肝病学。作者手稿；PMC 2011年1月24日发布。
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尼姆斯：美国国立卫生研究院261447
游离脂肪酸诱导的肝脂毒性中的溶酶体-线粒体轴
,1 ,1 ,1 ,2和1,三
李郑正
1俄亥俄州克利夫兰市克利夫兰诊所细胞生物学系
迈克尔·伯克
1俄亥俄州克利夫兰克利夫兰诊所细胞生物学系
托马斯·麦金太尔
1俄亥俄州克利夫兰克利夫兰诊所细胞生物学系
格雷戈里·戈尔斯
2明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所医学院消化内科和肝病科
Ariel E.费尔德斯坦
1俄亥俄州克利夫兰克利夫兰诊所细胞生物学系
三俄亥俄州克利夫兰市克利夫兰诊所小儿胃肠科
1俄亥俄州克利夫兰克利夫兰诊所细胞生物学系
2明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所医学院消化内科和肝病科
三俄亥俄州克利夫兰市克利夫兰诊所小儿胃肠科
请将转载请求发送至：Ariel E.Feldstein博士，俄亥俄州克利夫兰市欧几里德大道9500号克利夫兰诊所小儿胃肠病和细胞生物学部，邮编44195。atsdlef集团fcc 摘要
线粒体功能受损在很大程度上被认为是非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）疾病进展的核心异常。然而，导致NAFLD线粒体功能障碍的分子机制尚不清楚。本研究探讨了肝细胞中游离脂肪酸（FFA）过度积累对线粒体功能的影响以及溶酶体-线粒体轴在脂肪毒性中的作用。用不同浓度的不同饱和度的FFA处理小鼠原代肝细胞HepG2和McNtcp.24细胞长达24小时。通过实时成像、细胞色素c重新分布和活性氧（ROS）生成监测线粒体功能。建立了溶酶体和线粒体通透性的时间关系。溶酶体蛋白酶组织蛋白酶B的活性受到遗传和药理学方法的抑制。组织蛋白酶B基因敲除小鼠和野生型动物接受高碳水化合物饮食16周，并评估线粒体功能和肝脏损伤。肝细胞暴露于饱和FFA导致线粒体去极化、细胞色素c释放和ROS生成增加。溶酶体通透性和组织蛋白酶B重新分布到细胞质发生在线粒体功能障碍前几个小时。组织蛋白酶B的药理或基因抑制都能保护线粒体功能。最后，组织蛋白酶B失活保护线粒体，降低氧化应激，减轻肝损伤体内.
结论
这些数据强烈表明，饱和FFA在肝细胞中的过度积累直接导致线粒体功能障碍和氧化应激。我们的数据进一步表明，这一过程依赖于溶酶体的破坏和组织蛋白酶B的激活。
非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是目前影响美国和世界许多其他地区成年人和儿童的最常见慢性肝病。1,2非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是NAFLD谱中的一个阶段，其特征是肝脏中脂肪堆积（脂肪变性），以及肝脏损伤、炎症和不同程度的瘢痕或纤维化。三NASH是一种潜在的严重疾病，大约25%的NASH患者可能会发展为肝硬化及其可怕的门脉高压、肝衰竭和肝细胞癌并发症。4,5因此，NAFLD的临床意义来自于它在成人和儿童中的常见发生及其发展为肝硬化和肝衰竭的可能性。
NAFLD/NASH的发病机制，尤其是导致肝损伤和疾病进展的机制，目前尚不清楚，但具有重要的生物医学意义，因为识别这些过程可能有助于确定治疗该疾病的新治疗靶点。6肝细胞中脂质（主要以甘油三酯的形式）的净滞留是NAFLD发生的先决条件。7尽管脂滴中甘油三酯的大量储存可能是惰性的，因此其本身对细胞无害，8,9其他脂质，如游离脂肪酸（FFA）和胆固醇也可能过度积累。10,11越来越多的证据表明，在非二糖细胞中，某些FFA的积累可能具有细胞毒性。8,12线粒体参与许多对肝细胞生存至关重要的过程，包括能量生成、氧化还原控制、钙稳态以及某些代谢和生物合成途径。此外，线粒体往往在细胞死亡机制中发挥重要作用。13一些证据表明，线粒体功能受损是NAFLD患者从单纯脂肪变性发展为脂肪性肝炎的中心异常。14,15线粒体功能障碍以线粒体外膜通透性（MOMP）为特征。MOMP导致多个蛋白质从线粒体膜间隙（IMS）释放到胞浆中。这导致细胞溶质中caspase激活，16线粒体呼吸链（MRC）断裂，线粒体跨膜电位（ΔΨ米)自由基的产生和线粒体结构完整性的丧失。17虽然NAFLD的结构变化、线粒体功能下降和疾病进展之间的关系越来越清楚，但导致NAFLD线粒体功能障碍的亚细胞和分子机制仍不清楚。因此，本研究的总体目标是描述NAFLD患者肝细胞脂质过多积累与线粒体功能障碍和疾病进展相关的基本细胞机制。我们提供的证据表明，在人类和小鼠肝细胞中，饱和FFA会导致线粒体功能障碍并增加ROS的生成。我们表明，这些事件是溶酶体通透性的下游，组织蛋白酶B的遗传或药理抑制可防止FFA诱导的线粒体功能障碍和氧化应激在体外和体内.
材料和方法
细胞系与培养
从野生型C57BL/6雄性小鼠（马萨诸塞州巴尔港Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME）中分离肝细胞，通过Percoll梯度离心纯化，按照前面所述进行培养，18,19隔离4小时后使用。如前所述，培养了分化良好的人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞和分化良好的大鼠肝癌细胞系McNtcp.24细胞。20我们实验室以前的研究表明，这些细胞对FFA诱导的溶酶体通透性具有剂量和时间依赖性，其动力学与在原代小鼠肝细胞中观察到的动力学相当。21用不同浓度（0.05–0.5 mM）的具有不同饱和度的长链游离脂肪酸处理培养细胞，包括来自Sigma（密苏里州圣路易斯）的棕榈酸（饱和）、油酸（1个双键）和亚油酸（2个双键，在含有1%牛血清白蛋白的培养基中培养长达24小时（0.5、1、2、4、8、16和24小时）。在选定的实验中，在组织蛋白酶B选择性抑制剂CA074（20μM、 Sigma-Aldrich）或E-64（10μM、 罗氏诊断公司）。
小干扰RNA与转染
HepG2细胞在6孔板中生长，并使用8 mL siPORT NeoFXTM转染剂（Ambion）以0.5 mL OPTI-MEM（Gibco-Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA）的总转染体积瞬时转染30 nmol/L预先设计的组织蛋白酶B小干扰RNA（siRNA）（AM16708；Ambion。在37°C培养5小时后，添加1.5 mL正常生长培养基。细胞转染48小时后用于实验。通过免疫印迹分析评估组织蛋白酶B蛋白表达的抑制。
LysoTracker红、四甲基罗丹明甲酯负载和免疫荧光
通过用LysoTracker Red（577/590nm）和四甲基罗丹明甲酯（TMRM，549/573nm；Molecular Probes）染色来确定溶酶体和线粒体透化的时间过程，一种线粒体选择性染料，在未固定的活细胞中线粒体去极化后释放，并在荧光显微镜下可见。或者，在4°C下用新制得的4%对甲醛在PBS中固定细胞15分钟。使用单克隆抗体（1:100稀释，mAb 6H2.B4；BD Biosciences）进行细胞色素c的免疫荧光检测。然后使用倒置激光扫描共聚焦显微镜（LSM S10型；新泽西州桑伍德卡尔蔡司）对细胞成像。如我们之前详细描述的那样，在30个随机字段中计算阳性染色细胞的百分比。22
组织蛋白酶B活性测定
根据制造商的说明，使用InnoZyme组织蛋白酶B活性测定法（CBA001；钙生物化学）对全细胞裂解液中的组织蛋白酶B活性进行荧光测定。荧光测量的激发波长为360 nm，发射波长为460 nm。组织蛋白酶B底物与组织蛋白酶B抑制剂CA-074（50μM） 作为阴性对照。酶活性定义为每30分钟总蛋白每微克的荧光单位。
细胞活性氧的测量
使用非荧光细胞发酵剂化合物2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）监测FFA过度积累对肝细胞ROS生成的影响。该技术基于这样的原理，即在被ROS氧化时，该化合物的去酯化形式变成荧光化合物二氯荧光素（DCF）。FFA处理的细胞负载10μM DCFH-DA（分子探针）在37°C的KRH缓冲液中放置30分钟。使用激发和发射波长分别为490和535 nm的反向荧光显微镜在单细胞水平监测荧光化合物DCF。使用冷却电荷耦合装置相机（KAF-1400；Photometrics，Tucson，AZ）拍摄数字图像，并使用荧光成像软件（Metafluor imaging System；Universal imaging Corp.，West Chester，PA）进行分析和量化。DCF荧光表示为零分钟时的荧光百分比。
免疫印迹分析
如前所述，使用全细胞裂解物或细胞溶质组分进行免疫印迹分析。11采用选择性洋地黄素渗透技术获得细胞溶胶提取物。简单地说，用PBS清洗细胞一次，然后用1mL渗透缓冲液（210 mmol/L D-甘露醇、70 mmol/L-蔗糖、10 mmol/L-HEPES[pH7.2]、5 mmol/L_琥珀酸钠、0.2 mmol/L-EGTA、0.15%BSA和10μg/mL洋地黄素）。细胞在冰上培养5分钟，然后收集缓冲液并在13000离心克在4°C下离心10分钟以去除溶酶体和线粒体。所得上清液在100000下进一步离心克在4°C下保持1小时。使用最终上清液（细胞溶质提取物）中的蛋白质进行免疫印迹分析。样品通过12%SDS-PAGE溶解，转移到硝基纤维素膜上，并用适当的一级抗体进行印迹。将膜与过氧化物偶联二级抗体（1:10000稀释，Biosource International，Camarillo，CA）孵育，并使用化学发光底物（ECL，Amersham，IL）和柯达X-OMAT膜（Eastman Kodak，Rochester，NY）可视化结合抗体。主要抗体为抗细胞色素c抗体（1:100稀释，mAb 6H2.B4；BD Biosciences）、抗组织蛋白酶B抗体（1:200稀释，m Ab IM27L；Calbiochem）和山羊抗-β-肌动蛋白（1:2000）
动物研究
这些实验方案得到克利夫兰诊所动物护理和使用委员会的批准。C57BL/6组织蛋白酶B–敲除（ctsb−/−)小鼠和野生型同窝伙伴（ctsb+/+)体重为20至25克，连续16周喂食高碳水化合物饮食随意（由65%蔗糖、20%酪蛋白、5%玉米油、4%矿物质混合物、1%维生素混合物和1%乳清酸组成，Teklad Mills，Madison，WI），从6至8周龄开始（每组15只）。相同的动物组（每组15只）接受标准啮齿动物食物作为对照。每周测量总体重。每组动物在饮食的不同时间点被处死。按照制造商的说明，使用BioVision的FFA定量试剂盒（试剂盒k612-100）测量肝脏FFA含量。通过胞质蛋白的免疫印迹分析来评估线粒体的完整性和肝损伤；肝组织病理学；4-羟基壬醛（HNE，Cayman Chemicals）的免疫组织化学，这是氧化应激的典型脂质过氧化产物；和血清ALT值。
数据分析
除非另有说明，否则所有数据均表示为平均值±SD。通过方差分析比较各组之间的差异，然后进行事后Bonferroni检验，以纠正多重比较。差异被认为具有统计学意义P（P）< 0.05.
结果
游离脂肪酸诱导的剂量依赖性和饱和度依赖性线粒体功能障碍
线粒体功能障碍导致线粒体膜通透性和ROS生成增加，被认为是导致单纯性脂肪肝进展为脂肪性肝炎的中枢异常。23然而，目前关于NAFLD中导致线粒体功能障碍的机制的信息很少。线粒体的通透性表现在外膜水平，允许细胞色素c的释放，以及内膜水平ΔΨ的损失米.24我们假设NAFLD中线粒体功能障碍和随后线粒体ROS的产生是由有毒FFA的积累引起的。为了验证这一假设，最初将C57BL/6小鼠分离的肝细胞在有或无不同浓度的饱和程度的FFA的情况下孵育24小时。然后通过线粒体膜电位的实时成像、细胞色素c释放的生化和形态学分析以及单细胞ROS生成监测来评估线粒体功能。FFA处理导致TMRM荧光显著降低，表明ΔΨ的消散米这取决于剂量和饱和度，其中亚油酸（多不饱和）的效力最低，棕榈酸（饱和）的威力最大(). 以相同的方式培养HepG2和Mc-Ntcp.24细胞也获得了类似的结果（数据未显示）。此外，棕榈酸酯独特地诱导线粒体释放细胞色素c。通过细胞溶质部分的免疫印迹分析评估线粒体细胞色素c的释放()用单克隆抗体进行免疫荧光(). 细胞色素c在对照细胞以及油酸盐或亚油酸盐处理的细胞液中不存在。相反，棕榈酸酯处理的细胞的胞浆中有高丰度的棕榈酸酯(). 类似地，细胞色素c免疫荧光在对照细胞和用油酸或亚油酸处理的细胞中是间断的，这与该蛋白的线粒体定位一致。相反，棕榈酸盐处理导致细胞色素c荧光的扩散模式，表明该蛋白重新分布到胞质溶胶中(). 最后，棕榈酸酯诱导线粒体ROS生成。通过在单细胞水平监测DCF荧光来评估ROS生成(). 与对照组相比，棕榈酸盐而非油酸盐或亚油酸盐导致DCF荧光显著增加。对于其他长链饱和FFA，如硬脂酸盐，也发现了类似的结果（数据未显示）。因此，总的来说，这些数据表明长链饱和FFA诱导线粒体功能障碍，表现为ΔΨ的耗散米细胞色素c释放，ROS生成增加。
游离脂肪酸（FFA）诱导的剂量和饱和度依赖性线粒体功能障碍。将C57BL/6小鼠分离的肝细胞在有或无不同浓度的饱和程度的FFA的情况下培养24小时。（A） 线粒体通透性通过四甲基罗丹明甲酯（TMRM，549/573 nm）染色测定，四甲基罗达明甲酯是一种线粒体选择性染料，在未固定活细胞中线粒体去极化后释放，并在荧光显微镜下观察。（B） 用0.2 mM的各种FFA处理细胞6小时。用洋地黄素选择性渗透制备细胞溶胶组分。细胞溶胶蛋白通过SDS-PAGE凝胶溶解，转移到硝化纤维素中，并探测细胞色素c。β-肌动蛋白作为蛋白质负载的对照。（C） 免疫荧光法进一步研究了细胞色素C的亚细胞定位。细胞固定，并在室温下与抗细胞色素c抗体（1:100稀释）孵育1小时。（D） 最后，使用非荧光细胞发酵剂化合物2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）监测FFA过度积累对肝细胞ROS生成的影响。该技术基于这样的原理，即在被ROS氧化时，该化合物的去酯化形式变成荧光化合物二氯荧光素（DCF）。FFA处理的细胞负载10μM的DCFH-DA（分子探针）在37°C的KRH缓冲液中放置30分钟。使用倒置荧光显微镜在单细胞水平监测荧光化合物DCF。
游离脂肪酸诱导溶酶体通透性下游线粒体功能障碍
我们之前证明，将小鼠原代肝细胞以及HepG2细胞与长链FFA孵育，可使溶酶体快速渗透并将组织蛋白酶B（溶酶体半胱氨酸蛋白酶）释放到胞浆中。21我们假设NAFLD中的线粒体功能障碍和随后的线粒体ROS生成是溶酶体通透性和组织蛋白酶B激活的下游事件。为了验证这一假设，HepG2细胞最初在有或无0.2 mM FFA的情况下培养6小时。溶酶体和线粒体通透性的时间关系通过溶酶体追踪红（577/590 nm）和四甲基罗丹明甲酯（549/573 nm）染色来确定，一种线粒体选择性染料，在未固定活细胞中线粒体去极化后释放，并在荧光显微镜下观察()，以及通过免疫印迹分析胞浆组织蛋白酶B和细胞色素c(). 我们发现TMRM荧光显著降低，表明ΔΨ的耗散米LysoTracker Red标点染色缺失数小时后发生，这种模式与溶酶体通透性一致(). 类似地，组织蛋白酶B易位到胞浆中之前，线粒体释放细胞色素c。在对照细胞的胞浆中，组织酶B和细胞色素c均未被发现。用棕榈酸酯处理后，组织蛋白酶B在1小时左右首次在该组分中被鉴定出来，2小时后显著存在，而细胞色素c在4小时培养后首次被弱鉴定出来，6小时后很容易被检测出来(). 综上所述，这些数据表明FFA在溶酶体分解下游诱导线粒体膜通透性。
FFA诱导溶酶体通透性下游的线粒体去极化和细胞色素c释放以及组织蛋白酶B激活。（A） 用或不用0.2 mM FFA培养细胞6小时。通过在未固定的活细胞中用LysoTracker Red（LTR）和四甲基罗丹明甲酯（TMRM）染色来确定FFAs诱导的溶酶体和线粒体透化的时间过程，并在荧光显微镜下观察。数值表示0小时时的平均荧光百分比。结果表示为每个治疗组和3个独立实验中15到30个细胞的平均值±SE(*P（P）与基线时的荧光相比，<0.05。（B） 用或不用0.2 mM FFA培养细胞6小时。通过对细胞溶质组分的免疫印迹分析，研究组织蛋白酶B和细胞色素c重新分布到细胞质中的时间过程，详见材料和方法一节。
FFA诱导的线粒体功能障碍需要组织蛋白酶B
组织蛋白酶B在介导线粒体功能障碍（导致单纯脂肪变性进展为脂肪性肝炎）中的潜在作用特别引起我们的兴趣。这一假设源于观察到组织蛋白酶B在细胞溶质中释放，以响应FFA在体外组织蛋白酶B在细胞质中的重新分布存在于NAFLD患者的肝组织中。21
为了确定组织蛋白酶B抑制是否可以防止FFA诱导的线粒体毒性，我们使用遗传和药理学方法抑制组织蛋白酶B活性。我们首先评估了在20μ免疫印迹法测定选择性药理组织蛋白酶B抑制剂CA07的M 6小时(). 通过共焦显微镜观察线粒体细胞色素c向细胞质的释放。FFA处理细胞的胞浆中容易检测到细胞色素c的增加。这种再分配几乎完全被与CA074的共同创造所阻止(). 始终，FFA处理导致细胞色素c荧光的扩散模式，表明细胞色素c释放到细胞液中。相反，在与CA074细胞色素c共培养的细胞中，荧光仍然是间断的，其模式与对照细胞相似(). 接下来，在有或无CA074的情况下与FFA孵育后，使用TMRM荧光强度的实时成像测定线粒体跨膜电位(). 事实上，FFA处理导致TMRM荧光显著降低，但与CA074共培养的细胞保持不变(). 通过与第二种选择性组织蛋白酶B抑制剂E-64孵育获得类似结果（数据未显示）。为了确定组织蛋白酶B表达的特异性抑制是否对线粒体功能具有类似的保护作用，我们使用siRNA沉默HepG2细胞中组织蛋白酶B的表达。通过这种方法，我们减少了组织蛋白酶B的表达()以及活动()背景级别。与以前一样，通过监测ΔΨ米和细胞色素c释放。用杂乱siRNA转染的细胞显示出显著的细胞溶质细胞色素c水平和与棕榈酸酯处理后线粒体通透性一致的弥漫荧光模式(). 转染组织蛋白酶B siRNA的细胞未显示细胞溶质细胞色素c，尽管用棕榈酸酯处理，但仍主要显示间断性细胞色素c荧光，表明这种操作阻止了线粒体的通透性(). 总的来说，这些数据强烈表明FFA以组织蛋白酶B依赖的方式诱导线粒体膜通透性和细胞色素c的释放。
组织蛋白酶B抑制可减少FFA诱导的细胞色素c释放。在组织蛋白酶B选择性抑制剂（CA074；20）存在或不存在的情况下，用0.2 mM FFA处理HepG2细胞μM） 持续6小时。星孢霉素（STS；3μM） 作为阳性对照。（A） 用洋地黄素选择性渗透制备细胞溶胶组分。细胞溶胶蛋白通过SDS-PAGE凝胶溶解，转移到硝化纤维素中，并探测细胞色素c。β-肌动蛋白作为蛋白质负载的对照。（B） 免疫荧光法进一步研究了细胞色素c的亚细胞定位。细胞固定，并在室温下与抗细胞色素c抗体（1:100稀释）孵育1小时。
FFA以组织蛋白酶B依赖性的方式诱导线粒体膜电位损失。在组织蛋白酶B选择性抑制剂（CA074）存在或不存在的情况下，用或不使用FFA培养细胞6小时。星孢霉素（STS；3μM） 作为阳性对照。（A） 如前所述，通过TMRM荧光实时成像测量线粒体跨膜电位。（B） 数值表示在控制条件下以荧光百分比表示的平均荧光。结果表示为每个治疗组和3个独立实验中15到30个细胞的平均±SE。
组织蛋白酶B siRNA有效抑制HepG2细胞中的组织蛋白酶B。HepG2细胞中组织蛋白酶B的表达被siRNA沉默，详见材料和方法一节。用组织蛋白酶B siRNA转染HepG2细胞后，（A）对Bax和β-进行肌动蛋白测定，并使用组织蛋白酶B活性测定测定组织蛋白酶B活性，详见材料和方法部分(*P（P）<与对照组比较0.01；组织蛋白酶B；Scr.、。，争夺；小干扰RNA。
组织蛋白酶B的遗传抑制保护线粒体功能。用组织蛋白酶B或干扰siRNA转染48小时后，用棕榈酸酯处理细胞6小时。（A） 用洋地黄素选择性渗透制备细胞溶胶组分。细胞溶胶蛋白通过SDS-PAGE凝胶溶解，转移到硝化纤维素中，并探测细胞色素c。β-肌动蛋白作为蛋白质负载的对照。（B） 用免疫荧光法研究细胞色素c的亚细胞定位。细胞固定，并在室温下与抗细胞色素c抗体（1:100稀释）孵育1小时。
组织蛋白酶B的灭活保护线粒体并预防体内肝损伤
为了研究组织蛋白酶B在饮食相关脂肪肝中的体内作用，我们使用ctsb−/−老鼠。Ctsb公司−/−小鼠及其野生型对照（ctsb+/+)接受高碳水化合物饮食16周。在这种饮食中，两种ctsb−/−和ctsb+/+与喂食标准啮齿动物饮食的对照组小鼠相比，这些小鼠出现了明显的肥胖。高碳水化合物饮食的野生型小鼠表现出明显的脂肪变性()肝脏FFA含量显著增加(). 这些变化与线粒体功能障碍有关，细胞色素c在胞浆中的重新分布证明了这一点()4-HNE含量增加，这是氧化应激的标志()以及肝脏损伤，如血清ALT水平升高所示()相对于ctsb+/+控制饮食。相反，ctsb−/−与ctsb和ctsb相比，高碳水化合物饮食的小鼠仅表现出轻微的脂肪变性，FFA含量和4-HNE表达没有增加，血清ALT值正常−/−和ctsb+/+对照饮食中的小鼠().
Ctsb公司−/−动物受到保护，免受饮食诱导的线粒体功能障碍和肝损伤。组织蛋白酶B–敲除（ctsb−/−)小鼠及其野生型对照（ctsb+/+)接受高碳水化合物饮食16周。（A） H&E染色的代表性显微照片。（B） 4组小鼠肝脏FFA含量。（C） 细胞溶质细胞色素C的免疫印迹(β-肌动蛋白起到控制蛋白质负荷的作用）。（D） 肝切片中氧化应激的代表性脂质过氧化产物4-羟基壬醛（4-HNE）的免疫组织化学研究−/−和ctsb+/+控制饮食或高碳水化合物饮食的动物。（E） 4组小鼠的血清ALT水平。
讨论
本研究的主要发现与肝细胞脂质超载、线粒体功能障碍和肝损伤相关的机制有关。结果表明：（1）暴露于饱和长链FFA的人和小鼠肝细胞表现出线粒体功能障碍和溶酶体通透性下游的ROS生成；（2） 组织蛋白酶B（一种溶酶体半胱氨酸蛋白酶）的抑制或缺失可防止游离脂肪酸诱导的线粒体功能障碍和氧化应激在体外; 组织蛋白酶B失活可减轻NAFLD饮食小鼠模型中的氧化应激和肝损伤。这些结果强烈支持溶酶体-线粒体轴在NAFLD肝损伤和疾病进展中的中心作用。
肥胖和2型糖尿病在西方世界的大部分地区已经达到流行的程度。这两种情况都与非酒精性脂肪肝密切相关。25NAFLD的临床病理学表现类似于酒精诱导的肝损伤，但发生在饮酒很少或不饮酒的人群中。5非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是NAFLD的一个阶段，其特征是脂肪在肝脏中积聚（脂肪变性），伴有肝细胞损伤和炎症的迹象。三NASH是一种潜在的严重疾病，大约10%至25%的NASH患者可能发展为肝硬化及其门脉高压、肝衰竭和肝细胞癌等严重并发症。4NAFLD的临床意义来自于它在成人和儿童中的常见发生及其发展为肝硬化和肝衰竭的可能性。
几项证据表明，线粒体功能受损是导致从单纯性脂肪变性发展为脂肪性肝炎的中心异常。26对NAFLD实验模型以及NAFLD患者的研究表明，肝细胞存在线粒体结构和功能异常。14,15结构异常包括线粒体增大和结晶内含物发育，而功能性线粒体异常的特征是活性氧生成增加、脂质过氧化物积聚和细胞色素c释放到细胞质中。然而，导致这种线粒体功能障碍的分子机制尚不清楚。肝脏中脂质的净积累是NAFLD发生的先决条件。27虽然脂质主要以甘油三酯的形式积聚，但脂肪变性可能导致其他脂质过量，如各种游离脂肪酸和胆固醇。11,28某些FFA具有潜在的细胞毒性，并且在体外对包括肝细胞在内的不同细胞系的研究表明，细胞FFA水平的增加是细胞凋亡死亡的触发因素。12,29,30我们目前的数据表明，人和小鼠肝细胞与FFA孵育会导致剂量和饱和度依赖的线粒体功能障碍。饱和FFA棕榈酸酯的浓度与代谢综合征患者循环中的FFA水平相似31诱导显著的线粒体膜透化并增加ROS的产生。我们以前报道过组织蛋白酶B，一种主要的溶酶体半胱氨酸蛋白酶，在细胞溶质中被释放以响应FFA在体外21组织蛋白酶B在细胞质中的重新分布存在于NAFLD患者的肝组织中。21我们目前的数据证明，在FFA治疗肝细胞期间，溶酶体通透性和组织蛋白酶B释放到胞浆中是线粒体去极化和细胞色素c重新分配到胞浆之前数小时发生的早期事件，从而扩展了这些观察结果。更重要的是，通过siRNA沉默组织蛋白酶B或通过2种选择性药物抑制剂进行化学抑制可显著预防FFA诱导的线粒体功能障碍，证明组织蛋白酶B对FFA诱导线粒体功能障碍至关重要。支持这些结果的是体内研究表明组织蛋白酶B基因敲除小鼠可以抵抗饮食诱导的线粒体功能障碍、氧化应激增加和肝脏损伤。综上所述，这些数据强烈表明溶酶体-线粒体轴在NAFLD进展中起着中心作用。
总之，目前的研究进一步阐明了NAFLD线粒体功能障碍的亚细胞机制。结果支持一种模型，即FFA诱导溶酶体分解，导致组织蛋白酶B激活，然后触发线粒体功能障碍并增加ROS生成。以组织蛋白酶B为靶点似乎是预防FFA线粒体通透性和肝细胞脂质毒性的可行策略。
致谢
由美国国立卫生研究院（拨款DK076852）和AGA研究学者奖（授予A.E.F.）支持。
缩写
- ctsb公司
- 组织蛋白酶B
- 金融流量账户
- 游离脂肪酸
- NAFLD公司
- 非酒精性脂肪肝
- 美国国立卫生研究院
- 非酒精性脂肪性肝炎
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