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癌细胞。作者手稿；PMC 2011年1月21日发布。
以最终编辑形式发布为：
癌细胞。2005年8月；8(2): 119–130.
数字对象标识：2016年10月10日/j.ccr.2005.07.004
预防性维修识别码：项目经理3024718
NIHMSID公司：美国国家卫生研究院263629
PMID：16098465

p53抑癌基因早期失活与NF1缺失联合诱导恶性星形细胞瘤

袁朱,1,5 弗兰茨·吉纳尔,1 赵大文,2 李柳,5 丹尼斯·K·伯恩斯,三 拉尔夫·梅森,2 阿尔比·梅辛,4和路易斯·帕拉达1,*
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

总结

恶性星形细胞瘤是最常见的原发性脑肿瘤，对所有已知的治疗方法都有抵抗力，并且经常存在使p53失活和激活Ras信号的突变。我们已经产生了缺乏p53的小鼠菌株，并含有负调节Ras信号的NF1肿瘤抑制因子的条件等位基因。小鼠发生恶性星形细胞瘤，外显率完全。大多数肿瘤表现出多形性胶质母细胞瘤的特征，同时伴随着先前在这种肿瘤的人类对应物中描述的信号通路的改变。我们发现，肿瘤抑制因子失活的顺序影响致瘤性，并且肿瘤形成的最早证据定位于大脑中包含多能干细胞群的区域，这些细胞群能够在体内分化为神经元和胶质细胞。

介绍

星形细胞瘤主要由星形细胞样细胞组成，是中枢神经系统（CNS）中最常见的肿瘤(Kleihues和Cavenee，2000年). 根据世界卫生组织（WHO）分级系统，II–IV级星形细胞瘤（统称为恶性星形细胞瘤）在生物学上是恶性的，并且广泛浸润大脑。IV级星形细胞瘤，或称多形性胶质母细胞瘤（GBM），是最具侵袭性的人类癌症之一，中位生存期不到1年。不幸的是，尽管神经外科、放射治疗和化疗取得了进展，但这种预后在过去二十年中没有显著改变(荷兰，2001年；Maher等人，2001年；朱和帕拉达，2002年).

GBM有两种亚型。原发性GBM快速出现或从头出现，没有任何临床疾病的证据，而继发性GBMs是由潜伏期为5-10年的原发性低度病变引起的(Kleihues和Cavenee，2000年；Maher等人，2001年). 人类遗传学研究表明，低度星形细胞瘤的两个常见分子特征是p53缺失和血小板衍生生长因子（PDGF）及其受体酪氨酸激酶（RTK）、PDGFR的高表达(Guha等人，1995年；Hermanson等人，1992年；Nister等人，1988年). 这些观察结果表明，这些通路可能参与星形细胞瘤的发生。1型神经纤维瘤病（NF1）患者易患脑恶性星形细胞瘤，终生发病率增加5倍以上(Rasmussen等人，2001年). NF1肿瘤抑制产物神经纤维蛋白是一种功能性Ras GTPase激活蛋白（GAP）(奇乔夫斯基和杰克斯，2001年；朱和帕拉达，2001年). 因此，神经纤维蛋白的丢失导致Ras的异常激活，Ras是RTK信号的主要介质。

同一染色体上同时携带p53和NF1种系无效突变的杂合小鼠（称为cisNF1/p53小鼠）会发展为中低粒度星形细胞瘤，外显率高达75%，具体取决于遗传背景(Reilly等人，2000年,2004). 我们推断，NF1患者星形细胞瘤发病率的增加可能表明通过PDGFR激活对散发性星形细胞瘤Ras信号的需求一致。为了进一步了解星形细胞瘤诱导中p53失活和Ras通路激活的靶细胞，我们结合了种系p53突变(Jacks等人，1994年)神经特异性NF1突变(Zhu等人，2001年). 由此产生的小鼠发展为100%外显率的恶性星形细胞瘤，并为成年大脑脑室下区（SVZ）的细胞原性和NF1失活之前或伴随失活的p53缺失提供了证据。恶性星形细胞瘤发生和发展的精确小鼠模型的可用性将允许对这种不可治愈肿瘤的发病机制和新的治疗靶点进行详细研究。

重要性

最近的研究表明，包括多形性胶质母细胞瘤在内的脑肿瘤包含一个癌细胞亚群，这些癌细胞具有干细胞特征，包括自我更新和多潜能，并负责体内肿瘤的生长。这些脑癌干细胞是否来源于正常神经干细胞的肿瘤转化尚待确定。通过对恶性星形细胞瘤完全外显小鼠模型的分析，我们证明所有级别的星形细胞瘤细胞都显示出干细胞特征，早期症状前病变位于侧脑室室下区（SVZ）内，这是中枢神经系统中含有神经原干细胞的一个区域。这些研究证明SVZ细胞可能是恶性星形细胞瘤的细胞原。

结果

恶性星形细胞瘤小鼠模型

在小鼠中，p53基因失活不能诱导星形细胞瘤。相反，主要的肿瘤是淋巴瘤或肉瘤(Donehower等人，1992年；Jacks等人，1994年). 我们产生了三种复合突变小鼠菌株，其中包含连接的p53和NF1肿瘤抑制基因的突变（Mut1-3；图1). 这一目的的关键是小鼠11号染色体上一个与缺失的p53等位基因相连的固定的NF1等位基因的遗传结构(图1)以及在人类胶质纤维酸性蛋白启动子控制下使用Cre转基因菌株(hGFAP公司-cre）(Malatesta等人，2003年; Zhu等人提交；Zhuo等人，2001年). 虽然GFAP被广泛用作中枢神经系统正常和反应性星形胶质细胞的成熟胶质特异性标记物(Ride等人，1997年)最近的数据表明，人类GFAP启动子在大多数具有神经前体细胞特性的胚胎放射状胶质细胞中也很活跃(Malatesta等人，2000年,2003；Noctor等人，2001年；Zhuo等人，2001年). 确定hGFAP公司-cre转基因表达和活性，我们将该小鼠株与Rosa26-LacZ报告株杂交(索里亚诺，1999年；Zhuo等人，2001年). 在胚胎第10.5天（E10.5）和E12.5天之间，如LacZ表达所示，Cre介导的重组在前脑和后脑的离散神经外胚层区域以及三叉神经节中明显存在（参见补充数据中的图S1A–S1F在线阅读本文）。与以前的报告一致(Malatesta等人，2003年；Zhuo等人，2001年)神经前体细胞早期心室Cre表达的结果是，出生时（P0.5），大多数皮层和海马神经元表达LacZ报告基因(图S1G–S1I). 因此，人GFAP启动子在神经祖细胞中的早期出现导致早期CNS细胞及其子代（包括SVZ中的成年神经干/祖细胞）中的Cre介导的重组(Merkle等人，2004年；Tramontin等人，2003年)神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞(Malatesta等人，2003年；Zhuo等人，2001年).

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Mut1-3小鼠遗传结构示意图

绿色用于标记正常等位基因，包括野生型等位基因（+）和漂浮型等位蛋白（×1）；红色用于标记空等位基因，包括重组floxed等位基因（Δ）和敲除等位基因。括号中显示了每种细胞类型的基因型。

静音1(第53页−/−；NF1型flox/flox公司；hGFAP基因+)小鼠生殖系缺乏p53，中枢神经系统细胞缺乏NF1功能hGFAP公司-cre介导的重组在神经前体细胞和成熟星形胶质细胞发育中的作用(Malatesta等人，2003年；Zhuo等人，2001年). 如Mut1、Mut2(第53页+/−；NF1型flox/flox公司；hGFAP-核心+)小鼠中枢神经系统细胞中缺乏NF1，但p53杂合。静音3(顺式p53+/−；NF1型+/弗洛克斯；hGFAP-核心+)小鼠是中枢神经系统细胞中p53和NF1的复合杂合子(图1). 全部静音1（14/14；图1)小鼠发生GFAP阳性星形细胞瘤，范围为浸润性低度病变（II级；图2A、2D和2G); 高颗粒间变性星形细胞瘤（III级；图2B、2E和2H); GBM（四级；图2C、2F和2I). 由于种系p53基因的缺失，这些小鼠还发展成淋巴瘤和肉瘤，导致早期死亡，这可能解释了GBM发展减少的原因（2/14）(图2J和2K). 所有Mut3小鼠也出现了中枢神经系统肿瘤（58/58；图1和​和2K），2千卡)在允许存活至症状终末期的亚群中，约70%患有GBM（14/21；图2K)显示出人类对应物的所有可辨别特征，包括假栅栏肿瘤细胞的存在(图3A和3B)，坏死(图3C和3D)，微血管增生(图3E和3F)和Scherer的二级结构(图3G–3J). 所有有症状的Mut3小鼠都有间变性星形细胞瘤或GBM，而无症状的Mut 3小鼠要么有低度肿瘤要么没有肿瘤(图2K和图S2). 鉴于肿瘤形成的发生率为100%，这些发现与一种模型最为一致，即肿瘤是以低度病变的形式出现的，随着时间的推移发展为具有GBM特征的高级别肿瘤。

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Mut1小鼠出现全谱恶性星形细胞瘤

Mut1脑的II级、III级和IV级星形细胞瘤切片用苏木精和伊红（H&E）染色(A–C)，一种抗GFAP抗体(D–F型)和一种抗巢蛋白抗体(G–I型). 箭头在A类指向神经元周围的异常肿瘤细胞（神经元周围卫星变性）；中的箭头B和C指向多核巨细胞；和箭头E类和F类表示反应性星形胶质细胞。记者：Mut1、Mut2、Mut3和p53的生存曲线为空(第53页−/−)老鼠。每组突变小鼠使用以下数量的小鼠：Mut1，n=14；Mut2，n=21；Mut3，n=58；第53页−/−，n=20。在Mut1-3小鼠中观察到的非中枢神经系统肿瘤的发病率如下：Mut1，9/14；Mut2，4/21；和Mut3，11/58。克：该图显示了在终末期Mut1小鼠（n=14）、无症状Mut1*小鼠（n=12；6-10周龄）、终末期Mut2小鼠（n=18）、终末Mut3小鼠（n=21）和无症状Mut3*小鼠（n=3；18周龄）中观察到的星形细胞瘤频率和分级。“N”，坏死。比例尺，50µm。

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Mut3大脑中GBM的组织学特征

用H&E对来自Mut3大脑的脑切片进行染色。来自两个独立Mut3脑的GBM的特征是存在多灶假栅栏肿瘤细胞(A和B)，坏死(C和D)，微血管增殖（箭头E类和F类)以及Scherer的二级结构，包括大脑皮层顶下区肿瘤细胞的积聚(G公司)，以神经元周围的肿瘤细胞为特征的神经周卫星病（箭头所示H（H）)血管周围卫星变性的特征是血管周围有肿瘤细胞（如箭头所示J型). 箭头在我显示肿瘤细胞中的有丝分裂图像。比例尺，50µm。

与上述两种基因结构相比，Mut2菌株很少发生中枢神经系统肿瘤(图1和​和2K；2千卡; 见下文）。免疫组织化学分析显示，所有Mut1星形细胞瘤均表达Cre重组酶，表明NF1缺乏(图4A)，而在分子水平上，来自Mut3小鼠的星形细胞瘤表现出p53和NF1基因的失活(图4B和4C). 这些数据表明，p53和NF1的缺失足以在小鼠中引发全谱恶性星形细胞瘤的发生。

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Mut1和Mut3星形细胞瘤中p53和NF1抑癌基因的失活

答：正常大脑皮层切片(Aa和Ab)为III级星形细胞瘤(交流)和GBM(广告)用抗GFAP（绿色）和抗Cre（红色）双标记免疫荧光法对例Mut1脑进行检测。在正常成人大脑中，每个C阳性星形胶质细胞也表达GFAP（箭头所示澳大利亚和抗体)表明人GFAP启动子的特异性。中的插图抗体显示了Cre表达GFAP阳性星形胶质细胞的形态。在星形细胞瘤和GBM中，每个肿瘤细胞都表达Cre重组酶，表明Mut1株中存在NF1缺陷(交流和广告). 值得注意的是，大量肿瘤细胞下调GBM中GFAP的表达(广告). 箭头在交流指肿瘤组织附近表达Cre和GFAP的正常星形胶质细胞。CC，胼胝体；N、 坏死。比例尺，50µm。

B类：从三只独立的Mut3小鼠（#1–#3）的尾部组织、脑肿瘤（BT）和后脑（HB）中分离出的基因组DNA进行基于PCR的分析，以对NF1和p53基因进行基因分型。上图：一项鉴定野生型（WT）和漂浮型（flox）NF1等位基因的PCR分析表明，Mut3小鼠的尾部组织中包含一个野生型NF1等位点和一个漂浮型NF1等位基因；Cre表达组织（例如后脑）保留了野生型NF1等位基因，但由于Cre介导的重组，失去了大部分漂浮的等位基因；脑肿瘤同时失去了野生型和漂浮的NF1等位基因，表明NF1缺乏。中间面板：通过PCR检测，确定漂浮NF1等位基因和重组漂浮等位基因（Δ），证实后脑和脑肿瘤中漂浮NF1的等位基因转化为重组等位基因。值得注意的是，尾部组织中的一个细胞亚群也经历了重组。底部面板：PCR检测p53基因的野生型和无效等位基因（KO），表明Mut3小鼠的尾部组织和后脑是p53基因杂合的，而脑肿瘤失去了野生型p53等位基因。

抄送：星形细胞瘤形成中NF1和p53等位基因缺失示意图B绿色用于标记正常等位基因，包括野生型等位基因（+）和固定等位基因（flox）；红色用于标记空等位基因，包括重组floxed等位基因（Δ）和敲除等位基因。

分子验证

对人类星形细胞瘤肿瘤组织的分析表明，在星形细胞瘤从低级进展到高级的过程中，会出现特定的遗传损伤(荷兰，2001年；Maher等人，2001年；Zhu和Parada，2002年). 这些包括Rb介导途径和PI-3K/AKT/PTEN途径的放松调控。我们用免疫组织化学方法检测了Rb通路的两个成分Cdk4和cyclin D1的表达(图5A–5F; n=5），并发现这些高级别肿瘤具有两种Cdk4的强烈核表达(图5A和5D)和细胞周期蛋白D1蛋白(图5B和5E)而正常CNS细胞没有(图S3). 为了检测Ras通路的状态，用磷酸特异性抗体评估MAP激酶（MAPK）的激活。与NF1功能丧失一致，均为低级(图5G)和高级别星形细胞瘤(图5H和5I)含有高水平激活的MAPK。相反，与人类肿瘤一样，AKT的激活在高级别肿瘤中持续存在（II级，0/5，图5J; 三级，1/5，图5K和5L; 四级，5/5，图5M和5P).

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高级星形细胞瘤和GBM的分子分析

两个III级星形细胞瘤（GIII）的相邻切片用抗Cdk4染色(A和D)，抗细胞周期蛋白D1(B和E)和增殖标记物抗Ki-67，用于识别增殖细胞(C和F). 与Cdk4和cyclin D1表达很少的正常CNS细胞相比，高级别肿瘤表现出Cdk5和cyclin D1的强核染色。低度恶性星形细胞瘤（GII）的邻近切片(G和J)和2例III级星形细胞瘤（GIII）(H和K；I和L)分别用抗磷酸标记（P-erk）和抗磷酸AKT（P-AKT）染色。箭头在G公司和J型指向神经元周围异常的肿瘤细胞；中的箭头L（左）表明P-AKT阳性肿瘤细胞。GBM切片用抗P-AKT（绿色）和抗巢蛋白（红色）双重标记免疫荧光(M和P). “N”，坏死。III级星形细胞瘤切片(N个)和GBM(问)用抗血管内皮生长因子染色。GBM的相邻切片用抗P-ERK染色(O（运行）)和抗P-AKT(R（右）). 比例尺，50µm。

人类星形细胞瘤的另外两个值得注意的分子特征出现在这些小鼠中。VEGF在低度恶性肿瘤向GBM转化过程中的表达增加(图5N和5Q). 此外，尽管在形态学上相似，但高级别肿瘤在分子上是异质的，MAPK的区域性下调证明了这一点(图5O)肿瘤内始终保持激活的AKT(图5R). 这些数据与星形细胞瘤启动过程中p53缺失和Ras-MAPK激活的因果关系一致，随后Rb介导通路和PI-3K/AKT/PTEN通路被解除调控，进而发展为GBM。这些结果提供了实验证据，证明我们的肿瘤模型在病理和分子水平上都类似于人类恶性星形细胞瘤。

肿瘤起源部位和干细胞特征

星形细胞瘤的原细胞是一个研究较多但尚未解决的问题。虽然越来越多的证据表明人类星形细胞瘤细胞类似于神经干/祖细胞(Hemmati等人，2003年；Ignatova等人，2002年；Singh等人，2003年)，现有证据也支持一种模型，该模型引发了星形胶质细胞的初始脱分化，随后发生恶性转化(Bachoo等人，2002年). 与癌症干细胞模型一致(Hemmati等人，2003年；Ignatova等人，2002年；Singh等人，2003年,2004)，所有级别的星形细胞瘤（Mut1，n=14；Mut3，n=21）表达神经干细胞的标记物，巢蛋白(图2G–2I；图S2E和S2F). 在成人大脑中，有两个区域被确定为多能干细胞的主要来源(量规，2000). 一个是侧脑室的SVZ，另一个是海马齿状回的颗粒下层（SGL）(Alvarez-Buylla等人，2001年；量规，2000). 终末期Mut1和Mut3大脑的组织学分析表明，与人类恶性星形细胞瘤一样，高级别星形细胞瘤散布在整个大脑中(图S4A)和磁共振成像（MRI）提供了人类恶性星形细胞瘤的影像学特征(图S4B). 为了研究肿瘤起源是分散的还是局限于特定区域，我们对7只8周龄无症状Mut1小鼠进行了为期3周的队列研究（最后一张图片是在小鼠11周龄时拍摄的）。其中五只小鼠出现了可检测的肿瘤生长(图6)总是与SVZ相关的前脑产生(图6A–6C). 然而，MRI扫描几乎无法检测到的肿瘤病变(图6D和6E以及图6G和6H)它们的体积很大，无法明确识别肿瘤起源的特定部位(图6F和6I)尽管这些肿瘤也与SVZ相关(图6I，插图）。因此，我们接下来检查了一组6至10周龄早期的12只无症状Mut1小鼠。7只突变小鼠的每个大脑出现一到两个早期损伤。在这7只突变小鼠中，有5只显示出与SVZ直接相关的病变(图7)，另外两名患者的海马和丘脑分别受损，但SVZ内均含有异常细胞（数据未显示）。正常情况下，成人神经干细胞在SVZ中组织严密(图7A、7D和7G). 相反，早期肿瘤细胞具有高度浸润性。早期肿瘤表现为白质浸润(图7B、7E和7H)穿透白质和灰质(图7C、7F和7I). 与正常神经干细胞相似(图7D和7G，箭头）(Doetsch等人，1999年)，早期肿瘤细胞也表达nestin和GFAP(图7E和7F)并激增(图7H和7I). 这些早期肿瘤细胞在形态上与nestin/GFAP双阳性反应性星形胶质细胞不同(图7F（插图）在高级别肿瘤中发现。大多数Ki-67阳性细胞表达巢蛋白(图7H和7I; 95% ± 2%; n=96）。这些观察结果与SVZ细胞最易受p53/NF1介导的星形细胞瘤形成的影响以及早期肿瘤细胞与正常神经干细胞具有表型特征的解释最为一致。

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MRI扫描星形细胞瘤的体内生长模式

一组无症状Mut1小鼠在3周内每周接受一次MRI扫描。在第1周（Wk1）通过MRI扫描三只Mut1小鼠的典型T2加权图像(A和D)，第2周(G公司)，和第3周（Wk3）(B、 E和H). MRI检查后，对小鼠进行组织学分析。MRI图像的相似水平切片(B、 E和H)H&E染色(C、 F和I). 在最初几周的扫描图像中没有发现明显的病变(A、 D和G). 在第3周的图像中发现了从强到中到弱的高强度T2信号(B、 E和H). 箭头指向肿瘤，箭头指示SVZ。中的虚线C,F类、和我标记肿瘤边缘。中的插图我显示与SVZ相关的异常肿瘤细胞。左心室，侧脑室。

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星形细胞瘤局限于侧脑室室下区

用H&E对一个对照组和两个突变大脑SVZ的相邻切片进行染色(A–C)抗巢蛋白（红色）/抗GFAP（绿色）免疫荧光(D–F型)和抗巢蛋白（红色）/抗Ki-67（绿色）(G–I型). 值得注意的是，变异的大脑有与SVZ相关的新生肿瘤。肿瘤边缘用虚线标记(B和C). 中的插图F类（箭头）显示nestin/GFAP双阳性反应性星形胶质细胞我（箭头）显示正在进行有丝分裂的巢蛋白/Ki-67双阳性（箭头）细胞。CC，胼胝体。比例尺，100µm。

恶性星形细胞瘤的浸润特征通常将肿瘤细胞置于非肿瘤内源性神经元和胶质细胞的环境中。在总共14个GBM中，我们分析了6个GBM的纯非滤过性肿瘤组织。2个GBM含有扩散到大脑表面的肿瘤细胞(图8A). 我们还获得了两个从SVZ生长到心室区的GBM肿瘤样本(图8B). 这种罕见的生长方向导致了纯非滤过性肿瘤组织。此外，我们分析了两种形成多灶假栅栏肿瘤细胞的GBM(图8C). 这些纯粹的非滤过性肿瘤组织的特性通过一系列典型的神经病理学特征（包括非典型细胞核）的存在进一步得到证实。免疫组织化学分析显示，这些高级肿瘤包含所有神经谱系的细胞。纯肿瘤组织中的细胞对以下物质染色呈阳性：星形细胞标志物，GFAP(图8D、8E和8F); 少突胶质细胞标记物，蛋白脂质蛋白（PLP），是哺乳动物中枢神经系统中最丰富的髓磷脂蛋白(图8G–8I) (Griffiths等人，1998年；Lu等人，2000年；Zhou等人，2000年); 和神经标记物，包括Tuj1(图8M–8O)和MAP2(图8P–8R). 值得注意的是，神经元标记物Tuj1的表达(Katsetos等人，2001年)和MAP2(Singh等人，2004年)以前在人类GBM中观察到。肿瘤细胞表达很少或没有髓鞘碱性蛋白（MBP）(图8J–8L)是成熟少突胶质细胞的标志物。由于MBP通常在髓鞘化少突胶质细胞中高表达，因此MBP染色的缺失进一步证实了这些肿瘤组织含有极少或没有内源性神经元或胶质细胞(图8J，箭头）。这些数据支持这样的模型，即在体内，胶质母细胞瘤细胞具有干细胞进行多系分化的能力(Singh等人，2004年).

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GBM细胞具有体内多系分化的干细胞能力

A–C：用H&E对三个含有纯非滤过性肿瘤组织的具有代表性的GBM切片进行染色A类和B标记主要肿瘤与周围脑组织的边界。的相邻部分A类–C用抗GFAP染色(D–F型)，抗PLP(G–I型)，抗MBP(J–L型)，反Tuj1(M–O型)和MAP2(P–R（P–R）). 值得注意的是，与含有广泛MBP染色的正常大脑相比（如箭头所示J型)，在这些纯非滤过性肿瘤组织中检测到轻微或无染色(J–L). 比例尺，100µm。

早期p53失活对恶性星形细胞瘤的形成至关重要

p53抑癌基因的基因突变是许多实体瘤进展的共同标志(Vogelstein等人，2000年；Vousden和Lu，2002年). 相反，p53突变是恶性星形细胞瘤中最早发现的遗传损伤之一(Louis等人，1993年；Rasheed等人，1994年；van Meyel等人，1994年；von Deimling等人，1992年). 三种Mut菌株的可用性使我们能够检查p53缺失的早期时间是否影响肿瘤发生性(图1). 而Mut1菌株含有种系纯合的空p53（导致p53缺失先于NF1缺失）；Mut2菌株携带杂合子种系p53突变，在hGFAP公司-cre、NF1的丢失是由重组引起的，在神经祖细胞和衍生物中，这是在p53杂合性（LOH）丢失之前发生的。最后，Mut3菌株在CNS细胞中含有顺NF1flox/p53突变染色体和野生型染色体。该菌株中的杂合性缺失是由于野生型染色体的丢失，从而导致两种抑癌基因同时丢失（这一过程称为co-LOH）(图1) (Cichowski等人，1999年；Reilly等人，2000年；Vogel等人，1999年). 与Mut1和Mut3菌株相比，所分析的大多数Mut2小鼠（17/18）没有发生星形细胞瘤(图1和​和2K）。2千卡). 大约20%的Mut2小鼠存活到与致瘤Mut3小鼠相同的年龄，但没有发展为星形细胞瘤(图2J). 与Mut3小鼠相比，大约80%的Mut2小鼠在明显更早的年龄死亡。由于在Mut2（4/21,19%）和Mut3（11/58,19%）中观察到的非中枢神经系统肿瘤的发病率几乎相同，我们不能将Mut2小鼠的死亡归因于p53相关肿瘤。我们推测，Mut2小鼠的过早死亡可能是由于发育中的CNS细胞NF1缺乏导致CNS发育异常所致（Zhu等人，提交）。为了排除过早死亡可能阻止这些Mut2小鼠发展为星形细胞瘤的可能性，我们研究了三只18周龄的无症状Mut3小鼠，此时超过85%的Mut2鼠存活且无肿瘤(图2J，箭头）。组织学分析显示，三只无症状的Mut3小鼠中有两只已经表现出低度星形细胞瘤(图2K和图S2). 因此，我们得出结论，导致恶性星形细胞瘤的靶细胞需要在NF1缺失（Ras激活）之前或伴随NF1缺失的p53缺失。在相反的配置中，NF1的早期丢失不能为靶细胞提供肿瘤起始的选择性优势。这些遗传数据表明，在这些小鼠模型中，p53的早期丢失对星形细胞瘤的形成至关重要。

讨论

鼠标模型

人类星形细胞瘤的详细分子特征为深入了解肿瘤发生和发展过程中许多致癌基因、肿瘤抑制因子和信号通路的改变提供了重要依据(荷兰，2001年；Maher等人，2001年；朱和帕拉达，2002年). 本研究表明，CNS细胞中通过NF1失活导致p53缺失和Ras通路激活足以导致100%外显率的互变恶性星形细胞瘤形成。尽管在Mut1和Mut3模型中都发现了所有级别的恶性星形细胞瘤，但只有在症状前小鼠中发现了低级别的病变，除了两只患有p53相关淋巴瘤的Mut1小鼠。与人类分化良好的低级别星形细胞瘤相比，这些模型中级别相似的肿瘤显示出更大程度的核异型性。除了这些观察结果外，Mut1（10至20周）和Mut3（20至45周）小鼠的GBM快速发展表明，这些模型可能与人类的原发GBM相似。一致地，最近一项基于人群的研究报告称，约28%的人类原发性GBM中发现了p53突变，其中7.5%的GBM也含有表皮生长因子受体（EGFR）扩增(Ohgaki等人，2004年).

NF1抑癌基因在恶性星形细胞瘤中的作用

尽管15%至20%的NF1儿童出现视路良性星形细胞瘤（视路胶质瘤），但直到最近才确定NF1相关的恶性星形细胞瘤风险。一项使用1983年至1997年美国死亡证明的研究报告称，NF1患者发生脑瘤的频率是普通人群的5.5倍(Rasmussen等人，2001年). 特别是，估计10岁以上的NF1患者患脑肿瘤的相对风险比没有NF1的患者高出100倍。这些患者的许多肿瘤是高度恶性星形细胞瘤(Gutmann等人，2002年). 此外，分子分析显示NF1相关的恶性星形细胞瘤具有遗传改变，包括p53突变和p16INK4A/ARF缺失，这在散发性星形细胞瘤中常见(Gutmann等人，2003年). 综上所述，这些观察结果不仅证明了p53失活与NF1缺失在人类恶性星形细胞瘤的发生发展中起协同作用，还表明NF1相关和散发性恶性星形细胞肿瘤可能具有相似的肿瘤进展分子机制。因此，我们的模型可能提供了一个有用的工具，以解剖NF1相关和散发性恶性星形细胞瘤的肿瘤进展的分子基础。

虽然在一个散发的III级恶性星形细胞瘤中发现了体细胞中第一个特征性NF1突变(Li等人，1992年)在随后使用大量人类原发性肿瘤和细胞系进行的研究中，在散发性星形细胞瘤中未观察到NF1 mRNA或蛋白表达缺失(Gutmann等人，1996年). 因此，一般认为NF1与散发性恶性星形细胞瘤无关，后者通过解除调控的PDGFR或EGFR频繁激活Ras通路(荷兰，2001年；Kleihues和Cavenee，2000年；Maher等人，2001年；朱和帕拉达，2002年). 特别是，p53突变和PDGFR过度表达经常在同一肿瘤中被发现，这表明这两种途径在人类恶性星形细胞瘤的发展中具有协同作用(Hermanson等人，1996年). 此外，p53失活和PDGF过度表达之间的协同作用也已在使用小鼠逆转录病毒基因转移的小鼠模型中建立(Hesselager等人，2003年). 然而，在最近一项使用复制能力强的禽白血病病毒剪接受体（RCAS）/tv-a系统的研究中，PDGF配体（PDGF-B）靶向过表达到新生小鼠大脑中的巢蛋白和GFAP表达细胞中，分别诱导了少突胶质瘤和少星形细胞瘤(Dai等人，2001年). 此外，p53的缺失并没有促进PDGF诱导肿瘤的形成。通过p53/NF1或PDGF改变的实验诱导肿瘤之间差异的可能解释包括这些肿瘤的潜在不同的细胞来源，以及遗传背景的差异。目前的研究表明，在p53/NF1突变小鼠中，恶性星形细胞瘤的原细胞最可能位于成人大脑的SVZ（见下文）。PDGF诱导的新生脑细胞肿瘤的定位和起源尚不清楚。该模型中的靶细胞明显具有进行少突胶质细胞分化的更大潜力(Sauvageot和Stiles，2002年).

肿瘤起源地

最近的研究表明，包括GBM在内的脑肿瘤包含干细胞样细胞或癌症干细胞亚群，这些干细胞具有干细胞特征，包括自我更新和多潜能(Hemmati等人，2003年；Ignatova等人，2002年；Singh等人，2003年,2004)和负责体内肿瘤生长(Galli等人，2004年；Singh等人，2004年). 这些脑癌干细胞是否来源于正常神经干细胞的肿瘤转化尚待确定。与之前发表的恶性星形细胞瘤小鼠模型相比(丁等人，2001；Hesselager等人，2003年；Holland等人，1998年,2000；Reilly等人，2000年；肖等人，2002年)在Mut1模型中，肿瘤表型的完全外显性和肿瘤的快速发展使组织学和非侵入性MRI分析能够研究肿瘤起源的部位。结果表明，与人类GBM一样，成熟肿瘤散布在整个CNS，但肿瘤最早可识别的区域仅限于SVZ。在Mut1模型的遗传背景下，整个成人大脑中所有GFAP阳性的成熟星形胶质细胞或胶质前体细胞都包含相同的基因突变（p53和NF1抑癌基因均失活），SVZ中的成人神经干细胞也是如此。因此，恶性星形细胞瘤特异性位于SVZ内的观察结果表明：（1）与大脑其他区域相比，SVZ中存在一种特定的细胞类型，更容易受到p53/NF1介导的星形细胞瘤形成的影响，或（2）SVZ中的微环境为早期肿瘤细胞的生长提供了有利的生态位，这些肿瘤细胞要么出现在SVZ中，要么从大脑的其他区域迁移到SVZ中。根据目前的知识，SVZ和成人大脑其他区域（海马齿状回的SGL除外）之间的一个基本区别是存在特定的GFAP阳性“星形胶质细胞”样细胞，它们具有干细胞进行自我更新和多系分化的能力(Alvarez-Buylla等人，2001年；量规，2000；Temple和Alvarez-Buylla，1999年). 研究表明，这些GFAP阳性神经干细胞存在于人类和啮齿动物成年大脑的SVZ中(Doetsch等人，1999年；Sanai等人，2004年). 根据这些观察结果，我们的结果表明，成人大脑SVZ中GFAP阳性的神经干细胞可能是我们模型中恶性星形细胞瘤的原代细胞。

最近的一项研究表明，新生星形胶质细胞可能作为恶性星形细胞瘤的原细胞，以应对EGFR信号的解除调控和INK4a/ARF缺乏。因此，CNS中不同类型的细胞，包括神经干/祖细胞、胶质祖细胞（例如NG2阳性胶质细胞），甚至终末分化的星形细胞，可能是恶性星形细胞瘤的原细胞。不同神经胶质瘤相关遗传病变的组合可能诱导不同的中枢神经系统细胞类型形成恶性星形细胞瘤。因此，我们的模型可能会模拟具有p53缺陷和激活Ras信号的人类恶性星形细胞瘤子集，这些信号可能来自SVZ细胞。

基因突变的时间

我们还提供了遗传学证据，证明p53和NF1的失活不仅足以启动星形细胞瘤的形成，而且失活的时机至关重要。对于星形细胞瘤的诱导，p53失活必须先于或与NF1缺失引起的Ras激活相一致。这与p53基因突变是人类恶性星形细胞瘤中最早发现的遗传损伤的观察结果一致(荷兰，2001年；Maher等人，2001年；朱和帕拉达，2002年). 在许多其他实体肿瘤中，包括结肠癌和恶性外周鞘肿瘤(Kinzler和Vogelstein，1996年；朱和帕拉达，2002年)p53失活发生在肿瘤发展的后期，此时肿瘤细胞已经显示出侵袭性表型。因此，早期p53失活为星形细胞瘤细胞获得早期侵袭表型提供了选择性优势，或者通过NF1缺失激活Ras信号导致靶细胞凋亡或衰老，而p53失活性可以减弱这一点。

虽然在人类恶性星形细胞瘤中还没有发现激活的Ras突变，但在小鼠中，在hGFAP启动子的控制下，激活的H-Ras转基因的过度表达导致恶性星形细胞肿瘤的发生，其外显率高(丁等人，2001). 与此形成鲜明对比的是，仅NF1的丢失（例如，本研究中的Mut2小鼠）不足以导致脑内星形细胞瘤的形成(Bajenaru等人，2002年). 显然，致癌Ras信号并不等同于NF1失活。鉴于人类恶性星形细胞瘤通常发生在成年期，人类患者不太可能像Ras转基因模型那样含有大量具有高Ras信号水平的发育中的CNS细胞。相反，Mut3模型中通过co-LOH导致p53/NF1缺陷的突变细胞最有可能出现在成年期，因为这些突变小鼠发育正常，直到5个月大时才发展成肿瘤。在这方面，与Ras转基因小鼠相比，Mut3突变小鼠可能提供更好的模型，模拟人类恶性星形细胞瘤作为成人疾病。

临床意义

我们的研究不能排除星形细胞瘤起始的替代模型，如细胞去分化和转化(Bachoo等人，2002年；Galli等人，2004年；Singh等人，2004年). 巢蛋白和其他谱系特异性标记物在肿瘤细胞中的表达可以简单地反映出基因表达的放松。肿瘤中这些巢蛋白表达细胞是否代表肿瘤干细胞尚待确定。然而，在我们的模型中，将SVZ确定为肿瘤起源地可能对预防和治疗人类恶性星形细胞瘤子集的治疗策略有启示(Recht等人，2003年). 这些观察结果对胶质瘤发生的模型提出了挑战，该模型假设肿瘤是从大规模转化的胶质细胞或承诺的胶质祖细胞发展而来。因此，对于由SVZ引起的肿瘤，目前仅关注局部病变的治疗不足以根除肿瘤细胞，因为这些细胞最终可能会从SVZ内的细胞池中补充。这可能解释了为什么目前对恶性星形细胞瘤的治疗最终失败。

实验程序

Mut1-3突变小鼠的产生

突变小鼠在同一染色体上携带连接的p53空突变和漂浮的NF1等位基因(顺式小鼠）通过杂交产生NF1型弗洛克斯/+鼠标至第53页+/−小鼠产生第53页+/−；NF1型弗洛克斯/+反式然后将小鼠与野生型F1 129Svj/C57Bl6小鼠杂交(Jacks等人，1994年；Zhu等人，2001年). 至于NF1型弗洛克斯/+小鼠和第53页+/−老鼠，第53页+/−；NF1型+/弗洛克斯顺式小鼠维持在129Svj/C57Bl6杂交背景下。Mut3菌株是通过杂交产生的第53页+/−；NF1型+/弗洛克斯顺式鼠标至hGFAP公司-在FVB背景下产生的cre转基因小鼠(Zhuo等人，2001年). 将合成的Mut3菌株杂交五代至129Svj/C57Bl6杂交背景。通过将Mut3小鼠与第53页+/−；NF1型flox/flox公司顺式老鼠。因此，本研究中分析的Mut1-3小鼠维持在约99%的129Svj/assisC57Bl6（49.5%/49.5%）和1%的FVB杂交背景。本研究中分析的许多Mut1-3小鼠都是同窝小鼠。带有漂浮NF1等位基因、p53无效等位基因和Cre转基因小鼠的基因分型如前所述(Jacks等人，1994年；Zhu等人，2001年). 本研究中的所有小鼠均按照达拉斯德克萨斯大学西南医学中心和安娜堡密歇根大学动物护理和使用委员会批准的指南进行护理。

组织学和肿瘤分析

老鼠变老，直到出现痛苦的迹象。然后，用4%多聚甲醛（PFA）灌流小鼠，解剖其大脑，然后在4°C下在4%PFA中过夜固定。大脑沿着头尾轴分为三块，每一块都经过石蜡包埋或冷冻切片处理。连续切片制备为5µm石蜡切片或14µm冷冻切片。每10张玻片用H&E染色。染色切片分别用Y.Z.和D.K.B.光镜检查。Y.Z.和D.K.B.根据WHO恶性星形细胞瘤分级系统确定肿瘤分级(Kleihues和Cavenee，2000年). 相邻切片进行免疫组化（见下文）。为了进行PCR分析，将肿瘤组织在冰镇PBS中解剖，并用蛋白酶K消化，如前所述(Zhu等人，2002年).

免疫组织化学

石蜡切片脱蜡并重新水化。如前所述，对切片进行免疫组化(Zhu等人，1998年,2001). 用辣根过氧化物酶系统（Vectastain ABC试剂盒，Vector）或免疫荧光法，通过使用1:200稀释度的Cy3-偶联抗兔/鼠和Cy2-偶联抗鼠/兔二级抗体（Jackson lab），对一级抗体进行可视化。本研究中使用的主要抗体稀释液如下：GFAP（兔子，1:2000，DAKO）、nestin（老鼠，1:200，Chemicon）、Cre（老鼠，1:1000，BABCO）、P-ERK（兔子，1:100，细胞信号）、P-AKT（兔子，1-100，细胞信号）、Cdk4（兔子，1-2000，Santa Cruz）、cyclin D1（老鼠、1:200，Zymed）、Ki-67（兔子，1/1000，Novocastra）、，VEGF（小鼠，1:50，Up-state Biotech）、Olg2（兔子，1:300，R.Lu博士的礼物）、NeuN（小鼠，1:1500，Chemicon）、Tuj1（小鼠，1:200，Covance）、NF200（兔子，1:200、Sigma）。切片在光学显微镜或荧光显微镜下进行检查（奥林巴斯）。共焦显微镜（Zeiss）进一步证实了两种抗原的共定位。

MRI分析

当突变小鼠出现痛苦迹象时，对其进行扫描。在准备MRI时，给一只小鼠服用阿维汀（0.4 ml，20 mg/ml；i.p.），并维持在全身气体麻醉下（1 dm）三/最小空气和0.8%异氟醚）。使用27G蝴蝶（伊利诺伊州雅培公园雅培实验室）对小鼠尾静脉进行插管，以进行对比剂给药。MRI实验使用配备Varian-Inova成像系统的4.7T水平磁铁进行。老鼠被放在一个自制的八元素鸟笼线圈中（直径约2厘米）。矢状方向的快速侦察图像显示了高分辨率图像的相关切片。获取T1加权（TR=250 ms；TE=15 ms）和T2加权（TR=1500 ms；TE=80 ms）自旋回波多层（SEMS）轴向图像，并在静脉团注Gd-DTPA-BMA（0.1 mmol/kg体重；Omniscan）后立即获取对比增强T1加权图像。MRI参数包括3-4 cm的视野（FOV）、128×128的矩阵大小、1 mm的层厚和两次采集。MRI之后，处死小鼠，解剖整个小鼠大脑并进行组织学分析，如上所述。后续研究在3周内每周检查一次无症状突变小鼠，以检测肿瘤的发展。

补充材料

Zhu等人补充数据

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致谢

我们感谢A.DeShaw、P.Houston和S.McKinnon提供的技术援助；Q.R.Lu博士检测Olig2抗体；Parada实验室成员支持；和S.Kernie博士批判性地阅读手稿。这项工作得到了国家神经疾病与中风研究所和国防部（L.F.P.）的资助。Y.Z.感谢国家神经纤维瘤病基金会（青年研究员奖）、生物科学学者计划和密歇根大学医学院综合癌症中心（Munn Idea Award）、通用汽车癌症研究学者计划的支持。D.Z.和R.P.M.感谢Todd Soesbe为国家癌症研究所提供的P20 Pre-ICMIC赠款CA86354线圈施工。

脚注

补充数据

补充数据包括四个数字，可以在本文的网站上找到http://www.cancercell.org/cgi/content/full/8/219/DC1/.

工具书类

  • Alvarez Builla A，Garcia Verdugo JM，Tramontin AD。关于神经干细胞谱系的统一假设。神经科学自然评论。2001;2:287–293.[公共医学][谷歌学者]
  • Bachoo RM、Maher EA、Ligon KL、Sharpless NE、Chan SS、You MJ、Tang Y、DeFrances J、Stover E、Weissleder R等。表皮生长因子受体和Ink4a/Arf：控制神经干细胞向星形胶质细胞轴终末分化和转化的聚合机制。癌细胞。2002;1:269–277.[公共医学][谷歌学者]
  • Bajenaru ML、Zhu Y、Hedrick NM、Donahoe J、Parada LF、Gutmann DH。神经纤维瘤病1基因（NF1）的星形细胞特异性失活不足以形成星形细胞瘤。分子细胞。生物。2002;22:5100–5113. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Cichowski K，Jacks T.NF1抑癌基因功能：缩小GAP。单元格。2001;104:593–604.[公共医学][谷歌学者]
  • Cichowski K、Shih TS、Schmitt E、Santiago S、Reilly K、McLaughlin ME、Bronson RT、Jacks T。1型神经纤维瘤病肿瘤发展的小鼠模型。科学。1999;286:2172–2176.[公共医学][谷歌学者]
  • Dai C、Celestino JC、Okada Y、Louis DN、Fuller GN、Holland EC。PDGF自分泌刺激可使培养的星形胶质细胞脱分化，并诱导体内神经祖细胞和星形胶质细胞的少突胶质瘤和少突胶质细胞瘤。基因发育。2001;15:1913–1925. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Ding H，Roncari L，Shannon P，Wu X，Lau N，Karaskova J，Gutmann DH，Squire JA，Nagy A，Guha A.活化p21-ras的星形细胞特异性表达导致人脑胶质瘤转基因小鼠模型中恶性星形细胞瘤的形成。癌症研究。2001;61:3826–3836.[公共医学][谷歌学者]
  • Doetsch F、Caille I、Lim DA、Garcia Verdugo JM、Alvarez Builla A.室下区星形胶质细胞是成年哺乳动物大脑中的神经干细胞。单元格。1999;97:703–716.[公共医学][谷歌学者]
  • Donehower LA，Harvey M，Slagle BL，McArthur MJ，Montgomery CA，Jr，Butel JS，Bradley A.缺乏p53的小鼠发育正常，但易患自发性肿瘤。自然。1992;356:215–221.[公共医学][谷歌学者]
  • 量规FH。哺乳动物神经干细胞。科学。2000;287:1433–1438.[公共医学][谷歌学者]
  • Galli R、Binda E、Orfanelli U、Cipeletti B、Gritti A、De Vitis S、Fiocco R、Foroni C、Dimeco F、Vescovi A。人类胶质母细胞瘤致瘤性干样神经前体的分离和表征。癌症研究。2004;64:7011–7021.[公共医学][谷歌学者]
  • Griffiths I、Klugmann M、Anderson T、Thomson C、Vouyiouklis D、Nave KA。PLP的当前概念及其在神经系统中的作用。微型计算机。研究技术。1998;41:344–358.[公共医学][谷歌学者]
  • Guha A，Dashner K，Black PM，Wagner JA，Stiles CD。人类星形细胞瘤手术标本中PDGF和PDGF受体的表达支持自分泌环的存在。国际癌症杂志。1995;60:168–173.[公共医学][谷歌学者]
  • Gutmann DH，Giordano MJ，Mahadeo DK，Lau N，Silbergeld D，Guha A.生物母细胞瘤中神经纤维瘤病1基因表达增加：p21-ras的阳性调节。致癌物。1996;12:2121–2127.[公共医学][谷歌学者]
  • Gutmann DH、Rasmussen SA、Wolkenstein P、MacCollin MM、Guha A、Inskip PD、North KN、Poyhonen M、Birch PH、Friedman JM。神经纤维瘤病1型（NF1）患者10岁后出现的胶质瘤神经病学。2002;59:759–761.[公共医学][谷歌学者]
  • Gutmann DH、James CD、Poyhonen M、Louis DN、Ferner R、Guha A、Hariharan S、Viskochil D、Perry A。NF1患者10岁后出现星形细胞瘤的分子分析。神经病学。2003;61:1397–1400.[公共医学][谷歌学者]
  • Hemmati HD、Nakano I、Lazaref JA、Masterman-Smith M、Geschwind DH、Bronner-Fraser M、Kornblum HI。癌症干细胞可由儿童脑肿瘤产生。程序。国家。阿卡德。科学。美国。2003;100:15178–15183. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Hermanson M、Funa K、Hartman M、Claesson Welsh L、Heldin CH、Westermark B、Nister M。人类胶质瘤组织中的血小板衍生生长因子及其受体：信使RNA和蛋白质的表达表明存在自分泌和旁分泌环。癌症研究。1992;52:3213–3219.[公共医学][谷歌学者]
  • Hermanson M、Funa K、Koopmann J、Maintz D、Waha A、Westermark B、Heldin CH、Wiestler OD、Louis DN、von Deimling A、Nister M。人类恶性胶质瘤中17p染色体杂合性缺失与血小板衍生生长因子α受体高表达的相关性。癌症研究。1996;56:164–171.[公共医学][谷歌学者]
  • Hesselager G，Uhrbom L，Westermark B，Nister M。小鼠胶质瘤模型中血小板衍生生长因子自分泌刺激和p53或Ink4a-Arf缺失的补充作用。癌症研究。2003;63:4305–4309.[公共医学][谷歌学者]
  • Holland EC。胶质瘤发生：基因改变和小鼠模型。Nat.Rev.基因。2001;2:120–129.[公共医学][谷歌学者]
  • 荷兰EC、Hively WP、DePinho RA、Varmus HE。一种组成性活性表皮生长因子受体与G1细胞周期阻滞通路的破坏协同作用，诱导小鼠发生胶质瘤样病变。基因发育。1998;12:3675–3685. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Holland EC、Celestino J、Dai C、Schaefer L、Sawaya RE、Fuller GN。神经祖细胞中Ras和Akt的联合激活诱导小鼠胶质母细胞瘤的形成。自然遗传学。2000;25:55–57.[公共医学][谷歌学者]
  • Ignatova TN、Kukekov VG、Laywell ED、Suslov ON、Vrionis FD、Steindler DA。人类皮层胶质瘤含有体外表达星形胶质细胞和神经元标记物的神经干样细胞。格利亚。2002;39：193–206。[公共医学][谷歌学者]
  • Jacks T、Remington L、Williams BO、Schmitt EM、Halachmi S、Bronson RT、Weinberg RA。p53突变小鼠的肿瘤谱分析。货币。生物。1994;4:1–7.[公共医学][谷歌学者]
  • Katsetos CD、Del Valle L、Geddes JF、Assimakopoulou M、Legido A、Boyd JC、Balin B、Parikh NA、Maraziotis T、de Chadarevian JP等。星形细胞瘤中神经元III类β-微管蛋白的异常定位。架构（architecture）。病态。医学实验室。2001;125:613–624.[公共医学][谷歌学者]
  • Kinzler KW，Vogelstein B.遗传性结直肠癌的教训。单元格。1996;87:159–170.[公共医学][谷歌学者]
  • Kleihues P，Cavenee WK。神经系统肿瘤的病理学和遗传学。法国里昂：IARC出版社；2000[谷歌学者]
  • Li Y，Bollag G，Clark R，Stevens J，Conroy L，Fults D，Ward K，Friedman E，Samowitz W，Robertson M等。人类肿瘤中神经纤维瘤病1基因的体细胞突变。单元格。1992;69:275–281.[公共医学][谷歌学者]
  • Louis DN、von Deimling A、Chung RY、Rubio MP、Whaley JM、Eibl RH、Ohgaki H、Wiestler OD、Thor AD、Seizinger BR。人类星形细胞肿瘤中p53基因和蛋白改变的比较研究。神经病理学杂志。实验神经学。1993;52:31–38.[公共医学][谷歌学者]
  • Lu QR、Yuk D、Alberta JA、Zhu Z、Pawlitzky I、Chan J、McMahon AP、Stiles CD、Rowitch DH。哺乳动物中枢神经系统中编码bHLH蛋白的声波刺猬调节少突胶质细胞谱系基因。神经元。2000;25:317–329.[公共医学][谷歌学者]
  • Maher EA、Furnari FB、Bachoo RM、Rowitch DH、Louis DN、Cavenee WK、DePinho RA。恶性胶质瘤：一个严重问题的遗传学和生物学。基因发育。2001;15:1311–1333.[公共医学][谷歌学者]
  • Malatesta P，Hartfuss E，Gotz M。通过荧光激活细胞分选分离放射状胶质细胞，揭示了神经元谱系。发展。2000;127:5253–5263.[公共医学][谷歌学者]
  • Malatesta P、Hack MA、Hartfuss E、Kettenmann H、Klinkert W、Kirchhoff F、Gotz M。神经元或神经胶质后代：放射状神经胶质命运的区域差异。神经元。2003;37:751–764.[公共医学][谷歌学者]
  • Merkle FT、Tramontin AD、Garcia-Verdugo JM、Alvarez-Buylla A.径向胶质细胞在脑室下区产生成人神经干细胞。程序。国家。阿卡德。科学。美国。2004;101:17528–17532. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Nister M、Libermann TA、Betsholtz C、Pettersson M、Claesson-Welsh L、Heldin CH、Schlessinger J、Westermark B。血小板衍生生长因子和转化生长因子-α及其受体信使RNA在人类恶性胶质瘤细胞系中的表达。癌症研究。1988;48:3910–3918.[公共医学][谷歌学者]
  • Noctor SC、Flint AC、Weissman TA、Dammerman RS、Kriegstein AR。来自放射状胶质细胞的神经元在新皮质中建立放射单位。自然。2001;409:714–720.[公共医学][谷歌学者]
  • Ohgaki H、Dessen P、Jourde B、Horstmann S、Nishikawa T、Di Patre PL、Burkhard C、Schuler D、Probst-Hensch NM、Maiorka PC等。胶质母细胞瘤的遗传途径：一项基于人群的研究。癌症研究。2004;64:6892–6899.[公共医学][谷歌学者]
  • Rasheed BK、McLendon RE、Herndon JE、Friedman HS、Friedoman AH、Bigner DD、Bignor SH。人脑胶质瘤中TP53基因的改变。癌症研究。1994;54:1324–1330.[公共医学][谷歌学者]
  • Rasmussen SA，Yang Q，Friedman JM。神经纤维瘤病死亡率1：使用美国死亡证明的分析。Am.J.Hum.遗传学。2001;68:1110–1118. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Recht L、Jang T、Savarese T、Litofsky NS。神经干细胞与神经肿瘤学：现状？J.细胞。生物化学。2003;88:11–19.[公共医学][谷歌学者]
  • Reilly KM、Loisel DA、Bronson RT、McLaughlin ME、Jacks T.Nf1；Trp53突变小鼠发展为胶质母细胞瘤，具有菌株特异性效应的证据。自然遗传学。2000;26:109–113.[公共医学][谷歌学者]
  • Reilly KM、Tuskan RG、Christy E、Loisel DA、Ledger J、Bronson RT、Smith CD、Tsang S、Munroe DJ、Jacks T。Nf1和Trp53突变小鼠对星形细胞瘤的敏感性与11号染色体相关，并受表观遗传影响。程序。国家。阿卡德。科学。美国。2004;101:13008–13013. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Ride JL、Malhotra SK、Privat A、Gage FH。反应性星形胶质细胞：生物功能的细胞和分子线索。《神经科学趋势》。1997;20:570–577.[公共医学][谷歌学者]
  • Sanai N、Tramontin AD、Quinones Hinojosa A、Barbaro NM、Gupta N、Kunwar S、Lawton MT、McDermott MW、Parsa AT、Manuel Garcia Verdugo J等。成人大脑中独特的星形胶质细胞带含有神经干细胞，但缺乏链迁移。自然。2004;427:740–744.[公共医学][谷歌学者]
  • Sauvageot CM，Stiles CD。控制皮层胶质生成的分子机制。货币。操作。神经生物学。2002;12:244–249.[公共医学][谷歌学者]
  • Singh SK、Clarke ID、Terasaki M、Bonn VE、Hawkins C、Squire J、Dirks PB。人脑肿瘤中肿瘤干细胞的鉴定。癌症研究。2003;63:5821–5828.[公共医学][谷歌学者]
  • Singh SK、Hawkins C、Clarke ID、Squire JA、Bayani J、Hide T、Henkelman RM、Cusimano MD、Dirks PB。人脑肿瘤起始细胞的鉴定。自然。2004;432:396–401.[公共医学][谷歌学者]
  • Soriano P.利用ROSA26 Cre报告菌株广义lacZ表达。自然遗传学。1999;21:70–71.[公共医学][谷歌学者]
  • Temple S，Alvarez-Buylla A.成年哺乳动物中枢神经系统中的干细胞。货币。操作。神经生物学。1999;9:135–141.[公共医学][谷歌学者]
  • Tramontin AD、Garcia-Verdugo JM、Lim DA、Alvarez-Buylla A.放射状胶质细胞和心室区（VZ）的出生后发育：神经干细胞室的连续体。大脑。科尔特斯。2003;13:580–587.[公共医学][谷歌学者]
  • van Meyel DJ、Ramsay DA、Casson AG、Keeney M、Chambers AF、Cairncross JG。进化中胶质瘤中p53突变、表达和DNA倍体：两种进展途径的证据。J.国家。癌症研究所。1994;86:1011–1017.[公共医学][谷歌学者]
  • Vogel KS、Klesse LJ、Velasc-Miguel S、Meyers K、Rushing EJ、Parada LF。1型神经纤维瘤病小鼠肿瘤模型。科学。1999;286:2176–2179. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Vogelstein B，Lane D，Levine AJ。浏览p53网络。自然。2000;408:307–310.[公共医学][谷歌学者]
  • von Deimling A、Eibl RH、Ohgaki H、Louis DN、von Ammon K、Petersen I、Kleihues P、Chung RY、Wiestler OD、Seizinger BR。p53突变与II级和III级星形细胞瘤17p等位基因缺失相关。癌症研究。1992;52:2987–2990.[公共医学][谷歌学者]
  • Vousden KH，Lu X.生或死：细胞对p53的反应。Nat.Rev.癌症。2002;2:594–604.[公共医学][谷歌学者]
  • Xiao A，Wu H，Pandolfi PP，Louis DN，Van Dyke T.pRb通路的星形胶质细胞失活使小鼠易患恶性星形细胞瘤，PTEN突变加速了星形胶质细胞瘤的发展。癌细胞。2002;1:157–168.[公共医学][谷歌学者]
  • Zhou Q，Wang S，Anderson DJ。一个新的少突胶质细胞谱系特异性碱性螺旋-环-螺旋转录因子家族的鉴定。神经元。2000;25:331–343.[公共医学][谷歌学者]
  • Zhu Y，Parada LF。神经纤维蛋白，神经系统中的肿瘤抑制因子。实验细胞研究。2001;264:19–28.[公共医学][谷歌学者]
  • Zhu Y，Parada LF。神经肿瘤的分子和遗传基础。Nat.Rev.癌症。2002;2:616–626.[公共医学][谷歌学者]
  • Zhu Y，Richardson JA，Parada LF，Graff JM。Smad3突变小鼠发生转移性结直肠癌。单元格。1998;94:703–714.[公共医学][谷歌学者]
  • Zhu Y、Romero MI、Ghosh P、Ye Z、Charnay P、Rushing EJ、Marth JD、Parada LF。神经元NF1功能的消融导致大脑皮层发育异常和大脑反应性胶质增生。基因发育。2001;15:859–876. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Zhu Y、Ghosh P、Charnay P、Burns DK、Parada LF。NF1中的神经纤维瘤：雪旺细胞起源和肿瘤环境的作用。科学。2002;296:920–922. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Zhuo L，Theis M，Alvarez-Maya I，Brenner M，Willecke K，Messing A.hGFAP-cre转基因小鼠，用于操纵体内的胶质细胞和神经元功能。起源。2001;31:85–94.[公共医学][谷歌学者]