 0.03 | 7.4 ± 0.1 | 0.83 ± 0.04 |
| 公共关系 | P翅片射线外观 | 49 | 8.6 | 8.5 ± 0.1 | 8.7 ± 0.1 | 1.16 ± 0.03 | 1.22 ± 0.03 | 8.6 ± 0.2 | 1.18 ± 0.03 |
| 服务提供商 | 后部起鳞 | 51 | 9.6 | 9.5 ± 0.2 | 9.6 ± 0.2 | 1.43 ± 0.05 | 1.48 ± 0.05 | 未注明日期。 | 未注明日期。 |
| 沙特阿拉伯 | 通过前部成鳞 | 52 | 10.4 | 10.1 ± 0.2 | 10.4 ± 0.2 | 1.67 ± 0.05 | 1.73 ± 0.06 | 未注明日期。 | 未注明日期。 |
| J型 | 少年（已完成方形化） | 53 | 11 | 11.3 ± 0.4 | 11.7 ± 0.3 | 2.02 ± 0.11 | 2.11 ± 0.07 | 10.9 ± 0.3 | 1.77 ± 0.06 |
中的里程碑跨越广泛的发展。第一个里程碑是孵化后不久后，后囊膜（pSB）膨胀，导致“漂浮”。最后一个里程碑，即完成鳞片化，用于定义青少年期的开始。这些里程碑代表了胚胎后斑马鱼分期的起点（见下文）。
这些里程碑的一个局限性是它们在大小上的分布不均，这表明它们可能无法为某些研究提供足够的发展进展指示。例如，我们能够识别5–6 mm SL之间的四个容易辨别的转变，尽管其中一些转变几乎同时发生，它们可能无法提供额外的分辨率，并且在一些个体中可以观察到顺序的逆转（例如，aSB与MMA）。我们还确定了两个里程碑，每个里程碑位于4-5 mm SL和6-7 mm SL之间，但其他1 mm SL间隔只有一个里程碑。需要进一步分析，以揭示后一个尺寸范围内发生的离散、外部可见的过渡（如果存在）。
幼年期之后的主要里程碑是性成熟，此时鱼可以被视为成年鱼。性成熟的标志是在处于繁殖状态的鱼类中产生可存活的配子和第二性特征，包括雄性的腹部微黄色和怀孕雌性的腹部膨胀。对于男性，早在17.5±0.6 mm SL、3.64±0.21 mm HAA时，这些特征就很明显；女性：18.3±0.7 mm SL，3.95±0.12 mm HAA（平均值±95%置信区间）。
增长和环境影响
与胚胎发生相比，胚胎后发育期间缺乏离散的分期标准，这促使人们使用基于尺寸的测量方法来指示其他鱼类的发育进展(Fuiman等人，1998年). 如果要使用尺寸的定量测量，尺寸和其他性状的发育之间的关系应在温度和生长速度之间保持不变。
为了测试基于大小的发育关系与温度和生长速率的恒定性，我们在三种温度（24°C、28.5°C、33°C）和三种生长条件的所有组合中饲养幼虫，构成不同的幼虫密度（低、中、高），不同条件下的单一食物水平，从而导致人均粮食供应量不同。正如预期的那样，这些不同的饲养条件导致了显著不同的生长。例如，在24°C下饲养的鱼的生长速度比在33°C下养殖的鱼慢（SL mm/天，平均值±SE:0.45±0.009，0.54±0.011；F类2,762=53.6,P（P）>0.0001). 同样，高密度养殖的鱼类生长速度比低密度养殖的鱼慢（每天SL mm，平均值±SE:0.48±0.006，0.55±0.006；F类2,762=40.9,P（P）<0.0001). 然后，我们研究了几个性状（鱼鳔叶、鳍芽和鳍射线外观、鳞片发育、黑素细胞模式评分）的大小和发育状态之间的关系。这使我们能够测试鱼类表现出每种特征特定状态的可能性是否不仅取决于大小，还取决于温度、密度或这些变量之间的相互作用。
多元logistic回归分析表明，正如预期的那样，大小（以SL或HAA衡量）与所有被检测性状的发育进展具有最高的相关性(; 全部的R（右）2>0.5). 此外，即使在控制了尺寸后，我们也发现了温度的显著影响（所有性状：0.001<P（P）<0.05），在某些情况下，密度的影响以及尺寸与温度或尺寸与密度之间的相互作用。后一种相互作用具有潜在的重要性，因为它们表明，大小和发育进程之间的关系因温度和生长速度（根据饲养密度而改变）而异。这种相互作用并不出乎意料，在其他情况下，其他物种的野生型鱼类也曾报道过这种相互作用(Klimogianni等人，2004年;Martell等人，2005年;Georgakopoulou等人，2007年)，斑马鱼变种(巴黎和肿瘤，2003年)和两栖类幼虫(巴黎和卡普兰，1995年).
表5
大小的发育相关性，以及温度和生长速率的影响，受密度的调节（详见正文）。
| 独立变量1
|
|---|
| 尺寸（SL或HAA）
| 温度
| 温度×尺寸
| 密度
| 密度×尺寸
|
|---|
| 因变量 | Χ2 | P（P） | R（右）2 | Χ2 | P（P） | R（右）2 | Χ2 | P（P） | R（右）2 | Χ2 | P（P） | R（右）2 | Χ2 | P（P） | R（右）2 |
|---|
| SL与。 | | | | | | | | | | | | | | | |
| Swimbadder公司 | 349 | |
0.77
| 8 | <0.05 | 0.02 | 11 | <0.005 | 0.01 | NS公司2 | NS公司 | — | NS公司 | NS公司 | — |
| 尾鳍 | 223 |
|
0.64
| 9 | | 0.02 | —三 | — | — | NS公司 | NS公司 | — | NS公司 | NS公司 | — |
| Anal翅片 | 745 | <0.0001 |
0.78
| 21 |
| 0.02 | NS公司 | NS公司 | — | NS公司 | NS公司 | — | NS公司 | NS公司 | — |
| 背鳍 | 501 | <0.0001 |
0.69
| 7 | <0.05 | 0.02 | 14 | <0.005 | 0.01 | NS公司 | NS公司 | — | NS公司 | NS公司 | — |
| 骨盆鳍 | 539 | <0.0001 |
0.62
| 25 | <0.0001 | 0.03 | 12 | <0.005 | 0.01 | 24 | <0.0001 | 0.02 | NS公司 | NS公司 | — |
| 正方形化 | 106 | <0.0001 |
0.74
| 16 | <0.0005 | 0.04 | 13 | <0.005 | 0.03 | 7 | <0.05 | 0.02 | NS公司 | NS公司 | — |
| 黑色素粒图案 | 568 | <0.0001 |
0.50
| 68 | <0.0001 | 0.02 | 7 | <0.05 | 0.005 | 72 | <0.0001 | 0.02 | 80 | <0.0001 | 0.03 |
| HAA与。 | | | | | | | | | | | | | | | |
| Swimbadder公司 | 339 | <0.0001 |
0.69
| 7 | <0.05 | 0.02 | 7 | <0.05 | 0.01 | NS公司 | NS公司 | — | NS公司 | NS公司 | — |
| 尾鳍 | 214 | <0.0001 |
0.60
| 12 | <0.005 | 0.03 | — | — | — | NS公司 | NS公司 | — | NS公司 | NS公司 | — |
| Anal翅片 | 700 | <0.0001 |
0.74
| 18 | <0.0005 | 0.02 | NS公司 | NS公司 | — | NS公司 | NS公司 | — | NS公司 | NS公司 | — |
| 背鳍 | 195 | <0.0001 |
0.67
| 13 | <0.005 | 0.01 | 15 | <0.001 | 0.01 | 7 | <0.05 | <0.01 | 8 | <0.05 | 0.01 |
| 骨盆鳍 | 522 | <0.0001 |
0.59
| 29 | <0.0001 | 0.04 | 22 | <0.0001 | 0.02 | 21 | <0.001 | 0.01 | NS公司 | NS公司 | — |
| 正方形化 | 96 | <0.0001 |
0.73
| 13 | <0.005 | 0.03 | 11 | <0.005 | 0.02 | 9 | <0.01 | 0.02 | NS公司 | NS公司 | — |
| 黑色素粒图案 | 545 | <0.0001 |
0.50
| 8 | <0.0001 | <0.01 | 501 | 0.07 | <0.01 | 75 | <0.0001 | 0.02 | 73 | <0.0001 | 0.02 |
| SL公司
| 温度
| 温度×尺寸
| 密度
| 密度×尺寸
|
|
F类
1,771
|
P（P）
|
R（右）2
|
F类
2,771
|
P（P）
|
R（右）2
|
F类
2,771
|
P（P）
|
R（右）2
|
F类
2,771
|
P（P）
|
R（右）2
|
F类
2, 771
|
P（P）
|
R（右）2
|
|
|
| HAA公司 | 4437 | <0.0001 |
0.98
| 123 | <0.0001 | 0.001 | 4.9 | <0.01 | <0.001 | 4.5 | <0.05 | <0.001 | 14 | <0.0001 | <0.001 |
尺寸与生长速度或饲养条件之间的交互作用在后期性状中最为显著。例如，在骨盆鳍的转变中，与在28.5°C下饲养的幼虫相比，在24°C下喂养的幼虫经历了尺寸稍大的转变，而在33°C下养殖的幼虫在更大的尺寸范围内经历了这些转变(). 温度和密度之间的黑色素粒模式转换也不同(). 与28.5°C下的幼虫相比，在24°C下饲养的幼虫经历了略大尺寸的转变。此外，与中等密度的幼虫相比，低密度（生长较快）的幼虫在较大的尺寸上经历过渡，而高密度（生长较慢）的幼虫则在较小的尺寸上进行过渡。
饲养温度对SL与其他性状的关系有微妙的影响。图中显示了鱼鳔、背鳍和骨盆鳍发育过渡的多重逻辑回归预测图。概率表示特定SL个体根据饲养温度表现出特定发育状态的可能性。每个图中都显示了特定于特征的状态。
温度和饲养密度影响黑素细胞模式的转变。请参见图例和文本以了解更多详细信息。
温度、密度以及与大小的交互作用的许多影响在统计学上具有高度显著性，这可能反映了我们使用的大样本量(N个=782). 为了评估这些影响的生物学意义，我们计算了决定系数，以估计不同因素解释的方差比例。这表明，在控制了尺寸的主要影响后，温度、密度及其与尺寸的相互作用解释了很少的额外变化（全部R（右）2<0.05;). SL和HAA之间的关系在不同条件下也有所不同，但这些影响的程度类似低(). 这些发现表明，为了量化斑马鱼的发育进程，SL或HAA与其他性状之间的关系相对独立，但并不完全独立于温度和生长速度（由饲养密度调节）。这一结果在发展转型的规模估计值的相似性中也很明显，如纵向数据集表示单独饲养的幼虫的值，而横截面数据集表示在此处描述和分析的温度和密度范围内饲养的幼虫值即使反复麻醉的单独饲养的幼虫生长缓慢（SL mm/天平均值±SE:0.32±0.004；)基于规模的发展里程碑估计值在数据集之间非常相似，通常在5%以内。
总之，这些数据表明，在大多数情况下，规模应该是发展进步的一个相对稳健的指标。然而，生长速度对此处所述特定物种的精确影响假设，幼虫的生长速度不会像在特别不利的条件下发生的那样，太慢而不健康或有更大的死亡风险。一般来说，恶劣的生长条件通常会导致鱼缸内幼虫大小的变化增加，因为较大个体越来越垄断资源并干扰较小个体的行为，放大了初始生长的微小差异(布朗，1957年;瑞克，1958年;伊顿和法利，1974年;Ward等人，2006年). 虽然这种现象发生在野生型种群中，并在多种物种和条件下观察到，但不同的生长速度和能力也可能使具有胚后表型的突变体的恢复和繁殖复杂化。因此，野生型鱼类鱼缸内的尺寸分布不对称可能表明生长条件较差，应进一步优化，而分离胚胎后突变表型的鱼群应定期进行分类，以分离此类突变，以防止它们因与野生型兄弟姐妹竞争而损失。
HOC后规模估算
当在进行实验之前很难或不可能测量尺寸时，使用尺寸作为发育状态的代表会受到限制。例如，胚胎发育后的鱼类即使在鱼缸内也容易表现出尺寸的变异性，然而在组织学分析之前测量鱼类可能是乏味或不切实际的。因此，我们询问了幼虫的大小和形状如何受到两种常用的组织学程序的影响，这两种程序是多聚甲醛固定和整体原位杂交。
显示了SL和HAA的前处理值和后处理值之间的关系，观察到的线性或近似线性收缩表明，只要确定了适当的校准，事后尺寸估计应该是先前测量的有用替代品。例如，对于此处使用的原位杂交协议，约6 mm SL后处理的幼虫对应于约9 mm SL前处理的幼虫。提供了允许根据组织学准备后的测量值估计初始SL和HAA的关系。
组织学处理对SL（上部图）和HAA（下部图）的影响。鱼被固定或模拟加工用于原位杂交（ISH）。中报告的回归.
与规模相关的发展里程碑的参考个人
在这里，我们展示了一系列已达到特定发育里程碑的个体鱼，或表现出与指定里程碑之间的发育状态。提供了不同的视图和放大倍数，以便于进行性状之间的比较。在每个图中，左下方提供了里程碑的缩写，右下方提供了“标准长度”（SSL；请参阅阶段报告考虑因素和建议的惯例）。我们提供以下简要说明；其他性状的发育状态可以通过参考前面的章节来推断。
Pec-fin期（3.4 mm SL开始）
为了与胚胎后阶段进行比较，我们在这里包括pec翅片阶段，在28.5°C时开始~60 hpf，对应于胚胎晚期(Kimmel等人，1995年). 胸鳍远端呈扁平叶片，沿身体侧面固定；嘴在腹部张开（未显示）。黑色素细胞黑化良好，在背侧和腹侧肌节处形成条纹，但腹侧后方会出现尾鳍冷凝。黑色素细胞仍然散布在卵黄囊中。全身的黄载体呈黄色。
胚胎的pec翅片的阶段Kimmel等人（1995年）; 3.4毫米SL。A、 A类'：全身。箭头，黄色素体覆盖蛋黄球。刻度，1 mm。B类：头部。抄送：游泳膀胱，尚未充气。C、 C’：尾巴。箭头，与尾鳍冷凝区域相对应的黑色素孔图案的间隙。
pSB，鱼鳔膨胀（3.4–3.7 mm SL发作）
数字,。鱼鳔的后叶（第一叶）膨胀，导致“漂浮”。开口向前突出，内脏在鱼鳔下面更清晰可见。胚胎/早期幼虫色素模式完整，在背侧和腹侧肌节、卵黄囊背侧和腹面以及水平肌隔上有条纹状的黑色素细胞；黑素细胞不再分散在卵黄囊上。鱼鳔上方可见虹彩斑。鳍褶裂片从身体延伸得更远。
游泳后膀胱叶充气；pSB，3.5毫米SL。A、 A’：整个身体。刻度，1 mm。B、 B’：头部。抄送：前躯干显示充气的鱼鳔（箭头）和覆盖的虹彩斑（箭头）。D、 D’：后躯干显示明确的早期幼虫黑素细胞和黄色细胞模式。电子邮箱：尾鳍区，突出完整的鳍褶皱。箭头，内脏。F、 F’：尾部后部。箭头，尾鳍凝缩，黑素条纹中有缺口。
游泳后膀胱叶充气后；pSB+，3.8毫米SL。A、 A’：整个身体。刻度，1 mm。B、 B’：头部显示嘴的前部位置（箭头）。抄送：前躯干。D、 D’：后躯干部。电子邮箱：尾部区域。F、 F’：尾部后部。
FLe，早期屈曲（4.4–4.7 mm SL发作）
.诺托字屈曲已经开始（0<25°C）。腹后可见间充质凝结，尾鳍将在此处发育，一些黑素细胞位于其上。肠腔越来越明显。嘴和前头部进一步向前突出。幼虫开始觅食。
早期屈曲；FLe，4.5毫米SL。A、 A’：整个身体。刻度，1 mm。B、 B’：头部。抄送：前躯干可见鱼鳔。D、 D’：后躯干和色素图案。电子邮箱：尾部区域。F、 F’：尾部后部。箭头，尾鳍冷凝越来越明显。
CR，尾鳍射线外观（4.9–5.1 mm SL开始）
尾鳍射线很明显，其中散布着黑色素细胞。身体上的黄色素着色褪色。鳍褶的主要叶背面有明显的细微收缩，尾部后方对称性较差。口位于末端，幼虫正在积极觅食。
尾鳍线外观；CR，4.9毫米SL。A、 A’：整个身体。刻度，1 mm。B、 B’：头。抄送：前躯干。D、 D’：后行李厢。黄色素色素现在不那么明显了。电子邮箱：尾部区域。F、 F’：尾部后部。箭头，尾鳍的第一鳍射线。
AC，臀鳍冷凝（5.2–5.5 mm SL发作）
.在肛门排气口后面可以看到间充质冷凝，肛门将在此处发育。背鳍褶皱处可能出现轻微隆起，背鳍会在此处凝结。幼虫鳍褶的远端相对圆整，位于发育中的尾鳍上方。
翅片冷凝；AC，5.4毫米SL。A、 A’：整个身体。刻度，1 mm。B、 B’：头部。抄送：前躯干。D、 D’：后躯干显示预期肛鳍的浓缩间质（箭头所示）。电子邮箱：尾部区域。F、 F’：尾部后部。
DC，背鳍冷凝（5.5–5.8 mm SL开始）
数字,在背鳍形成的地方，背侧有浓缩的间充质；鳍褶的背主叶高于此部位。臀鳍冷凝更明显。尾鳍向后扁平；背侧区域比腹侧区域向后延伸。此时尾鳍射线数变化迅速。黑色素细胞通过尾鳍扩散，第一个黄色素细胞很明显。在靠近鱼鳔的侧面可以看到一片虹彩藻。头部在背部，眼睛上方，松果体水平处有一个凹痕。
背鳍冷凝；直流，5.7 mm SL。A、 A’：整个身体。刻度，1 mm。B、 B’：头部。抄送：先前的。箭头、虹彩覆盖前躯干肌节的腹侧面。D、 D’：后躯干部显示背鳍凝结（箭头）。电子邮箱：尾部区域。F、 F’：尾部后部。鳍末端扁平，黑色素细胞广泛散布在鳍射线中。
背鳍冷凝后；直流+，5.8 mm SL。A、 A’：全身。刻度，1 mm。B、 B’：头部。抄送：先前的。D、 D’：后躯干显示背鳍冷凝和腹鳍冷凝附近的黑色素细胞（箭头所示）。电子邮箱：尾部区域。F、 F’：尾部后部。
MMA，变性黑素细胞外观（5.9–6.3 mm SL发作）
第一个变质的黑素细胞出现在背外侧或腹外侧肌节上，作为单个轻度黑素化的细胞，与胚胎/早期幼虫的黑素体条纹很好地分离。背鳍冷凝更为明显，腹鳍冷凝处可见放射状的发展。
变质性黑素细胞外观；MMA，5.9毫米SL。A、 A’：整个身体。刻度，1 mm。B、 B’：头部。抄送：前面，显示腹外侧肌节上的第一个变性黑素细胞（插图中的箭头）。D、 D’：后躯干，此处尚未出现变质的黑素细胞。电子邮箱：尾部区域。F、 F’：尾部后部。
aSB，前泳囊外观（5.9–6.2 mm SL起病）
数字,。出现前（第二）膀胱叶。通货膨胀的时间和程度变化很大；当叶很小时，叶可能被覆盖的色素细胞部分遮挡。尾鳍的射线数量几乎是最大的（约20条），尾鳍后部大部分是平坦的，尽管最初的迹象表明背叶和腹叶之间可能存在裂缝。现在尾鳍中的黄色体更加明显。尾鳍冷凝区的径向轮廓越来越明显。
游泳前膀胱叶充气；aSB，6.0毫米SL。A、 A’：整个身体。刻度，1 mm。B类：头部。C、 C’：前躯干显示新充气的鱼鳔前叶（箭头所示）。D、 D’：后行李厢。箭头，发展中的尾鳍放射状。电子邮箱：尾部区域。F、 F’：尾部后部。
游泳前膀胱叶充气后；aSB+，6.1毫米SL。A、 A’：整个身体。刻度，1 mm。B类：头部。C、 C’：前躯干显示新充气的鱼鳔前叶（箭头所示）。D、 D’：后行李厢。。电子邮箱：尾部区域。F、 F’：尾鳍后叶显示尾鳍背叶和腹叶之间正在发育的裂口（箭头）。
AR，肛门射线外观（6.1–6.4 mm SL发作）
数字,.肛鳍射线位于发育中的肛鳍桡骨的远端。一些黑素细胞散布着正在形成的射线。背鳍冷凝正在分裂，但骨化（发亮）射线尚不明显；一些黑素细胞可能与间充质有关。在这一时期的后期，在背鳍凝结的正后方，鳍褶的主叶上有一个明显的缺口。侧翼的虹彩囊向后延伸至卵黄延伸或穿过肛门；尾鳍底部可见后斑或虹膜。尾鳍现在具有双叶外观，中间有一个裂口；黑素细胞和黄色细胞混合在一起。
肛鳍线外观；AR，6.2毫米SL。A、 A’：整个身体。刻度，2 mm。B、 B’：头部。抄送：前部可见明显的鱼鳔裂片和上覆的虹彩。D、 D’：后行李厢。虹彩在肌隔腹侧形成一条细线（D中的箭头）。第一段臀鳍射线现在明显位于桡骨远端（D’箭头）。电子邮箱：尾鳍区出现鳍褶吸收迹象。F、 F’：尾部后部，尾端有虹彩斑（箭头所示）。
出现肛门鳍线后，AR+，6.3 mm SL。A、 A’：整个身体。刻度，2 mm。B、 B’：头部。抄送：前躯干。中间树干上方的插图，变质黑色素细胞D、 D’：有背鳍和腹鳍的中躯干。箭，凝聚的间充质将形成尚未完全形成的背鳍射线。箭头，翅片折叠缺口。电子邮箱：后行李厢。F、 F’：尾部后部。
DR，背鳍射线外观（6.4–6.6 mm SL发作）
数字,现在可以在发育中的背鳍内看到射线。沿着后躯干，在背外侧和腹外侧肌节上单独发现一些变性的黑素细胞。鳍褶再吸收越来越明显。
背鳍线外观；DR，6.4毫米SL。A、 A’：整个身体。刻度，2 mm。B、 B’：头。抄送：前躯干。插图，位于后游泳膀胱叶后方腹外侧肌节上的单个变性黑素细胞。D、 D’：有背鳍和腹鳍的中躯干。箭，背鳍射线。电子邮箱：后行李厢。F、 F’：尾部后部。
出现背鳍射线后；DR+，6.6毫米SL。A、 A’：整个身体。刻度，2 mm。B、 B’：头部。抄送：前躯干。D、 D’：中行李厢。电子邮箱：后行李厢。F、 F’：尾部后部。
PB，骨盆鳍芽外观（7.2–7.5 mm SL发作）
数字,骨盆鳍芽从鱼鳔后叶下方的腹壁突起。芽随后伸长，直到其沿腹缘的长度约为其高度的一半。背鳍和肛门鳍都有明显的黄色体。鳍褶初级叶的吸收越来越明显，包括背鳍的前后。变形金刚的黑素细胞越来越多地散布在侧面。残留的胚胎/早期幼虫黑素细胞可在肌节的侧面发现，并可形成成体初级条纹1D(巴黎和肿瘤，2003年;Quigley等人，2004年)尽管成人条纹的独特图案尚未出现。虹彩条纹微弱，但从前到后连续。肛门和背鳍射线数量达到最大值（分别为~15条和~10条）。膀胱前叶的大小更大，而膀胱角度已经开始减小。
骨盆鳍芽形态；PB，7.2毫米SL。A、 A’：整个身体。刻度，2 mm。B类：后行李厢。抄送：前躯干。存在变形的黑素细胞，但未完全黑化（例如箭头）。D、 D’：腹部区域显示骨盆鳍芽（箭头所示）。E、 E’：中躯干显示背鳍和臀鳍以及色素图案。箭头，鳍褶吸收区。F、 F’：背鳍细节。G、 G’：尾鳍的细节。H、 H’：臀鳍细节。
骨盆鳍芽出现后；PB+，7.6毫米SL。A、 A’：整个身体。刻度，2 mm。B、 B’：头部。C、 C’：前躯干和中躯干显示骨盆鳍芽（箭头所示）。医生：骨盆鳍芽显示凝聚的间充质，无射线。E、 E’：中躯干显示背鳍和臀鳍以及色素图案。变形的黑素细胞被完全黑化，分散在侧面（如箭头）。传真：后躯干显示鳍褶吸收和水平肌隔下方的虹膜孔延长线（箭头所示）。G、 G’：背鳍，除黑素细胞外，还显示黄色细胞。H、 H’：尾鳍。一、 我'：臀鳍细节。
PR，盆腔鳍片外观（8.5–8.7 mm SL起病）
数字,.虽然骨盆鳍相对不明显，但骨盆鳍片首先是明显的。靠近骨盆鳍的鳍褶的小叶有明显的凹陷。成年原发性黑素细胞条纹现在很明显，因为在条纹外发现的变性黑素细胞更少；然而，条纹中的一些间隙仍然很明显。标志着第一个成熟间区域的虹膜现在更加独特。在尾鳍和尾鳍上开始出现条纹图案。游泳后膀胱叶进一步向腹侧弯曲。
骨盆鳍线外观；PR，8.5毫米SL。A、 A’：整个身体。刻度，2 mm。B、 B’：头部。抄送：前躯干和中躯干。D、 D’：有第一道射线的骨盆鳍（箭头）以及鳍褶皱的小叶和吸收部位（箭头）。E、 E’：中躯干显示背鳍和臀鳍以及色素图案。残留的胚胎/早期幼虫黑素细胞出现在水平肌隔附近（箭头所示）。F、 F’：背鳍。G、 G’：尾鳍，出现第一条条纹。H、 H’：模拟翅片。
骨盆鳍片出现后；PR+，9.2 mm SL。A、 A’：整个身体。刻度，2 mm。B、 B’：头部。箭头表示须发发育。抄送：前躯干和中躯干。D、 D’：骨盆鳍。E、 E’：中间树干。F、 F’：背鳍。G、 G’：尾鳍。H、 H’：模拟翅片。
SP，后部起鳞（9.5–9.6 mm SL起鳞）
现在，肛门鳍和尾鳍后面的尾部，尤其是腹部的表皮上，可见鳞片，这是脊状突起的证据。骨盆鳍射线数量现在达到最大值（~6），可能发现一些与之相关的黑色素细胞。初级的黑素细胞条纹更规则，尽管一些黑素细胞仍停留在条纹的外面，包括间熟区。
后鳞化发生；SP，9.8毫米SL。A、 A’：整个身体。刻度，2 mm。B、 B’：头部细节。抄送：背侧显示背鳍前无鳞片。医生：尾部后部，显示背侧和腹侧鳞片隆起的脊（箭头）。E、 E’：中躯干显示背鳍和臀鳍以及色素图案。条纹越来越明显，除了一些剩余的间隙（箭头），在成熟间区域发现的胚胎/早期幼虫黑色素细胞更少（箭头）。F、 F’：背鳍。G、 G’：尾鳍，有越来越明显的条纹。H、 H’：鳍，具第一条明显的黑素体条纹。一、 我'：骨盆鳍（箭头）现在有几种不同的射线，其中也有一些黑色素细胞。
SA，通过前部成鳞（10.1–10.4 mm SL起病）
鳞片明显位于背鳍前部，但可能不会延伸到头部。黑色素细胞开始沿着鳞片边缘组织。只有鳍褶的小叶的残余部分存在于通风口的前方。
前鳞化发生；SA，10.4 mm SL。A、 A’：整个身体。刻度，2 mm。B、 B’：头部。抄送：背面有鳞脊（箭头）和鳞片黑色素团的早期组织。医生：尾部后部有鳞片脊（箭头）。E、 E’：中躯干显示背鳍和臀鳍以及色素图案。F、 F’：背鳍。G、 G’：尾鳍。H、 H’：模拟翅片。一、 我'：骨盆鳍和残余鳍在出口处折叠（箭头所示）。
J、 青少年（10.9–11.7 mm SL发作）
图,,。鳞片完全形成，黑素细胞沿每个鳞片边缘形成约2行。翅片折叠吸收完成。第一间熟区通常没有黑色素细胞，成人次级黑色素细胞条纹2V隐约可见。现在尾鳍和肛门鳍上明显可见明确的条纹图案。在这一时期的后期，次级黑素细胞条纹2V变得明显，2D开始形成。
少年；J、 11.0毫米SL。A、 A’：全身，显示新完成的鳞片和鳞片黑素细胞图案。刻度，2 mm。B、 B’：头部。抄送：Dorsum紧靠头部后方。医生：背侧-前侧面。E、 E’：躯干中部显示身体以及背鳍和臀鳍上的幼年色素图案；在此阶段，间熟中仍能发现少量残留的胚胎/早期幼虫黑素细胞。F、 F’：背鳍。G、 G’：尾鳍。H、 H’：模拟翅片。一、 我'：骨盆鳍和排气口，无残余鳍褶皱。
跟随少年；J+，13.0毫米SL。A、 A’：整个身体。刻度，2 mm。B、 B’：头部。抄送：背鳍前面的背鳍，显示出鳞片上出现的额外的黑素细胞。医生：尾部后部。E、 E’：躯干中部显示身体以及背鳍和臀鳍上完整的幼年色素图案。F、 F’：背鳍。G、 G’：尾鳍。H、 H’：模拟翅片。一、 我'：骨盆鳍和排气口，无残余鳍褶皱。
跟随少年；J++，16毫米SL。答：整个身体。刻度，3 mm。B类：头部。抄送：背鳍前面的背侧翼，显示出次要的背黑素细胞条纹（2D）。医生：中行李厢。E、 E’：尾鳍。
A、 成年人
数字,鱼的性成熟表现为配子的产生和处于状态时的第二性特征。灰白的雌性有点肿胀的腹部和突出的发泄口。雄性更苗条，没有一个突出的发泄口，通常在腹侧呈现微黄色。
成年女性；A（f），23毫米长。答：整个身体。这名女性怀孕，表现为腹部扩张。刻度，4 mm。B类：头部。抄送：背鳍前面的背侧翼。医生：中行李厢。E、 E’：尾鳍。F、 F’：骨盆鳍和排气口，显示典型的妊娠女性泄殖腔从体壁突出。
成年女性；A（f），26毫米长。答：整个身体。刻度，4 mm。B类：头部。抄送：背鳍前面的背侧翼。医生：中行李厢。E、 E’：尾鳍。F、 F’：骨盆鳍和排气口；泄殖腔与体壁齐平，这是男性的典型特征。
阶段报告考虑因素和建议的惯例
中的发展里程碑可用于定义胚胎后阶段的开始。因为这些里程碑是命名的，而不是编号的，所以如果发现了其他里程碑，可以很容易地添加它们，并且可以定义其他阶段。然而，仅使用这些里程碑来定义发展阶段存在困难。例如，里程碑之间的几个间隔包括实质性增长和发展。虽然这些变化是连续的而非离散的，但它们是与有机体相关的真正修改，并且可能与有机体的研究相关。此外，如果确定了其他离散变更，则应严格遵守可能导致阶段过于粗糙，无法描述特定的发展状态。最后，我们确定的里程碑仅包括少数性状的改变，尤其依赖鳍，这将限制它们在研究这些性状有缺陷的菌株或突变体方面的用途(Harris等人，2008年).
使用规模，尤其是SL，是使用离散里程碑进行分期的一种替代方法(Fuiman等人，1998年). 原则上，使用尺寸的优点是可以像测量分辨率一样精确地分析发展进程。此外，我们的分析表明，规模与发展里程碑之间存在高度相关性；这些相关性相对独立于饲养条件，尽管并非完全如此（例如。，).
然而，基于规模的分期也有缺点。尽管总体上与发展进程高度相关，但我们仍然发现给定大小的个体之间存在着显著差异（例如图。,,). 此外，应变差异可能会使单独使用尺寸变得复杂。我们尚未观察到菌株AB之间的差异水处理，已经近交10年，和野生型股票，WT（WA），由AB交叉产生水处理和wik水处理然而，我们不能排除目前使用的其他毒株之间，或自然种群中的斑马鱼或最近从自然种群中衍生的斑马鱼类之间存在大小和发育进程之间关系差异的可能性(Trevarrow和Robison，2004年;Engeszer等人，2007年). 最后，许多胚胎后突变表型解耦生长和发育(Mintzer等人，2001年;Elizondo等人，2005年)，排除了仅使用尺寸进行分段。
考虑到这些因素，以及我们希望最大限度地提高当前和未来分析的分期标准的通用性，并最大限度地保持实验室和种群之间的一致性，我们建议使用两种公约中的任何一种来报告斑马鱼胚胎后发育阶段。
1.综合分段
在该公约中，报告了发育里程碑和所用鱼类的大小。我们建议使用“里程碑：SL”格式。例如，中显示的个人将被报告为“PB:7.2 mm SL”（或首次在手稿中使用后的“PB:7.2”）。这样的复合阶段具有提供离散标准和所研究的特定菌株或突变体所特有的任何大小特异性信息的优点。如果不可能或不可行直接测量活鱼中的SL，则可以通过另一种测量方法（如HAA）进行估算，或根据后处理的大小，使用中提供的关系进行估算在这些情况下，我们建议以“里程碑：eSL”格式（例如，“PB:e7.2”）报告阶段。如果无法估计大小，则可以使用“里程碑：-”格式（如，“PB:-”）来表示这一点。
2.标准化标准长度（SSL）分段
在这一公约中，我们提出了一种简化的报告阶段格式，该格式既依赖于离散的里程碑，也依赖于增长和发展的数量方面，同时考虑到应变的具体变化。特别是，当发育进度可以用图中所示的参考鱼来近似时，我们建议使用标准化SL（SSL）–因此，一种已经发育出骨盆鳍芽的幼虫，类似于，可描述为“7.2 SSL”，尽管由于个别变化或应变差异，实际SL可能会略微偏离7.2 mm。如果由于遗传背景或饲养条件，实际SL与所示值有很大差异，或者如果SL是根据其他尺寸测量值估算的，我们建议将该值报告为“e7.2 SSL”。
基于SSL的分期的一个优点是，中间阶段可以描述为所示参考个体之间的插值，中间阶段被尽可能精细地解析为适合所讨论的研究和性状。因此，图中所示个体之间的中间幼虫和，可以被描述为“7.4 SSL”。
结论
我们为斑马鱼胚胎后发育研究中的分期提供了标准。虽然没有一个阶段化系统是完美的，但我们提出了两种用于描述开发进度的约定，这两种约定同时考虑了离散的里程碑和定量变化：复合阶段化和SSL阶段化。我们的分析表明，两者都比使用受精后天数来指示发育进展更好。我们预计，在许多情况下，SSL分段将提供最方便的阶段报告方法，尽管明确侧重于增长或部门间差异的分析可能会更好地适应复合分段。这里提供的公约和数据应有助于进一步研究胚胎后发育的重要过程。
实验程序
鱼类品种和养殖条件
鱼是近交系AB水处理或AB杂交产生的近交种WT（WA）水处理和wik。鱼类在28.5°C的平均温度下饲养，但在24°C或33°C的温度效应研究中除外。鱼类以不同密度单独或成组饲养。为了分析密度和食物可用性对生长和发育的影响，鱼类在低密度（每2.8升鱼缸3-5只）、中密度（约30只）或高密度（约150只）下饲养。对于胚胎后发育的后续个体，将鱼类隔离在塑料杯中，并每天更换水。在这些分析中，采用了14:10的亮暗循环。鱼被喂食标准的食物，包括孵化后不久的海洋轮虫，随着鱼的生长，逐渐过渡到大小不断增加的薄片食物。有关鱼类养殖的详细协议，请访问：http://protist.biology.washington.edu/dparichy/.
成像和显微镜
使用Olympus SZX12表观荧光立体显微镜或蔡司Discovery表观荧光体视显微镜，与Axiocam HR和MR3相机以及Axiovision软件连接，使用MS222进行短暂麻醉后获取鱼类图像。大多数鱼要么浸泡在1%甲基纤维素中，要么放置在琼脂糖内衬的培养皿上后进行成像。将幼鱼和成年鱼深度麻醉，放在塑料盘上，逐渐用温热的琼脂糖覆盖，琼脂糖变硬后，盘倒置，鱼通过平底成像。对于厚标本，在亮场或外荧光模式下采集z叠加，并使用Axiovision扩展聚焦模块生成投影。在Adobe Photoshop CS4中，对图像进行了进一步处理，以实现颜色平衡或消除背景缺陷。
统计分析
所有统计分析均采用JMP 7.0 for Macintosh（SAS Institute，Cary NC）进行。一般来说，连续性状是用标准线性模型或样条检验的，而序数或名义变量是用逻辑回归检验的。可根据要求提供详细的统计方法。
致谢
由美国国立卫生研究院R03 HD050201向DMP提供支持。感谢Parichy实验室的成员对养鱼的帮助，以及C.Kimmel对手稿的有益评论。
赠款赞助商：NIH，国家儿童健康与人类发展研究所；批准号：R03 HD050201
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