大黄性关节炎。作者手稿；PMC 2011年10月1日发布。
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渗透敏感离子通道TRPV4的软骨保护作用：骨关节炎的年龄和性别依赖性进展Trpv4型缺陷小鼠
，博士，1 ，理学硕士，三 ，博士，三 、医学博士、博士，2和，博士1
安德烈亚·克拉克
1北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学中心外科27710
巴塞洛缪·J·沃塔
三宾夕法尼亚州普鲁士国王葛兰素史克公司肌肉骨骼疾病部，邮编19426
桑杰·库马尔
三宾夕法尼亚州普鲁士国王葛兰素史克公司肌肉骨骼疾病部，邮编19426
沃尔夫冈·利德克
2北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学中心医学部，邮编：27710
法希德·吉拉克
1北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学中心外科27710
1北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学中心外科27710
2北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学中心医学部，邮编：27710
三宾夕法尼亚州普鲁士国王葛兰素史克公司肌肉骨骼疾病部，邮编19426
通讯作者：Farshid Guilak，骨科研究实验室博士，地址：375 Medical Sciences Research Building，DUMC Box 3093，Duke University Medical Center，Durham，NC 27710，电话：（919）684 2521，传真：（91九）681 8490
- 补充资料
第1页。
GUID:9C3BB2D9-12A0-4047-8044-033999C86F7C
摘要
目标
虽然机械信号转导的机制尚未完全了解，但机械负荷显著影响关节软骨的生理和病理。瞬时受体电位香草醛4（TRPV4）是一种钙（Ca++)可渗透离子通道，由关节软骨细胞高度表达，可通过渗透和机械刺激进行门控。本研究的目的是确定Trpv4型对小鼠膝关节的结构进行研究并确定是否Trpv4型−/−小鼠表现出钙的改变++对渗透挑战作出反应的信号。
方法
膝关节Trpv4型−/−在小鼠4、6、9和12个月龄时，用组织学和显微计算机断层扫描检查骨关节炎变化和骨结构。荧光成像用于量化软骨细胞钙++完整股软骨内对渗透刺激的信号传导。
结果
删除Trpv4型导致严重的骨关节炎改变，包括软骨颤动、烧伤和蛋白多糖丢失，这些变化取决于年龄和男性。软骨下骨量和钙化半月板体积显著增加，雄性小鼠同样如此。软骨细胞来自Trpv4型+/+小鼠表现出显著的钙++对低渗应激的反应，而不是高渗应激。低渗应激反应或TRPV4激动剂4α-PDD在Trpv4型−/−老鼠。
结论
删除Trpv4型导致渗透诱导钙缺乏++关节软骨细胞中的信号传导，伴随骨密度的进行性、性别依赖性增加和骨关节炎关节变性。这些发现表明TRPV4介导的Ca的关键作用++维持关节健康和正常骨骼结构的信号。
关键词：瞬时受体电位、关节炎、机械应力、关节软骨、钙通道、渗透压、软骨细胞、离子通道
简介
关节软骨是覆盖双关节表面的无血管结缔组织，它提供了一个低摩擦表面，用于支撑和分配关节载荷。软骨由蛋白质多糖和胶原蛋白的水合细胞外基质（ECM）以及软骨细胞组成，软骨细胞是负责维持ECM的细胞。软骨细胞代谢活性部分受物理因素（如机械负荷）的调节(1–三). 生物力学应力向软骨细胞内信号的传递是一种组织特异性的机械传递形式，可能涉及许多生物物理和生物化学事件。继发于ECM的压缩，软骨机械环境的变化可以改变细胞周围的渗透压(4–6)，可能启动各种细胞内信号转导途径(7–13).
由于负电荷蛋白多糖（主要是聚集蛋白聚糖）的大量集中，软骨ECM天生就带电荷。这个固定电荷吸引自由阳离子（例如Na+，K+，加利福尼亚州++)导致间质渗透压增加，从而使组织保持水分(14). 关节负重时，水从组织中渗出，当组织不再受压时，水被重新吸收(15). 因此，除了细胞变形、流体流动和流体压力等其他机械刺激外，软骨细胞在正常关节负荷下的渗透环境可能会出现剧烈的昼夜波动(16–18). 软骨细胞通过细胞内信号级联和急性容积变化对这种渗透波动作出反应(9,10)其次是主动容积调节，包括细胞骨架F-actin重组和溶质转运(8,10,19–22). 尤其是渗透刺激可诱导细胞外钙++内流，由细胞内储存物的释放放大(9,10,12,23,24). 细胞内钙的增加++浓度可能在细胞体积调节、细胞代谢和基因表达中发挥作用(25–27). 软骨细胞对机械应力和渗透应力的敏感性在细胞和组织水平上都有表征，尽管这些细胞感知外部渗透变化的分子机制尚不完全清楚(2).
参与软骨细胞机械渗透信号转导的一个新的潜在候选物是钙++-可渗透、非特异性阳离子通道瞬时受体电位香草素4（TRPV4）(28–30). TRPV4是一种非选择性离子通道，可被多种刺激物激活，包括低极化(31,32)、体积增加、温度升高和某些佛波酯，包括4α-佛波酯12,13-二癸酸酯（4α-PDD）(33).Trpv4型−/−小鼠对高、低渗伤害性刺激的反应受损，中枢神经系统渗透感受受损，随后行为和神经内分泌稳态防御机制减弱(34). 然而Trpv4型在哺乳动物生理学中才刚刚出现，例如Trpv4'型s在内皮血管功能及气道和肺中的作用(35,36). TRPV4在许多组织中表达，包括中枢神经系统、感觉神经元、肾脏、上下呼吸道、唾液腺上皮、内皮细胞、睾丸和骨骼(37,38)但在关节软骨中高度表达，其中通道蛋白定位于包括软骨细胞纤毛在内的外细胞膜(39–41).
最近我们证明，在猪软骨细胞中，Ca++通过TRPV4的信号调节低渗刺激后的容量恢复(41). 此外，通过用4α-PDD激活TRPV4，可以恢复白细胞介素-1（IL-1）对软骨细胞信号和容积调节的抑制。TRPV4在软骨细胞膜（尤其是初级纤毛）中的表达，以及4α-PDD对软骨细胞容积调节的有效作用，有力支持了TRPV4对Ca++软骨细胞对挤压引起的渗透环境变化的反应就地除了在软骨细胞对渗透挑战的反应中发挥作用外，TRPV4还被认为是软骨分化的调节器，并且TRPV4显示出与软骨生成标记物II型胶原和聚集蛋白类似的表达模式(40). 此外，TRPV4介导的钙++4α-PDD诱导的内流上调软骨细胞分化所必需的转录因子Sox9(40). 最近在人类中引起关注的是Trpv4型除了另一种骨骼疾病脊椎测量发育不良外，还与人类短肢症有关，短肢症是一种伴有身材矮小、脊柱侧凸、脊椎动物和长骨畸形的骨骼畸形(42,43).Trpv4型也在成骨细胞和破骨细胞中表达，TRPV4介导的Ca内流++调节破骨细胞的分化(44). 删除Trpv4型抑制卸载引起的矿物并置率和骨形成率水平的降低(45). 这些数据表明TRPV4在软骨骨骼发育和维持中可能发挥作用。双关节的形态和功能是否取决于Trpv4型该基因目前尚不清楚。
在本研究中，我们利用了Trpv4型null小鼠研究的作用Trpv4型在中体内通过组织学和微型计算机断层扫描（μCT）测量自发性膝关节骨性关节炎的发展。此外，我们测量了钙++一种新的渗透负荷信号体外在野生型和野生型股骨髁的完整天然软骨中使用髁突软骨细胞制备Trpv4型缺陷小鼠。体外髁状股骨软骨细胞Trpv4型空白小鼠表现出钙受损++渗透负荷的信号反应就地.缺少Trpv4型导致严重的进行性骨关节炎改变，尤其是在雄性小鼠中，伴随着关节组织骨化的显著增加，提示该通道可能由钙介导的软骨保护作用++低张状态下的门控。
方法
生成Trpv4空值（Trpv4−/−)老鼠
所有动物方案均由杜克大学动物护理和使用委员会（IACUC）批准。Trpv4型先前根据合子产生了空小鼠CRE-长-介导性切除第12外显子Trpv4型编码孔环和相邻跨膜结构域的基因(34). 在这个模型中，Trpv4型从身体的所有组织中删除。这些小鼠是在C57Bl6/J背景菌株上繁殖的，经过第十代，并根据从尾部活检中分离基因组DNA的既定方案进行PCR基因分型。一旦进行基因分型，Trpv4型−/−和Trpv4型+/+被分离并保持为单独的菌落。
TRPV4的免疫标记
采用免疫组织化学方法证实了TRPV4蛋白在软骨细胞中的缺失Trpv4型−/−老鼠。抗TRPV4多克隆抗体(46)以6.4μg/ml的浓度使用。为了进行免疫检测，我们使用山羊抗鼠IgG Alexa Fluor 595（分子探针），在与初级抗体相同的溶液中稀释1:750。
Micro-CT成像
为了检测骨密度和结构的变化，使用三维μCT对小鼠四肢进行成像。八种野生型和八种Trpv4型−/−将动物（四只雄性和四只雌性）分为4、6、9或12个月龄组。最后一个12个月的时间点是在考虑到C57Bl6/J小鼠在24个月内的存活率为80%，并且在12-17个月龄的C57Bl/J小鼠中，39%的小鼠发生了自发性膝关节骨性关节炎之后选择的(47). 在每个时间点，称量并处死六只动物（3只雄性和3只雌性）。后肢的皮肤被切除，右腿在臀部脱臼，与身体分离。所有腿部肌肉保持完好，四肢浸泡在pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，置于−80°C的冷冻管中。四肢解冻，然后在塑料盒中保持生理关节角度，同时浸泡在10%中性缓冲福尔马林中过夜。固定好后，将每条肢体垂直放置在泡沫模具中，将两只肢体小心地叠放在一起，髌骨肌腱在福尔马林填充扫描柱内垂直对齐。然后将圆柱体放置在μCT机器（microCT 40 Scanco Medical AG，Bassersdorf，Switzerland）内进行扫描。对每个样品进行横向平面的高强度中等分辨率（16μm）扫描。
为了区分钙化和软组织，设置了图像强度阈值，并用于研究中使用野生型和Trpv4型−/−老鼠。使用羟基磷灰石（HA）体模将图像强度缩放到骨密度（mg HA/cm）三在每张图像上分析软骨下骨和小梁骨的四个区域；胫骨内外平台和股骨内外髁(补充图S1). 为了检查软骨层（即软骨下骨）下方的骨属性差异，该区域的定义是从第一个横切面开始，软骨下板出现在膝盖中心，到股骨和胫骨软骨下骨的第十二个横切点（上下）。为了确定小梁骨属性的变化，分别在股骨或胫骨小梁骨出现小梁骨的第一个横切面至生长板明显上方或下方的第一个层面确定骨属性。由于小鼠膝半月板是骨化结构，我们评估了半月板钙化区域的特性，包括内侧和外侧半月板的前角和后角(补充图S1). 使用半自动轮廓算法勾勒出所有区域。评估所有轮廓区域的骨密度和体积，计算小梁区域的表观骨密度。从每只后肢内侧和外侧承重区域中心的矢状截面测量股骨和胫骨软骨下骨厚度。使用图像分析软件（蔡司LSM图像浏览器）对截面进行了三次测量，并报告了平均值。Tukey方差分析事后（post-hoc）对所有的骨形态参数数据进行了测试。
组织学
扫描后，除髌腱近端有一个小切口外，后肢无肌肉剥离，膝关节囊完好无损。后肢脱钙，然后在室温下，在浓度增加的乙醇溶液中脱水。将样品埋入石蜡中，在矢状面上切割整个膝盖宽度的组织切片（8μm厚），并用苏木精、固绿和番红花色素O染色。三个盲法分级员使用改良的组织分级方案对切片进行骨关节炎变化分级(48). Tukey的方差分析事后（post-hoc）对全部组织学分级数据进行测试。
钙的荧光成像++在完整的股骨中
试样制备
野生型和Trpv4型−/−称重小鼠（4-5个月大），然后实施安乐死。立即，后肢从身体上脱臼，在解剖显微镜下分离并清洁股骨的肌肉、韧带和肌腱组织。股骨经常喷洒介质，并使用光纤照明确保股骨软骨始终保持湿润。为了确认解剖后的细胞活性，使用荧光活性测定（Invitrogen）对分离的股骨进行了初步研究。收获后，将股骨浸入培养基（无酚Dulbecco改良老鹰培养基（DMEM）（GibcoBRL，Grand Island，NY）、15mM Hepes培养基（Gibco BRL）、pH 7.4（37°C和5%CO）中2.
股骨被固定在定制的压板之间(补充图S2)在倒置共聚焦激光扫描显微镜（LSM 510，Zeiss，Thornwood，NY）上的加热灌注室（Zeiss，Thornwood，NY）内。将股骨浸入2.5 ml培养基中，股骨髁软骨放在盖玻片上。室中介质的温度保持在37°C，由靠近股骨的温度探头测量，在12分钟的数据采集过程中变化小于1°C。
荧光成像
在隔离当天对所有股骨进行了成像。在成像之前，股骨软骨细胞被两个可见光荧光钙负载++指标；呋喃红AM（60μM，随着Ca的增加荧光减弱++)和Fluo-4 AM（16μM，随着Ca的增加荧光增强++)（Invitrogen-分子探针，尤金，俄勒冈州）40分钟。细胞内钙的瞬时变化++浓度（[Ca++]我)使用一个40倍物镜（EC Plan Neofluar，Zeiss，数值孔径0.75），使用之前描述的比例成像技术（Fluo-4的荧光除以Fura Red的荧光）进行测量(49). 这种比率法用于放大荧光信号，并校正测试过程中的焦点变化。使用氩离子激光器（488 nm）激发样品，并在505–550 nm（Fluo-4）和大于650 nm（Fura-Red）下记录荧光发射(). 共焦显微镜的针孔被完全打开，以便收集整个细胞的荧光。在取出培养基并用车辆对照、不等渗培养基（200、250、300、350或400mOsm）或10μM 4α-PDD替换之前，将股骨浸没在300mOsm培养基中进行9次扫描，以非渗透性激活TRPV4。通过向培养基中添加蒸馏水或蔗糖改变培养基渗透压，并使用冰点渗透压计进行验证（Osmette a，Precision systems，Natick，MA）。序列图像（1024×1024，)以0.28 Hz的扫描速度记录12分钟，以测量相对[Ca++]我.
[Ca的荧光成像++]我显示（A）Fluo 4、（B）Fura Red和（C）合成比率图像的不同通道。（D） 比例图像的一部分被放大以显示分辨率。下部面板显示（E）野生型和（F）野生型软骨细胞的百分比Trpv4型−/−股骨髁突对单个或多个钙信号作出反应，作为最终渗透压的函数（所有病例的起始渗透压=300mOsm）或（G）作为4α-PDD存在或不存在（控制）的函数。**与对照组相比p<0.01；*与对照组相比，p<0.05，齐方分析。
数据分析
将比率荧光归一化为每个细胞前九次扫描的平均值。A阳性[Ca++]我响应被定义为归一化比率荧光在背景噪声中的增加大于两个标准偏差，两个荧光指示剂都有响应。单个或多个[Ca反应的细胞百分比++]我对振荡进行了检查。每个[Ca的大小、持续时间和时间++]我峰值与[Ca之间的时间一起测量++]我峰值和每个峰值的上升时间。卡方检验应用于非参数[Ca++]我Tukey的信令数据和方差分析事后（post-hoc）对描述[Ca的参数数据进行的测试++]我峰值特性。
结果
免疫组织化学证实了TRPV4蛋白在软骨细胞中的缺失Trpv4型−/−小鼠(补充图S3). 本研究中使用的小鼠在笼子中定期进行常规观察时，没有表现出任何明显的步态改变迹象或其他关节功能改变迹象。牺牲后，膝盖立即表现出松驰、僵硬或活动范围无差异。平均而言，雄性小鼠比雌性小鼠重（雄性=35.3±7.4g，雌性=29.9±4.3g），老年小鼠比年轻小鼠重（12个月龄雌性=33.0±5.5g，4个月龄女性=27.3±2.3g，12个月期雄性=42.2±12.0g，4月龄雄性=31.5±2.1g）。野生型和敲除型小鼠的体重没有显著差异（野生型雌性=29.5±4.1g，Trpv4型−/−雌性=30.3±4.5g，野生型雄性=35.4±9.4g，Trpv4型−/−雄性=35.2±4.3克）。
μCT成像
钙化和骨化
进行显微CT（μCT）成像以确定骨结构和骨密度随年龄的变化(). 定性观察到籽骨增大和膝盖钙化增加。其中包括髌骨前后的髌腱，以及股骨髁后的两块籽骨(). 还观察到生长板钙化增加().
男性野生型（A、B）和Trpv4型−/−（C，D）小鼠。（A，C）4个月大的小鼠。（B，D）12个月大的小鼠。比例尺=1mm。观察到半月板钙化区以及髌骨和髁状籽骨钙化区显著增大（箭头所示）Trpv4型−/−12个月龄的小鼠。
在4个月、6个月和9个月时，男性和女性野生型和Trpv4型−/−小鼠的体积相似，前部大于后部(). 虽然啮齿类动物的半月板通常会随着年龄的增长而骨化，但在12个月时，所有的半月膜钙化体积都会显著增加Trpv4型−/−半月板区()与雌性小鼠相比，雄性小鼠的这种作用更为严重(). 平均而言，钙化半月板的体积在Trpv4型−/−内侧半月板前部和后部与野生型小鼠的比较(). 此外，半月板钙化部分的密度随时间线性增加，野生型和Trpv4型−/−小鼠().
钙化半月板骨体积（A）和密度（B）与年龄、性别和基因型的关系。钙化半月板骨体积（C）与位置（外侧、内侧）、位置（前、后）和基因型的关系。垂直条表示0.95置信区间，显著性定义为p<0.05。一等效数据点之间存在显著的基因型差异，b条与所有4个月数据点的显著差异，c（c）与6个月等效数据点的显著差异，d日与所有其他数据点的显著差异，以及电子前后等效数据点之间存在显著差异。
软骨下骨
Trpv4型−/−12个月时，雄性小鼠的软骨下骨体积比野生型小鼠大(). 软骨下厚度的增加不能完全解释这种体积的增加，因此包括内侧/外侧和前/后方向的扩张(). 相反，软骨下骨体积在所有时间点都是相似的Trpv4型−/−和野生型雌性小鼠(). 平均而言，内侧软骨下骨体积大于外侧（除了胫骨平台Trpv4型−/−小鼠）和股骨髁与胫骨平台的比较（除了Trpv4型−/−老鼠）(). 男性和女性软骨下骨密度均随时间呈线性增加Trpv4型−/−和野生型小鼠(). 此外，软骨下髁突区域的密度高于平台区域（数据未显示）。
软骨下骨（A）体积和（B）密度以及（D）骨小梁密度是年龄、性别和基因型的函数。软骨下骨体积（C）和小梁骨密度（E）与部位的关系：外侧（lat）、内侧（med）、骨（股骨髁/胫骨平台）和基因型。垂直条表示0.95置信区间，显著性定义为p<0.05。一等效数据点之间存在显著的基因型差异，b条等效数据点之间存在显著的性别差异，c（c）与所有4个月数据点的显著差异，d日与4个月等效数据点的显著差异，电子与所有其他数据点的显著差异，4个月和9个月的等效数据除外，（f）股骨和胫骨等效数据点与克外侧和内侧等效数据点之间存在显著差异。
小梁骨
女性和男性的小梁骨密度随时间呈线性增加Trpv4型−/−和野生型小鼠(). 野生型小梁骨密度大于Trpv4型−/−除胫骨内侧平台外的所有区域的小鼠，无论是野生型还是野生型，外侧髁相对于胫骨平台区域都较大Trpv4型−/−小鼠(). 对于野生型和Trpv4型−/−小鼠胫骨平台内侧的骨小梁密度高于外侧(). 除了野生型股骨髁外，所有髁突区域的小梁骨表观密度均大于平台对应区域和内侧对应区域的小梁骨表观密度（数据未显示）。男性和女性的骨小梁表观密度与时间之间没有一致的关系Trpv4型−/−或野生型小鼠（数据未显示）。
组织学
通过定性和半定量组织学测量，基因敲除小鼠显示出与骨关节炎变性相关的关节异常的年龄和性别相关的增加。12个月大时，雄性Trpv4型−/−小鼠的组织学评分高于所有其他受试者(). 这些小鼠表现出严重的终末期骨关节炎病理学，包括软骨完全侵蚀，股骨和胫骨关节面软骨下骨外露(). 此外，整个关节的半月板都显著增大。9个月大时，雄性Trpv4型−/−与野生型同等小鼠、所有4个月大的小鼠和雌性同等小鼠相比，小鼠的组织学评分增加(). 完全相反，女性之间没有显著差异Trpv4型−/−以及任意时间点的野生型组织学评分(). 平均而言（合并性别），Trpv4型−/−小鼠在膝关节外侧和内侧的股骨和胫骨部位的组织学评分高于野生型小鼠，尽管这种影响主要是由于雄性小鼠的差异所致(). 与股骨关节面相比，这两种基因型的胫骨得分更大().
组织学总评分（A）与年龄、性别和基因型有关，（B）与部位有关：外侧（lat）、内侧（med）、骨（股骨髁/胫骨平台）和基因型。垂直条表示0.95置信区间，显著性定义为p<0.05。一等效数据点之间存在显著的基因型差异，b条等效数据点之间存在显著的性别差异，c（c）与所有4个月数据点的显著差异，d日与所有其他数据点的显著差异，以及电子股骨和胫骨等效数据点之间存在显著差异。
男性野生型（A-D）和Trpv4型−/−（E-H）小鼠。（A、B、E、F）4个月大的小鼠。（C、D、G、H）12个月大的小鼠。切片用苏木精、固绿和藏红O染色，并在40×（A、C、E、G比例尺=500μm）或200×（B、D、F、H，比例尺=100μm）下成像。注意半月板增大，软骨下骨增厚，关节软骨严重缺失（箭头）Trpv4型−/−12个月龄的小鼠。
渗透诱导钙++软骨细胞中的信号转导
本研究中开发的技术允许我们测量[Ca的变化++]我软骨细胞保持在其完整的股骨髁软骨基质环境中。实验表明，低渗对[Ca有显著影响++]我野生型，但不是Trpv4型−/−小鼠(). 一致地，4α-PDD诱发[Ca++]我野生型瞬变，但不是Trpv4型−/−小鼠(). 相反，过氧化对[Ca没有影响++]我野生型或Trpv4型−/−准备().
加利福尼亚州++与4α-PDD刺激相比，野生型小鼠的渗透压反应具有显著差异。峰值[Ca++]我与4α-PDD暴露相比，低渗刺激的强度更大，持续时间更长(补充图S4A和S4B). [Ca的潜伏期和上升时间++]我与4α-PDD刺激相比，渗透峰均更长(补充图S4C和S4D). 相反，低渗和4α-PDD暴露的峰值时间相似(补充图S4E).
讨论
这项研究的结果表明Trpv4型−/−与野生型对照组相比，小鼠在较年轻的时候自发发生骨关节炎，且程度更严重。Trpv4型+/+和Trpv4型−/−小鼠在4个月大时，几乎所有的μCT和组织学参数都无法区分，这表明TRPV4的表达对膝关节的骨骼发育是不必要的。然而，在9个月龄和12个月龄时观察到明显的有害变化，Trpv4型−/−小鼠的关节软骨出现侵蚀，穿透软骨下骨。此外，Trpv4型−/−小鼠表现出骨量增加和过度生长的钙化半月板，半月板完全包围胫股间隔。伴随这些变化的是渗透活化钙的损失++软骨细胞信号转导Trpv4型−/−老鼠。这些意想不到的发现表明，机械和渗透敏感的TRP通道TRPV4在软骨维护和“软骨保护”中发挥着关键作用，可能是通过其作为渗透激活钙的介质的作用++软骨细胞的电导。
我们研究的另一个令人惊讶的结果是Trpv4型−/−雄性小鼠比雌性小鼠更明显。这一发现与大多数研究小鼠自发性骨关节炎的文献一致(50)以及基于手术干预的小鼠骨关节炎模型(51)或关节内注射(52). 在所有这些模型中，与雌性小鼠相比，雄性小鼠的关节退化程度增加。我们目前的研究结果将这一概念扩展到软骨退变的基因编码模型，即软骨细胞缺失Trpv4型相反，女性骨关节炎的发病率和严重程度显著高于男性，尤其是更年期后(53–55). 目前对这种基因的性别特异表达知之甚少Trpv4。最近的一项研究表明，人类的低钠血症与TRPV4多态性有关，但仅在男性中存在(56). 此外，孕酮已被证明可以调节人气道和乳腺上皮细胞以及血管平滑肌细胞中TRPV4的表达(57). 这些细胞暴露于孕酮后，TRPV4在基因和蛋白质水平上的表达均降低，从而减少4α-PDD诱导的Ca++发送信号。软骨保护作用的性二形性机制，无论是基因还是通道调节Trpv4型还有待确定，未来的研究将解决明显和相关的问题，即Trpv4型基因和/或TPRV4通道功能受性腺激素调节。
除了软骨和骨骼，Trpv4型存在于全身许多组织中，包括中枢神经系统、感觉神经元、肾脏、上下呼吸道、唾液腺上皮、内皮和睾丸。这个Trpv4型−/−本研究中使用的模型不是组织特异性的，因此本研究中观察到的变化也可能涉及其他组织中TRPV4的丢失。在未来的研究中，针对软骨或骨的条件敲除模型可能会进一步深入了解TRPV4在软骨或骨中的特定作用。
结合最近发表的报告，包括我们自己关于TRPV4在人类和猪关节软骨细胞中的作用的报告，这些研究揭示了TRPV4对关节软骨细胞的关键作用Trpv4型骨骼功能基因(42–45). 我们目前对基因编码缺失小鼠的分析Trpv4型表明在没有Trpv4型在9个月大时出现第一次形态体征，在1岁时出现更严重的软骨丢失。值得注意的是，与雄性而非雌性小鼠的野生型对照相比，观察到这一点存在显著差异。
为了在软骨细胞水平上收集解释性证据，我们进行了Ca++关节炎软骨细胞对张力刺激的反应成像体外使用野生型与野生型完整股骨髁制备Trpv4型−/−老鼠。如果没有Trpv4型软骨细胞对低渗反应没有增加，换句话说，它们对渗透压无反应。在正常情况下，对机械和/或渗透刺激作出反应的能力是软骨细胞生理学的特征；因此，我们对软骨细胞在缺乏Trpv4型可能是软骨内稳态平衡受损的部分机制性解释Trpv4型使鼠标无效。低渗应力导致的塑性缺乏意味着钙的缺乏++流入软骨细胞，在那里它是细胞体积稳态所需要的，即调节增加的细胞体积。在这方面，我们最近对猪膝关节原代软骨细胞的研究表明，TRPV4的激活足以挽救白细胞介素-1受体（IL-1-R）信号引起的调节容积减少缺陷(41)，早期骨关节炎中关节炎症损伤反应的还原论分子模型。因此，TRPV4介导的钙++流入软骨细胞是软骨保护作用的基础。换句话说，由于基因编码缺失Trpv4型考虑到机械渗透信号在软骨生理学的正常维持中的重要性，在动物的一生中，渗透压敏感功能不全的软骨细胞也可能无法维持组织内稳态(2).
此外，我们的Ca++测量表明，使用低渗负荷或合成剂4α-PDD刺激TRPV4，会导致产生的Ca的对比特性++瞬态。与4α-PDD实验相比，低渗条件下钙峰的大小更大，持续时间更长。此外，与4α-PDD刺激相比，渗透性钙峰的潜伏期和上升时间都更长。虽然这些差异可能是由于与4α-PDD相比，低渗应激在软骨细胞中激活TRPV4的等效“剂量”不同，但这些数据恰恰表明，在软骨细胞内，[Ca++]我反应取决于TRPV4特定的刺激方式。关于软骨细胞对低渗反应可能的共同刺激信号通路，我们的结果是完全缺乏[Ca]++]我中的响应Trpv4型空白小鼠指出TRPV4通道在这种信号转导层次中的主导地位，即TRPV4对Ca是绝对必要的++在低张状态下进入软骨细胞。
总之，我们已经证明了基因编码的缺失Trpv4型导致雄性小鼠自发性骨关节炎的早期和严重发展。这种病理现象出现在整个关节中，并在9个月时首次在关节软骨中观察到。在细胞水平上，Trpv4型是小鼠软骨细胞将低毒性转化为钙所必需的++完整股骨的瞬变。总之，这些观察结果表明Trpv4型，在关节软骨的内环境稳定和维护中起着重要作用，所有这些都是以性变态的方式进行的，雄性动物更容易受到关节炎后遗症的影响Trpv4型删除。此外，了解TRPV4和其他离子通道在软骨细胞对机械刺激的反应中的作用，将为关节软骨的生长、发育和病理学提供新的见解，以及在组织工程背景下影响软骨再生的潜力。
致谢
作者要感谢Steve Johnson在所有动物手术中的出色帮助，Greg Meyers在组织切片、染色和摄影方面的帮助，Eric Mansfield在Ca++数据分析，Tim Griffin、Bridgette Furman和Holly Leddy协助组织学分级，Sukhee Lee和Holly Leaddy协助TRPV4免疫组化。这项研究得到了关节炎基金会、葛兰素史克公司的支持，NIH授予AR48182、AR48852、AR50245和AG15768。
工具书类
1Griffin TM，Guilak F.机械负荷在骨关节炎发病和进展中的作用。运动与运动科学评论。2005;33(4):195–200.[公共医学][谷歌学者] 2Guilak F，Hung CT。软骨代谢的物理调节。收件人：Mow VC、Huiskes R、编辑。基础骨科生物力学和机械生物学。3.费城：Lippincott Williams&Wilkins；2004年，第259-300页。[谷歌学者] 三。Urban JPG、Hall AC、Gehl KA。关节软骨细胞的离子和渗透环境对基质合成速率的调节。细胞生理学杂志。1993;154:262–70.[公共医学][谷歌学者] 4Guilak F、Alexopoulos LG、Upton ML、Youn I、Choi JB、Cao L等。细胞周基质作为关节软骨生物力学和生物化学信号的传感器。Ann N Y科学院。2006;1068:498–512.[公共医学][谷歌学者] 5Mow VC，Wang CC，Hung CT。关节软骨中细胞外基质、间质液和离子作为机械信号换能器。骨关节炎软骨。1999;7(1):41–58.[公共医学][谷歌学者] 6Alexopoulos LG，Setton LA，Guilak F.软骨细胞周围基质在关节软骨中的生物力学作用。生物学报。2005;1(3):317–25.[公共医学][谷歌学者] 7Chao PG，Tang Z，Angelini E，West AC，Costa KD，Hung CT。使用新型微流体装置对软骨细胞进行动态渗透负荷。生物技术杂志。2005;38（6） ：1273–81。[公共医学][谷歌学者] 8Chao PH，West AC，Hung CT。软骨细胞细胞内钙、细胞骨架组织和对动态渗透负荷的基因表达反应。美国生理学杂志《细胞生理学》。2006;291（4） ：C718–25。[公共医学][谷歌学者] 9Erickson GR、Alexopoulos LG、Guilak F.高渗应激通过跨膜、磷脂和G蛋白途径诱导软骨细胞的体积变化和钙瞬变。生物技术杂志。2001;34(12):1527–35.[公共医学][谷歌学者] 10Erickson GR、Northrup DL、Guilak F.低渗应激诱导关节软骨细胞钙依赖性肌动蛋白重组。骨关节炎软骨。2003;11(3):187–97.[公共医学][谷歌学者] 11Hung CT、LeRoux MA、Palmer GD、Chao PH、Lo S、Valhmu WB。在2D和3D培养中，受到低张和高张负荷的软骨细胞中的聚集蛋白基因表达不同。生物流变学。2003;40(1–3):61–72.[公共医学][谷歌学者] 12Yellowely CE、Hancox JC、Donahue HJ。细胞肿胀对牛关节软骨细胞内钙和膜电流的影响。细胞生物化学杂志。2002;86(2):290–301.[公共医学][谷歌学者] 13Sanchez JC，Wilkins RJ。牛关节软骨细胞高渗时细胞内钙浓度的变化。复合生物化学物理。2004;137（1） ：173–82。[公共医学][谷歌学者] 14Maroudas A.关节软骨的物理化学特性。收信人：MF，编辑。成人关节软骨。皮特曼医疗公司；Tunbridge Wells:1979年。第215-90页。[谷歌学者] 15Maroudas A、Wachtel E、Grushko G、Katz EP、Weinberg P。渗透压和机械压力对关节软骨水分分配的影响。生物化学与生物物理学报。1991;1073(2):285–94.[公共医学][谷歌学者] 16Waterton JC、Solloway S、Foster JE、Keen MC、Gandy S、Middleton BJ等。年轻成人股骨关节软骨的日变化。Magn Reson Med.公司。2000;43(1):126–32.[公共医学][谷歌学者] 17Mow VC、Bachrach NM、Setton LA、Guilak F.关节软骨和软骨细胞中的应力、应变、压力和流场。收件人：Mow VC、Guilak F、Tran-Son-Tay R、Hochmuth RM，编辑。细胞力学和细胞工程。纽约：Springer Verlag；1994年，第345-79页。[谷歌学者] 18Haider MA、Schugart RC、Setton LA、Guilak F.分离软骨在渗透负荷下被动肿胀反应的机械化学模型。生物技术模型机械双醇。2006;5（2-3）：160–71。[公共医学][谷歌学者] 19Kerrigan MJ，Hook CS，Qusus A，Hall AC。原位和分离的牛关节软骨细胞的调节体积增加（RVI）。细胞生理学杂志。2006;209(2):481–92.[公共医学][谷歌学者] 20Borghetti P、Salda LD、De Angelis E、Maltarello MC、Petronini PG、Cabassi E等。猪关节软骨细胞对渗透应激的适应性细胞反应。组织与细胞。1995;27(2):173–83.[公共医学][谷歌学者] 21Bush PG，Hall AC。分离和原位牛关节软骨细胞的渗透敏感性。骨科研究杂志。2001;19:768–78.[公共医学][谷歌学者] 22Bush PG，Hall AC。分离和原位牛关节软骨细胞调节容积减少（RVD）。细胞生理学杂志。2001;187(3):304–14.[公共医学][谷歌学者] 23Mobasheri A.牛关节软骨细胞中细胞外离子和渗透环境对Na+，K+-ATP酶密度的调节。生理学研究。1999;48(6):509–12.[公共医学][谷歌学者] 24Sanchez JC、Danks TA、Wilkins RJ。牛关节软骨细胞低张休克后细胞内钙增加的机制。生物物理学Gen Physiol Biophys。2003;22（4） ：487–500。[公共医学][谷歌学者] 25McCarty NA，O'Neil RG。细胞容积调节中的钙信号传导。生理学评论。1992;72(4):1037–61.[公共医学][谷歌学者] 26Liu X、Bandyopadhyay BC、Nakamoto T、Singh B、Liedtke W、Melvin JE等。AQP5在低渗激活TRPV4中的作用：AQP4和TRPV4协同参与细胞体积恢复的调节。生物化学杂志。2006;281(22):15485–95.[公共医学][谷歌学者] 27Hardingham GE，Bading H.钙作为控制基因表达的通用第二信使。Microsc Res技术。1999;46(6):348–55.[公共医学][谷歌学者] 28Liedtke W、Choe Y、Marti-Renom MA、Bell AM、Denis CS、Sali A等。香草样受体相关渗透激活通道（VR-OAC），一种候选脊椎动物渗透感受器。单元格。2000;103(3):525–35. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 29Strotmann R、Harteneck C、Nunnenmacher K、Schultz G、Plant TD.OTRPC4，一种对细胞外渗透压具有敏感性的非选择性阳离子通道。自然细胞生物学。2000;2(10):695–702.[公共医学][谷歌学者] 30Nilius B，Voets T.TRP通道：通过多功能阳离子通道的TR（I）P。Pflugers架构。2005[公共医学][谷歌学者] 31Liedtke W.TRPV4作为渗透压传感器：转基因方法。Pflugers架构。2005[公共医学][谷歌学者] 33Nilius B，Watanabe H，Vriens J.TRPV4通道：结构-功能关系和混杂门控行为。Pflugers架构。2003[公共医学][谷歌学者] 34Liedtke W，Friedman JM。trpv4−/−小鼠的异常渗透调节。美国国家科学院院刊。2003;100（23）：13698–703。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 35Alvarez DF，King JA，Weber D，Addison E，Liedtke W，Townsley MI。瞬时受体电位香草醛4介导的肺泡隔屏障破坏：急性肺损伤的新机制。圆形Res。2006;99(9):988–95. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 36Sidhaye VK，Guler AD，Schweitzer KS，D'Alessio F，Caterina MJ，King LS。瞬时受体电位香草酸4调节低渗条件下的水通道蛋白-5丰度。美国国家科学院院刊。2006;103(12):4747–52. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 37彭JB，Hediger MA。肾脏钙通透性通道家族：在肾脏钙处理中的不同作用。肾性高血压。2002;11(5):555–61.[公共医学][谷歌学者] 38Guilak F，Leddy HA，Liedtke W。瞬时受体电位香草醛4：肌肉骨骼系统的第六感？Ann N Y科学院。2010;1192(1):404–9. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 39Mangos S，Liu Y，Drummond IA。斑马鱼多个发育器官中渗透感受通道trpv4的动态表达。基因表达模式。2007;7(4):480–4. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 40Muramatsu S、Wakabayashi M、Ohno T、Amano K、Ooishi R、Sugahara T等。功能基因筛选系统确定TRPV4是软骨分化的调节器。生物化学杂志。2007;282(44):32158–67.[公共医学][谷歌学者] 41Phan MN、Leddy HA、Votta BJ、Kumar S、Levy DS、Lipshutz DB等。TRPV4作为关节软骨细胞渗透敏感离子通道的功能表征。关节炎和风湿病。2009新闻界。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 42Rock MJ、Prenen J、Funari VA、Funari TL、Merriman B、Nelson SF等。TRPV4的功能获得突变导致常染色体显性短染色体血症。自然遗传学。2008年；40(8):999–1003. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 43Krakow D，Vriens J，Camacho N，Luong P，Deixler H，Funari TL，et al.编码钙离子通道TRPV4的基因突变导致脊椎测量异常发育、Kozlowski型和变向性发育不良。美国人类遗传学杂志。2009 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 44Masuyama R、Vriens J、Voets T、Karashima Y、Owsianik G、Vennekens R等。TRPV4介导的钙内流调节破骨细胞的终末分化。单元格元数据。2008年；8(3):257–65.[公共医学][谷歌学者] 45Mizoguchi F、Mizuno A、Hayata T、Nakashima K、Heller S、Ushida T等。瞬时受体电位香草醛4缺乏可抑制卸载诱导的骨丢失。细胞生理学杂志。2008年；216(1):47–53.[公共医学][谷歌学者] 46Lorenzo IM、Liedtke W、Sanderson MJ、Valverde MA。TRPV4通道参与小鼠气道上皮细胞中受体操作的钙进入和睫状体搏动频率调节。美国国家科学院院刊。2008年；105(34):12611–6. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 47Jay GE，Jr，Sokoloff L.小型实验动物退行性关节病的自然病史。二、。近交系小鼠膝关节骨骺成熟和骨关节炎。AMA病理学档案。1956;62(2):129–35.[公共医学][谷歌学者] 48Furman BD、Strand J、Hembree WC、Ward BD、Guilak F、Olson SA。小鼠膝关节闭合性关节内骨折后关节退行性变：创伤后关节炎模型。矫形研究杂志。2007;25(5):578–92.[公共医学][谷歌学者] 49Lipp P，Niggli E.在分离的心肌细胞中用可见波长指示剂进行比率共焦Ca（2+）测量。细胞钙。1993;14(5):359–72.[公共医学][谷歌学者] 50Silberberg M，Silberberg R.老年小鼠的骨关节炎和骨质疏松症。老年学。1962;6:91–101.[公共医学][谷歌学者] 51Ma HL、Blanchet TJ、Peluso D、Hopkins B、Morris EA、Glasson SS。在手术小鼠模型中，骨关节炎的严重程度取决于性别。骨关节炎软骨。2007;15(6):695–700.[公共医学][谷歌学者] 52van Osch GJ、van der Kraan PM、Vitters EL、Blankevort L、van den Berg WB。通过关节内注射胶原酶诱导小鼠骨关节炎。紧张和性别相关的差异。骨关节炎软骨。1993;1(3):171–7.[公共医学][谷歌学者] 54Srikanth VK、Fryer JL、Zhai G、Winzenberg TM、Hosmer D、Jones G。骨关节炎性别差异患病率、发病率和严重程度的荟萃分析。骨关节炎软骨。2005;13(9):769–81.[公共医学][谷歌学者] 55Lawrence RC、Felson DT、Helmick CG、Arnold LM、Choi H、Deyo RA等。美国关节炎和其他风湿性疾病流行率的估计。第二部分。大黄性关节炎。2008年；58(1):26–35. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 56Tian W，Fu Y，Garcia-Elias A，Fernandez-Fernandez JM，Vicente R，Kramer PL，等。渗透调节性TRPV4基因中的功能丧失非同义多态性与人类低钠血症相关。美国国家科学院院刊。2009;106（33）：14034–9。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 57Jung C、Fandos C、Lorenzo IM、Plata C、Fernandes J、Gene GG等。孕酮受体调节TRPV4通道的表达。Pflugers架构。2009;459(1):105–13.[公共医学][谷歌学者] 
