肝纤维化的进展与miR-199和200家族的过度表达有关

每个人类肝纤维化等级的miRNA表达谱

然后，我们使用105个没有抗病毒治疗史的新鲜冷冻人类慢性丙型肝炎（CH）肝组织，根据肝纤维化的等级进行分类（F0、F1、F2和F3指METAVIR纤维化阶段），建立了人类miRNAs表达谱(图2,表S2). F0级纤维化被视为阴性对照，因为这些样本来自未发现肝纤维化的患者。在斑马鱼中，大多数高度组织特异性的miRNAs在胚胎发育期间表达；在给定的组织中，大约30%的miRNAs在给定的时间点表达[13]在哺乳动物中，最近验证了20-30%的miRNA调用率[14]这种分析表明，样本间miRNA表达水平的差异较小。因此，我们重点研究了两组肝纤维化患者中平均表达水平变化超过1.5倍（p<0.05）的miRNAs。

在单独的窗口中打开

图2

人肝活检标本中的肝纤维化。

A.B.C.D.和E.miRNAs，其表达分别在F0和F3、F0和F1、F0与F2、F1和F2以及F1和F3之间存在显著差异。微阵列检测人肝活检标本中每个miRNA的相对表达水平。使用Welch检验和多假设检验的Bonferroni校正对来自微阵列的数据进行统计分析。折叠变化，p值列在表S2.

几种miRNAs的表达在不同纤维化程度之间存在显著差异。在小鼠研究中，11个miRNAs与肝纤维化进展相关（mmu-let-7e、miR-125-5p、199a-5p、199b、199b*、200a、200b、31、34a、497和802）。在人类研究中，提取了10个miRNA，它们的表达水平在F0和F3之间变化显著（F0<F3:hsa-miR-146b、199a、199a*、200a、200b、34a和34b，F0>F3:hsa-miR-212、23b和422b）。F0和F2之间6个miRNA的表达水平存在显著差异（F0<F2:hsa-miR-146b、200a、34a和34b，F0>F2:hsa-miR-122和23b）。5个提取的miRNAs在F1和F2之间的表达水平存在显著差异（F1<F2:hsa-miR-146b，F1>F2:hsa-miR-122，197，574和768-5p）。在F1和F3之间，9个miRNA的表达水平发生了显著变化（F1<F3:hsa-miR-146b、150、199a、199a*、200a和200b，F1>F3:hsa-miR-378、422b和768-5p）。使用两个标准提取与肝纤维化相关的miRNAs：人类和小鼠标本中的表达模式相似，人类和小鼠之间的序列相同。我们比较了Agilent mouse MiRNA阵列1.0版（miRbase 10.1版）上描述的小鼠MiRNA序列和Agilent human MiRNA阵列1.5版（miR base 9.1版）上所描述的人类MiRNA序列。小鼠miRNA中mmu-miR-199a-5p、mmu-mi R-199b、mmu-miR-199b和mmu-mi-200b的序列分别对应于人类miRNA中hsa-miR-199a、hsa-miR199a*、hsa-miR-199a，hsa-miR 200a和hsa-miR2 200b的顺序(表S3).

实时qPCR验证微阵列结果

选择F1组和F3组之间折叠变化差异最大的4个人类miRNA（miR-199a、miR-199a*、miR-200a和miR-200b），使用基于干环的实时qPCR验证微阵列结果。实时qPCR的结果支持该微阵列分析的结果。这4种miRNA的表达水平在F0和F3之间存在显著差异，spearman相关性分析还表明，这些miRNA的表达与纤维化分级呈强烈正相关（n=105，r=0.498（miR-199a），0.607（miR-199a*），0.639（miR-200a），0.618（miR-200b），p值<0.0001）(图3).

在单独的窗口中打开

图3

实时定量PCR检测miR-199和200个家族在人肝活检标本中的表达水平。

4个miRNA（miR-199a、miR-199a*、miR-200a和miR-200b）的实时qPCR验证。每列代表归一化为U18表达水平的miRNAs的相对数量。所示数据是三个独立实验的平均值+SD。星号分别表示显著差异p<0.05（双尾学生t检验）。

RNA制备和miRNA微阵列

使用米尔Vana miRNA提取试剂盒（Ambion，Austin，TX，USA）符合制造商的说明。miRNA微阵列由安捷伦科技公司（美国加利福尼亚州圣克拉拉）制造，100 ng总RNA使用人类microRNA微阵列试剂盒协议进行标记和杂交，以用于安捷伦microRNA微阵列1.5版和小鼠microRNA芯片试剂盒协议，以用于安捷伦microrRNA微阵列1.0版。用DNA微阵列扫描仪G2505B（安捷伦科技）检测杂交信号，并使用安捷伦特征提取软件（v9.5.3.1）分析扫描图像。使用GeneSpring GX 7.3.1软件（安捷伦科技公司）对数据进行分析，并将其归一化如下：（i）将低于0.01的值设置为0.01。（ii）为了比较单色表达谱，每个测量值除以同一物种所有测量值的第75个百分位。本手稿中的数据保存在NCBI的基因表达总览中，可通过GEO系列登录号GSE16922（人类）和登录号GSE 19865（小鼠）访问。

人类miRNA的实时qPCR

为了通过实时qPCR检测miRNA水平，TaqMan®microRNA分析（Applied Biosystems）用于量化miR-199a（分析ID 002304）、miR-199a*（分析ID 000499）、miR-200a（分析ID.00502）、miR-200b（分析ID 0.02251）和U18（分析ID 001204）的相对表达水平，作为内部对照。使用Taqman miRNA RT Kit（Applied Biosystems）合成cDNA。将5ml无核酸酶水中的总RNA（10 ng/ml）添加到3 ml 5×RT引物、10×1.5µl逆转录酶缓冲液、0.15µl 100 mM dNTP、0.19µl RNase抑制剂、4.16µl无核酸酶水和50U逆转录酶中，总体积为15µl。反应在16°C下进行30分钟，在42°C下执行30分钟，以及在85°C下完成5分钟。所有反应一式三份进行。使用4号染色体检测器（BIO-RAD）检测miRNA的表达。

动物和慢性小鼠肝损伤模型

每5只成年（8周龄）雄性C57BL/6J小鼠每两周腹腔注射一次10%CCL溶液₄在橄榄油（0.02ml/g/只小鼠）中放置4周，然后在接下来的4周内每周放置一次。在第4、6或8周，将小鼠处死。部分肝脏固定，石蜡包埋，并进行组织学处理。连续肝脏切片分别用苏木精-伊红染色、阿桑染色、银（Ag）染色和Elastica van Gieson（EVG）染色。如前所述制备来自小鼠肝组织的总RNA。所有与肝损伤分析相关的动物程序均按照京都大学动物研究委员会的指南进行，并得到京都大学医学院伦理委员会的批准。

细胞系和细胞制备

人类星状细胞系LX-2由Scott L.Friedman提供。LX-2细胞是从人HSC细胞系中建立的，可在无血清培养基中存活并具有高转染能力[26].LX-2细胞用10%胎牛血清保存在D-MEM（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）中，置于直径为60 mm的培养皿中，培养至70%汇合。Huh-7和Hela细胞也保存在含有10%胎牛血清的D-MEM中。如前所述培养HuS-E/2永生化肝细胞[27]在TGFβ1（英国萨福克Sigma-Aldrich）治疗（2.5 ng/ml，20小时）之前，将LX-2细胞在不含0.2%BSA血清的D-MEM中培养48小时。对照细胞在不含胎牛血清的D-MEM中培养。

miRNA转染

转染前一天，将LX-2细胞置于6孔板中，并生长到70%的汇合处。使用脂质体RNAiMAX（Invitrogen）将50 pmol Silencer®阴性对照siRNA（Ambion）或双链成熟miRNA（日本札幌北海道系统科学）转染细胞。转染后2天收集细胞。

实时qPCR

cDNA是使用转录因子高保真cDNA合成试剂盒（瑞士巴塞尔罗氏）合成的。将10.4µl无核酸酶水中的总RNA（2µg）加入1µl 50mM无规六聚体中。变性反应在65°C下进行10分钟。将变性RNA混合物添加到4µl 5×逆转录酶缓冲液、2µl 10 mM dNTP、0.5µl 40U/µl RNase抑制剂和1.1µl逆转录酶（FastStart Universal SYBR Green Master（Roche），总体积为20µl。反应在50℃下进行30分钟（cDNA合成），在85℃下进行5分钟（酶变性）。所有反应均一式三份。使用Chromo 4检测器（BIO-RAD，Hercules，CA，USA）检测mRNA表达。引物序列如下：；MMP13；5′-gaggctccgaaaatgcagat-3′，作为；5′-atgccatcgtgaagtctgt-3′，TIMP1；5′-ctttggcttctgcactgatgg-3′，作为；5′-acgctggtataaggtgtct-3′α1-前胶原；5′-aacatacaaaaacaaaagtg-3′，作为；5′-cattgttcctgtcttctgg-3′和β-肌动蛋白；5′-ccactggcatcgtgatgac-3′，作为；5′-tcatgccaatggtgatgacct-3′。检测分为三次，目标基因的表达水平归一化为β-肌动蛋白基因的表达，并使用实时qPCR作为内部对照进行定量。