多发性硬化脑室下区的激活：早期胶质祖细胞的证据

摘要

多发性硬化（MS）是年轻人最常见的慢性神经系统疾病，其特征是多灶性炎性脱髓鞘。免疫介导的事件被认为会导致髓鞘丢失和少突胶质细胞死亡，从而导致轴突损伤(1). 脱髓鞘斑块可以被重髓鞘化，但这种重髓鞘不足以克服疾病进展(2,三). 许多研究已经确定了成熟和未成熟的少突胶质细胞(4——6)和少突胶质前体细胞(5,7,8)在一些慢性MS病变中。然而，这些细胞大多处于静止状态，其来源尚不清楚。

侧脑室室下区（SVZ）是成人大脑最大的发芽区域之一，其特征是啮齿动物中存在持续增殖的多潜能细胞(9——11)，非人灵长类动物(12,13)、和人类(14). 重要的是，啮齿动物SVZ能够产生能够远距离迁移的未成熟细胞(15). 在神经元疾病（如癫痫发作、缺血或创伤）的啮齿动物模型中，SVZ扩大，神经前体被损伤激活，在那里分化为神经元或星形胶质细胞(16). 然而，在毒素诱导脱髓鞘和炎性脱髓鞘的啮齿动物模型中，SVZ细胞被病变征集，并在那里分化为胶质细胞，尤其是少突胶质细胞(17——20)。

SVZ存在于成人人脑中，并含有表达与啮齿类动物相同标记物的细胞，如神经细胞粘附分子（PSA-NCAM）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、巢蛋白和表皮生长因子受体的多唾液酸形式(21,22). 成人SVZ细胞保持自我更新和生成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力在体外(23,24). 尽管有这些相似之处，但成年人类SVZ的细胞组织与啮齿动物不同。它只由GFAP的一条带组成⁺假定的干细胞通过一个亚细胞间隙与室管膜分离，并且缺乏链状成神经细胞(14,25). 最近，一些研究小组证明，成人SVZ是对神经系统疾病作出反应的主要改变部位。亨廷顿病患者SVZ的增殖和神经发生增加(26)，阿尔茨海默病(27)和癫痫(28)但由于多巴胺缺乏，帕金森病患者的SVZ降低(29). 然而，在这种结构中从未显示出少突发生。

因为在多发性硬化症中，脑室周围白质常常是严重炎症和不完全髓鞘化的部位(30)，我们在死后MS大脑中研究SVZ是否发生改变，是否可能是新生成的用于髓磷脂修复的胶质祖细胞的来源。

结果

MS中SVZ的细胞组织。

为了研究人类SVZ在MS反应中重新激活的能力，我们将MS SVZ与非神经性对照组进行了比较。因为人类SVZ在大小和组成上是异质的(21,25)，我们的研究局限于SVZ的中央体，面对尾状核，包括纹状体静脉(图1 A–C). 只有5名无神经系统疾病的对照组和17例MS患者中的7例发现了这个精确位置。我们首先研究了室管膜细胞层和GFAP之间缝隙的细胞组织⁺保存干细胞带(14). Hoechst标记证实所有对照组均存在室管膜-干细胞间隙(图1D类). 在MS组织中，干细胞带和间隙始终由Hoechst标记的细胞核填充(图1E类)细胞密度是对照组的2.5倍(图1H（H）). 因此，我们研究了与对照组相比，MS大脑中SVZ细胞的增殖是否增加。增殖细胞核抗原（PCNA），标记G中的细胞核₁和S相(25)与对照组相比，MS SVZ中的细胞增殖增加了3倍(图1 F类,G公司、和我)。

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图1。

MS患者SVZ中细胞密度和增殖增加。(A类)冠状人脑切片显示分析的SVZ位置。侧脑室的SVZ是在尾状核的水平上进行研究的。SVZ的中央主体（红色框）如所示插入. (B类和C类)更高放大率的装箱区域A类用于控制(B类)和MS大脑(C类). 箭头表示纹状体静脉。通过内囊中的Luxol坚牢蓝色染色确定病变（星号）C类. (D类和E类)对照组和MS脑切片用核染料Hoechst 33342进行复染。SVZ厚度由双箭头指示。(F类和G公司)对照组和MS脑切片，通过外侧SVZ，染色PCNA（箭头）。(H（H）和我)对照组和MS SVZ中细胞密度、增殖和Sox9表达的评估。(H（H）)赫斯特百分比⁺在装箱区域测量的面积，如D类和E类. (我和J型)PCNA百分比⁺和Sox9⁺对照细胞和MS SVZ（双箭头）。*，P（P）< 0.001; ∗∗,P（P）< 0.01. 镉，尾状核；Put，壳核；LV，侧脑室；帽，内囊；CC，胼胝体；Ep，室管膜。（比例尺：B类和C类，2毫米；D类和E类，90微米；F类和G公司，45微米）

我们用特定标记物进行免疫组化，以确定扩大的人群。GFAP的表达(图2 A–C)和PSA-NCAM(图2 D–F)MS的SVZ与对照组相比显著增加。MS SVZ的共焦三维重建显示，增大的GFAP⁺人口和进程与PSA-NCAM层交替⁺细胞，表明GFAP⁺包含PSA-NCAM的单元格⁺单元格[支持信息（SI）图6]. 在对照组或MS SVZ中未观察到链迁移。然而，在MS大脑中，GFAP⁺或PSA-NCAM⁺发现具有单极或双极形态的祖细胞定向在与侧心室壁相切或垂直的平面上，表明它们沿着或远离SVZ迁移(图2 C类和F类). 我们通过使用抗转录因子（如Sox9、Sox10和Olig2）的抗体进一步表征了扩大的SVZ群体，这些转录因子参与少突发生(31——34). 对照SVZ中存在罕见的Sox9表达细胞。与对照组相比，MS患者的数量增加了3倍(图1J型)大多数细胞同时表达GFAP(图2 G公司和H（H）)或PSA-NCAM(图2我). Sox10型⁺和Olig2⁺在SVZ中也发现了细胞。尽管这些细胞很少同时表达PSA-NCAM(图2 J型和K（K）)，他们大多数被标记为NG2(图2 L（左）和M（M）). 因为Olig2也参与神经发生(32,34)，我们研究了这些细胞表达成神经细胞标记物β3-微管蛋白的可能性(35). 尽管β3-微管蛋白很少⁺在对照组中检测到细胞(25)很少检测到Olig2和β3-微管蛋白的共标记（数据未显示）。由于可比较的SVZ病例数量有限，关于Sox10的潜在波动的明确结论⁺或Olig2⁺无法联系MS和对照之间的祖细胞。

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图2。

MS中SVZ的细胞变化(A类和B类)GFAP在MS SVZ中的表达高度增加(B类)与控制相比，差距被GFAP过程填补(A类). (C类)GFAP检测⁺MS SVZ中具有双极形态的细胞(插入). (D类和E类)只有少数PSA-NCAM⁺控制SVZ中存在神经元过程(D类)，而多轮PSA-NCAM⁺在MS SVZ间隙中观察到祖细胞(E类). (F类)PSA-NCAM公司⁺具有单极形态的细胞（箭头所示）离开SVZ。(G公司和H（H）)对照组中Sox9和GFAP的表达(G公司)和MS SVZ(H（H）). (我)PSA-NCAM中Sox 9的色谱化⁺MS SVZ中的祖细胞。(J型和K（K）)少量PSA-NCAM⁺祖细胞（箭头）表达Sox10(J型)和MS SVZ(K（K）). (L（左）和M（M）)在对照间隙中检测共表达Olig2和NG2的细胞(L（左）)和MS SVZ(M（M）). 侧脑室位于每张图像的左侧。A–F用Hoechst 33342复染。（比例尺：A–E和G–M公司，45微米；F类，10微米；C嵌入，20微米；K英寸，12微米）

MS病变中表达PSA-NCAM的细胞的检测。

啮齿动物中，PSA-NCAM⁺SVZ和RMS的祖细胞可以被附近的脱髓鞘病变招募(19). 因此，我们探讨了MS病变中是否存在此类祖细胞。肉眼识别病变，并使用抗髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）进行确认(图3 A类和B类)或抗髓磷脂碱性蛋白抗体。因为已知PSA-NCAM在CNS损伤后由反应性星形胶质细胞表达(19,36)，我们对PSA-NCAM和GFAP进行了免疫标记。鉴定出两种表达PSA-NCAM的细胞。主要的PSA-NCAM⁺人口呈恒星形状，共压GFAP(图3C类)广泛分布于MS和正常白质（NAWM）。这些细胞被认为是反应性星形胶质细胞，并被排除在进一步分析之外。第二个群体呈圆形，一般不表达GFAP(图3D类和4E类)主要定位于MS病灶和斑块周围白质。根据它们的形状，我们认为它们是PSA-NCAM⁺祖先。接下来，我们评估了PSA-NCAM的密度⁺根据病变活动情况，使祖细胞圆形。量化显示PSA-NCAM⁺前体细胞的活性显著增加（26.99±9.63个/mm）²)和慢性活动（27.33±7.08个细胞/mm²)病变与慢性无症状病变的比较（2.09±2.09个/mm细胞²)阴影斑块（3.35±1.82个细胞/mm²)或NAWM（每毫米4.05±1.16个单元格²) (图3E类). 我们还分析了PSA-NCAM数量之间的相关性⁺活动性和慢性活动性病变中的祖细胞及其与SVZ的接近程度。PSA-NCAM的数量⁺SVZ近端病变中的祖细胞高于SVZ中端（纹状体）或远端（皮质，两个街区外）病变，平均密度为每毫米30个细胞²在SVZ附近的病变中，每毫米22个细胞²纹状体病变，每毫米13个细胞²在皮质病变中(图3F类)。

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图3。

PSA-NCAM的识别⁺MS病变中的祖细胞。(A类)在MS脑薄片中，可以宏观检测到脑室周围（红色箭头）和非脑室旁（黑色箭头）病变以及侧脑室（虚线）。(B类)通过抗MOG免疫标记鉴定病变。(C类和D类)PSA-NCAM的检测⁺病灶中的细胞。(C类)PSA-NCAM公司⁺恒星形状的细胞表达GFAP。箭头表示插入. (D类)第二批PSA-NCAM⁺细胞呈圆形，主要为GFAP⁻（箭头），GFAP很少⁺（箭头）。(E类和F类)PSA-NCAM的量化⁺MS病变中的祖细胞。与NAWM相比，活动性和慢性活动性病变的密度显著增加(E类; ∗,P（P）< 0.05; ∗∗,P（P）<0.01），与皮质病变相比，位于脑室附近的病变(F类; ∗,P（P）< 0.05).D类用Hoechst 33342复染。A、 活性；CA，慢性活动；CS，慢性沉默；SP，阴影斑块；Cx，皮层；St，纹状体。（比例尺：B类170微米；C类和D类，45微米；插图，20微米）

PSA-NCAM的塑性⁺祖细胞及其在成年神经发生区的优先位置使我们对PSA-NCAM和早期神经元和少突胶质细胞标记物进行了共免疫标记(n个=12）和慢性活动(n个=13）病灶(图4 A–D). 尽管一些轴突芽状结构同时表达PSA-NCAM和β3-微管蛋白(37)大多数PSA-NCAM⁺未对祖细胞进行β3-微管蛋白染色(图4A类). 由于活动性病变（在较小程度上）包含大量巨噬细胞，我们排除了这些PSA-NCAM的可能性⁺CD68免疫标记细胞为巨噬细胞(图4B类). 为了研究它们的胶质细胞特性，我们接下来分析了PSA-NCAM与Sox9、Sox10、Olig2和NG2的共表达。PSA-NCAM公司⁺祖细胞没有Sox9染色，但很少表达Sox10(图4C类)或Olig2(图4D类). 枝状NG2⁺这些病灶中也有没有PSA-NCAM染色的细胞（数据未显示）。PSA-NCAM公司⁺祖细胞通常表现为紧密并置的对偶(图4E类). 因此，我们用抗Ki67抗体评估了它们的增殖潜力。大多数Ki67⁺细胞定位于NAWH。在病变中，Ki67⁺细胞主要是位于血管周围间隙的免疫细胞，很少是实质性PSA-NCAM⁺祖先(图4F类). 这些观察结果表明，一些PSA-NCAM⁺在活动性和慢性活动性病变中，祖细胞保留增殖和生成新的少突胶质前体细胞和星形胶质细胞的能力。

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图4。

PSA-NCAM的特性⁺MS病变中的圆形祖细胞。(A类和B类)PSA-NCAM公司⁺祖细胞（箭头）不表达神经元标记物β3-微管蛋白(A类)或巨噬细胞标志物CD68(B类)多发性硬化病变。(C类和D类)少量PSA-NCAM⁺Sox10的祖细胞（箭头）染色(C类)和Olig2(D类). 通过MOG免疫标记（蓝色C类). (E类)可能划分PSA-NCAM的两倍⁺细胞。(F类)Ki67号机组⁺GFAP和PSA-NCAM的祖细胞（箭头）双重染色(插入)。A类,B类、和E类用Hoechst 33342复盖。（比例尺：A类,B类、和F类，45微米；C类和D类，22微米；E类，6微米；D嵌入，10微米；F插入，20微米）

讨论

在本研究中，我们提供了MS中SVZ激活的证据，导致产生PSA-NCAM⁺室管膜干细胞区的祖细胞。在脑室周围MS病变中也发现早期祖细胞。PSA-NCAM对早期标志物如Sox9、Sox10和Olig2的表达⁺祖先揭示了他们对胶质细胞而非神经元命运的承诺。PSA-NCAM的患病率⁺SVZ附近病变中的祖细胞以及双极型祖细胞的检测表明，其中一些祖细胞迁移到邻近病变中，可能是之前描述的少突胶质细胞祖细胞的来源之一(6,38) (图5)。

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图5。

提出的模型说明了MS中SVZ的激活。控制SVZ由GFAP带组成⁺星形胶质细胞通过一个亚细胞间隙从室管膜壁上分离出来，含有少量早期祖细胞。在MS SVZ中，GFAP的密度⁺星形胶质细胞和早期祖细胞增多。这些祖细胞在室管膜下区域表达早期胶质标记物，如Sox9、Sox10和Olig2。类似的祖细胞在脑室周围病变中占优势。PSA-NCAM的存在⁺具有双极形态的祖细胞表明它们可能在SVZ内或远离SVZ。这些数据表明SVZ衍生的早期祖细胞动员到脑室周围病变，在那里它们可能有助于少突胶质细胞的更新。

我们的数据显示，与对照组相比，MS组的细胞密度和增殖增加，SVZ明显扩张。这一发现与啮齿动物和非人类灵长类动物的缺血、癫痫或脱髓鞘的实验模型相似，表明SVZ扩张和细胞增殖增加之间存在强烈的相关性(39——42). 在实验性变态反应性脑脊髓炎（EAE）小鼠（MS模型）中也发现SVZ的增殖增强(19). 尽管EAE小鼠的平均疾病持续时间为18天，但MS小鼠的平均病程为30年，因此，当报告每个物种的平均寿命时，其病程比EAE小鼠长10倍。这些观察结果表明，长期暴露于重复性炎症损伤并没有完全耗尽SVZ的增殖潜能，并将大多数祖细胞维持在未成熟阶段。尽管患者年龄（43岁）和病程也可能影响SVZ的增殖，但MS患者的有限年龄和疾病类型差异不允许我们建立这种相关性。

成人SVZ由GFAP组成⁺干细胞、室管膜细胞和罕见的PSA-NCAM⁺单元格(25). 在MS SVZ中，大多数PSA-NCAM⁺祖细胞表达Sox9，这是一种参与神经干细胞从神经发生向胶质生成转变的转录因子(31). 圆形和Sox9的表达表明PSA-NCAM⁺祖先处于非常不成熟的阶段。啮齿动物SVZ中Olig2表达定义的瞬时扩增细胞的存在(43)到目前为止，还没有在人类身上进行过描述。我们展示了少数Olig2⁺/天然气2⁺细胞存在于对照组和MS SVZ的间隙中。鉴于它们的位置和缺乏神经元标记物的表达，这些细胞可能代表短暂的扩增群体。然而，一些细胞同时表达Olig2和Sox10，表明它们属于少突胶质细胞系。

MS和动物模型中激活SVZ的信号的性质和作用方式尚不清楚。SVZ扩张似乎是以炎症为特征的疾病的常见现象(26——28). 然而，特定细胞类型的发生表明存在疾病特异性信号事件（即多发性硬化症的脱髓鞘）。最近的数据表明，脑脊液流动在定向迁移中起着关键作用(44)SVZ前体在啮齿动物中的扩散(45). 因为多发性硬化症的脑脊液是许多分子和细胞修饰的位点(46)室管膜和GFAP⁺细胞紧密相连(14,25,47)很容易推测，每种细胞类型都通过从各自的环境中检索信息来促进SVZ的重新激活。

PSA-NCAM公司⁺在MS病变中也检测到祖细胞，在活动性和慢性活动性病变中普遍存在。在靠近SVZ的病变中，它们的数量高于较远的病变。此外，发现具有双极剖面的细胞亚群位于心室壁的径向或切向平面。虽然从未观察到链迁移，但这些观察表明PSA-NCAM⁺侧脑室附近MS病变的祖细胞可能来自SVZ，就像啮齿动物一样(19). 然而，白质中存在内源性祖细胞群体(48——50)不应排除在疾病早期激活的，因为PSA-NCAM⁺在远离SVZ的病变中也发现了祖细胞。

本研究确定了在SVZ和活动性和慢性活动性MS病变中表达PSA-NCAM的早期祖细胞群体。虽然这些细胞不能阻止疾病的长期发展，但它们确实代表了非常有趣的治疗靶点，可以潜在地刺激内源性髓鞘修复。

材料和方法

补充材料

致谢

缩写

脚注

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