缓慢加压剂量的血管紧张素II诱发的脑血管功能障碍先于高血压的发生

摘要

大脑是主要目标与血压升高相关的末端器官损伤，以及主要是中风和痴呆症的脑部疾病，在很大程度上增加了高血压的公共健康负担(15,24). 高血压导致62%的脑血管疾病(23)中年高血压是老年痴呆症的危险因素，老年痴呆症是老年人认知功能障碍的最常见原因(9). 虽然众所周知，脑血管是高血压对大脑影响的主要靶点(16)导致脑功能障碍和中风和痴呆风险增加的机制尚未阐明。

大脑严重依赖于持续且调节良好的血液供应，以支持其对氧气和葡萄糖的动态需求，并清除大脑活动的代谢副产物(17,26). 复杂的调节机制确保大脑接受足够的脑血流量（CBF），以维持大脑微环境的稳态。因此，活跃的神经元引起CBF的强烈增加，以使底物递送与活化的代谢需求相匹配（功能性充血），而内皮细胞释放出调节微血管流量分布的强有力的血管活性物质(1,17). 高血压破坏了这些控制机制，增加了大脑对血管功能不全的敏感性(16). 然而，脑血管功能障碍与高血压发展之间的时间关系仍有待确定。这个问题令人感兴趣，因为根据血压升高的幅度，脑血管损伤的证据可能存在于尚不符合高血压标准（高血压前期）的患者中(5,31,36). 因此，确定脑血管改变是在血压升高之前还是之后，对于预防来说是很重要的。

血管紧张素II（ANG II）已成为原发性高血压的一个关键因素，在实验动物中使用它会再现高血压的主要特征，包括脑血管功能障碍(16). 全身注射降压剂量的ANG II 2周，即所谓的高血压“慢升压”模型，会导致血压延迟升高(40). 由于ANG II输注与高血压发病之间存在时滞，该模型提供了检查脑血管功能障碍与血压升高之间时间关系的机会。因此，我们使用该模型来研究血压升高和脑血管功能障碍的时间分布。我们发现，脑血管功能障碍先于高血压发病，并持续超过2周输液结束时血压正常化。新皮质活性氧（ROS）与脑血管病变平行增加，并导致损伤。这些发现为脑循环对ANG II有害影响的显著敏感性提供了证据，并增加了脑血管功能障碍也是人类高血压早期事件的可能性。

方法

在以前的出版物中详细描述了小鼠的手术准备、药物局部应用、记录场电位、血压测量和使用激光多普勒血流计监测CBF的方法(三,12,19,21,22,29)并在这里进行简要总结。

结果

缓慢加压血管紧张素II输注升高血压并诱发脑血管功能障碍

通过遥测血压测量，我们发现缓慢加压ANG II输注（600 ng·kg⁻¹·最小值⁻¹)持续14天导致MAP延迟增加，开始于第9天到达了一个高原第11天和17(图1A类). 随着渗透微型泵排空，MAP开始下降，并于年恢复正常第21天，直到研究结束(第28天) (图1A类). 在研究脑血管反应性的单独小鼠中，ANG II输注可升高MAP(图1B类)并减弱由触须刺激和内皮依赖性血管扩张剂ACh、缓激肽和A-23187诱导的CBF增加(图1,C–F类). 相反，平滑肌松弛剂腺苷诱导的CBF增加不受影响(图1G公司). 首次观察到脑血管功能障碍发生在MAP升高前7天，并在MAP恢复到基线后21天持续存在(图1,C–F类). 在植入输送盐水的微型泵的小鼠中，CBF增加的稳定性在第3、7和14天进行了测试，并且反应在时间上是稳定的(图2,A–D). 为了确定血压的持续升高是否足以导致脑血管功能障碍，我们使用PE将MAP升高14天。PE将MAP升高到与ANG II诱导的水平相似的水平(图3,A类和B类)但没有改变功能性充血、内皮依赖性反应或腺苷产生的CBF增加(图3,C–E类).

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图1。

ANG II输液效果的时间进程（600 ng·kg⁻¹·最小值⁻¹)平均动脉压（MAP）和脑血流（CBF）反应。A类：通过无线电遥测在植入渗透微型泵的小鼠体内记录MAP，该泵设置为输送ANG II或载体14天。MAP在第9天显著增加，第11天达到稳定，第19天开始下降。MAP在第21天返回基线*P（P）与基线和车辆相比<0.05（方差分析和Tukey检验；n个=5/组）。B类：在监测CBF的麻醉小鼠中，ANG II输注诱导的MAP增加。通过留置股动脉导管测量MAP。仅在第14天观察到显著增加。C–G：在接受ANG II的小鼠中，胡须刺激、ACh（10μM）、缓激肽（50μM），A-23187（3μM）或腺苷（400μM）诱导的CBF增加。当MAP尚未增加时，对触须刺激、ACh、缓激肽和A-23187（而非腺苷）的反应在7天时减弱。反应持续减少至21天，并在28天恢复到基线水平*P（P）<0.05（方差分析和Tukey检验；n个=5/组）。

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图2。

在植入装有盐水的渗透微型泵的小鼠中，MAP的稳定性和CBF随时间的增加。A类：在CBF实验期间通过股骨导管测量MAP。B–D类：刺激胡须或局部应用ACh或腺苷导致CBF增加。P（P）>0.05（方差分析和Tukey检验；n个=5/组）。

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图3。

用苯肾上腺素（PE）升高MAP不会减弱CBF反应。A类：输注PE（3μg·kg）诱导尾剪断容积描记法测定收缩压升高的时间进程⁻¹·最小值⁻¹)持续14天。SAP，收缩压*P（P）生理盐水<0.05；n个=5/组。B类：PE在监测CBF的麻醉小鼠中诱导的MAP增加。C–E类：尽管MAP增加，PE并没有减弱由触须刺激、ACh或腺苷引起的CBF增加。P（P）>车辆0.05；n个=5/组。

非加压剂量ANGⅡ诱发脑血管功能障碍

前一节中的数据表明，ANG II可能独立于MAP升高而诱发脑血管功能障碍。因此，我们研究了不升高MAP的ANG II剂量是否能够诱发脑血管功能障碍。ANG II的非加压剂量（200 ng·kg⁻¹·最小值⁻¹)未提升MAP(图4,A类和B类)但诱发的脑血管功能障碍与缓慢加压ANG II剂量（600 ng·kg⁻¹·最小值⁻¹) (图4,C–G).

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图4。

ANG II的非加压剂量减弱CBF反应。A类：输注非加压剂量的ANG II（200 ng·kg⁻¹·最小值⁻¹;n个=5/组）。B类：在输注ANG II（200或600 ng·kg⁻¹·最小值⁻¹)持续14天。C–G类：ANG II输液（200和600 ng·kg⁻¹·最小值⁻¹)减弱CBF对触须刺激、ACh、缓激肽A-23197的反应，但不减弱腺苷的反应*P（P）<0.05来自车辆#P（P）ANG II-200和车辆（ANOVA和Tukey试验；n个=5/组）。

慢升压型ANG II高血压期间自发或诱发的新皮质神经活动没有改变

神经活动是脑血管反应性的有力决定因素(7). 为了确定脑血管功能的改变是否与神经活动的改变有关，我们检测了缓慢加压剂量的ANG II对皮层电图和触须刺激体感皮层诱发的场电位的影响。如所示图5静脉滴注ANG II 14天，MAP升高（溶媒，79±2；ANG II，88±1 mmHg；P（P）< 0.05;n个=4/组），但不影响场电位的振幅或皮层电图的频率分布。相反，麻醉剂异氟醚在所有频率下都会减弱场电位和皮层电图(图5,A类和B类)，为监测系统的灵敏度提供了积极的控制。因此，ANG II诱导的脑血管功能障碍与测量CBF的新皮质自发或诱发神经活动的改变无关。

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图5。

14天输注ANG II（600 ng·kg）的效果⁻¹·最小值⁻¹)体感皮层的自发和诱发神经活动(n个=4/组）。A类：ANG II不影响胡须激活引起的场电位（2V；0.5Hz；1ms脉冲）。相反，麻醉剂异氟醚（5%）显著减弱了反应。箭头表示刺激的应用*场电位的负波，其振幅（单位：mV）如所示插入.B类：ANG II不影响皮层电图的频率分布，而异氟醚能有效衰减所有频率下的信号振幅。

血管紧张素Ⅱ诱导体感皮层氧化应激

众所周知，ANG II可诱导ROS生成(10). 然而，尚不清楚缓慢加压的ANG II输注是否会增加大脑皮层中的ROS，如果是，这种增加是否与血压升高平行。使用缓慢加压剂量的ANG II（600 ng·kg⁻¹·最小值⁻¹)，ROS在第7天开始增加(P（P）<0.05），在第14天达到最大值(P（P）<0.05），在第21天仍然增加(P（P）<0.05），并在第28天恢复到基线水平(图6A类). 非加压剂量的ANG II（200 ng·kg⁻¹·最小值⁻¹)第14天时ROS也升高，但升高幅度小于ANG II剂量较高时的观察值(图6B类). 在急性ANG II给药的实验中，我们观察到ROS主要在脑血管中增加(11). 为了确定持续服用ANG II是否也会出现这种情况，我们将DHE微荧光成像与免疫细胞化学相结合，以获得选定的细胞标记物(11,29). 通过肉眼观察，ANG II给药14天，不仅增加了表达内皮标记物CD31的细胞中的ROS信号，而且增加了表达神经元标记物神经元核或星形胶质细胞标记物胶质纤维酸性蛋白的细胞中ROS信号(图7). 神经元、星形胶质细胞和内皮细胞ROS信号的量化表明内皮细胞和神经元ROS信号增加(图7;P（P）< 0.05). 星形胶质细胞也有增加的趋势，但变化没有达到统计学意义(图7;P（P）> 0.05).

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图6。

ANG II增加体感皮层中的活性氧（ROS），而ROS清除剂锰（I-II）中四氢（4-苯甲酸）卟啉（MnTBAP）可逆转脑血管功能障碍。A类：ANG II的缓慢加压剂量（600 ng·kg⁻¹·最小值⁻¹)在第7、14和21天增加ROS生成。ROS在第28天恢复到基线水平。B类：ANG II的非加压剂量（200 ng·kg⁻¹·最小值⁻¹)在14天时也会增加ROS，但幅度较小*P（P）生理盐水<0.05（方差分析和Tukey检验；n个=5/组）。C–F类：局部新皮质应用ROS清除剂MnTBAP（100μM）可逆转ANG II对CBF对触须刺激、ACh、缓激肽和A-23187的反应的影响。G公司：CBF对腺苷的反应不受影响*P（P）生理盐水和MnTBAP<0.05；n个=5/组。

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图7。

ANG II输注14天增加内皮细胞中ROS依赖性荧光(顶部,左边)，神经元(顶部,正确的)和星形胶质细胞(底部,左边)与溶媒输注相比。显微照片描绘了从软脑膜表面到深层皮层的体感皮层。采用二氢乙硫酸氢钠（DHE）法（静脉注射）检测ROS，CD31、神经元核（NeuN）或胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫反应分别用作内皮、神经元和星形细胞标记物。箭头表示ROS信号（DHE）与细胞标记物的共定位。钢筋尺寸=50μm。荧光信号的量化(底部,正确的)显示内皮细胞和神经元中ROS显著增加。星形胶质细胞ROS的增加没有达到统计学意义*P（P）< 0.05;n个=4-6/组。

ROS清除剂MnTBAP或NADPH氧化酶抑制剂gp91ds-tat逆转ANGⅡ诱导的脑血管功能障碍

为了确定ANG II产生的ROS增加是否与脑血管功能障碍有关，我们使用了ROS清除剂MnTBAP(4). 体感皮层与MnTBAP（100μM）的过度融合逆转了ANG II给药14天引起的脑血管功能障碍(图6,B–E类). 正如预期的那样，MnTBAP不会影响对腺苷的反应(图6F类). 因为NADPH氧化酶是ANG II产生ROS的主要来源(10)，我们检测了肽抑制剂gp91ds-tat对脑血管功能障碍的影响(11,12,33). 新皮质灌注肽（1μM），但不加控制，可逆转脑血管功能障碍(图8,A–D)不影响对腺苷的反应(图8E类). 这些发现表明NADPH氧化酶衍生的ROS参与了慢升压ANGⅡ诱导的脑血管功能障碍。

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图8。

NADPH氧化酶的肽抑制剂可对抗ANG II诱导的脑血管功能障碍。A–D：gp91ds-tat（gp91；1μM），但不是其加扰控制（s-gp91；lμM）逆转了ANG II对CBF对触须刺激、A-23187和缓激肽反应的影响。E类：CBF对腺苷的反应不受影响*P（P）生理盐水和gp91均<0.05；n个=5/组。

讨论

我们已经证明，缓慢加压剂量的ANG II可显著破坏主要脑血管调节机制，导致神经活动和内皮依赖性血管扩张剂诱导的CBF增加减弱。脑血管功能障碍先于ANG II诱导的MAP升高，在输注结束时MAP恢复到基线后仍存在。我们还发现，非加压剂量的ANG II产生的脑血管改变与缓慢加压剂量的相比，而PE升高MAP不能改变脑血管反应性。这些观察结果表明，MAP的升高不一定或不足以改变脑血管调节。脑血管功能障碍与ROS增加相平行，ROS也先于慢升压性高血压发作，并持续超过MAP正常化。有趣的是，用细胞标记物进行免疫标记表明，ROS的增加不仅发生在脑血管中，也发生在新皮质神经元中，可能还有星形胶质细胞，这与循环ANG II的血管外效应一致。总的来说，这些数据表明，缓慢加压的ANG II输注对脑循环的调节具有深远的影响，脑循环在高血压发病之前，在高血压消退后持续存在，并由氧化应激介导。

本研究的发现不能归因于小鼠生理参数的改变，因为MAP被监测，体温和血气被仔细控制。此外，功能障碍不能归因于高血压诱导的血管平滑肌结构或功能改变，因为ANG II不影响平滑肌松弛剂腺苷诱导的CBF增加。虽然神经活动对脑血管有深刻影响，但观察到ANG II不影响皮层电图的频率分布或体感诱发电位的大小，表明功能性充血的减轻不是由于神经活动受到抑制。此外，ANG II也会减弱非神经介导的反应，例如内皮依赖性血管舒张，这一事实反对神经活动在这种作用机制中的作用。本研究的一个局限性是，由于颅窗，CBF实验必须在麻醉下进行，这可能会对MAP和CBF反应性产生深远影响(18,20,35). 然而，通过遥测确定的清醒小鼠MAP增加的时间进程与麻醉小鼠的MAP增加时间进程相当，即ANG II输注14天而非7天时MAP增加，这一事实缓解了这种担忧。至于CBF反应，在生理盐水和ANG II处理的小鼠中使用相同的麻醉条件，将观察到的CBF反应差异归因于麻醉的可能性降至最低。

本研究的一项新发现是，血管紧张素Ⅱ（ANGⅡ）诱导的脑血管功能障碍和脑氧化应激先于高血压的发展，即使MAP升高已消退，也会持续存在。这一观察表明，脑血管功能极易受到循环血管紧张素II的影响。因此，CBF调节的改变可能是介导ANG II外周血管效应的神经体液失调的早期表现之一。一项研究也表明，非加压剂量的ANG II减弱了孤立基底动脉对ACh的反应(6). 我们的发现是，ANG II的剂量不足以升高血压，从而导致明显的脑血管破裂，这也突显了脑循环对ANG II诱导的失调的敏感性。由于我们没有评估其他动脉区域的血管功能，我们无法确定脑血管的调节是否比全身血管更容易受到ANG II的影响。然而，脑血管比全身血管更有能力产生NADPH氧化酶衍生的ROS(25)这可以解释他们脆弱性的增加。因此，假设全身阻力血管有助于ANG II高血压的发生，研究结果表明，在驱动高血压的神经血管和体液变化表达之前，脑血管受到影响。

我们还发现，缓慢递质剂量的ANG II输注不仅会在脑血管中诱导氧化应激，也会在神经元和可能的星形胶质细胞中诱导氧化胁迫。这与急性输注加压剂量的血管紧张素II（ANG II）的作用形成对比，后者主要在脑血管中诱导氧化应激(11,12). 除了DHE的数据外，我们的观察结果还提供了ROS参与ANG II作用的进一步证据，即ROS清除剂MnTBAP和NADPH肽抑制剂gp91ds-tat消除了脑血管功能障碍。虽然我们对gp91ds-tat的发现表明NADPH氧化酶参与ROS的生成，但循环ANG II激活神经元和星形胶质细胞中该酶的机制仍有待确定。循环中的ANG II不会穿过血脑屏障，其对血管ROS生成的影响被认为是通过激活与NADPH氧化酶相关的血管ANG II受体介导的(21). 一种可能性是，当长期输注ANG II时，其作用于血脑屏障外的脑部位，即室周器官。穹窿下器官（SFO）是室周器官之一，与缓慢升压型ANGⅡ高血压的机制密切相关(40)可以想象，皮层ROS的增加是由SFO触发的神经体液机制介导的。特别是，SFO大量投射到下丘脑室旁核，它可以释放血管活性激素，如血管加压素，并激活神经投射，从而多突触到达大脑皮层(2,34). 另一种可能性是，可能通过SFO循环ANG II，在大脑中诱导内源性ANG II生成，导致ROS的全球增加。这些问题需要在额外的实验中解决，在这些实验中，SFO在ANG II诱导的脑血管功能障碍中的作用被研究。

ANG II给药减弱了神经活动、ACh、缓激肽和A-23187产生的CBF增加，这些反应由不同的介质介导。神经活动引起的CBF增加在一定程度上由神经元NO合成酶产生的NO介导，而内皮NOS衍生NO介导对ACh的反应(12,38,39). 另一方面，在小鼠微循环中，CBF对缓激肽和A-23187的反应由环氧合酶-1途径介导(27). 因此，涉及单一血管扩张机制的改变不能解释ANG II脑血管效应的多样性。急性ANG II给药的研究表明，ANG II的脑血管效应是由过氧亚硝酸盐介导的，过氧亚硝基盐可以通过硝化对血管功能至关重要的蛋白质来改变血管反应(8,12,28). 对于慢性ANG II给药的影响，是否存在类似机制尚待确定。

通过ANG II输注观察到的血管和神经元氧化应激对ANG II诱导的高血压以及可能的原发性高血压的中枢神经系统影响具有重要意义。高血压增加大脑对缺血的敏感性，并促进认知功能障碍(15). 虽然脑血管的改变和相关的血管储备减少可能起作用，但神经元和胶质细胞的氧化应激也可能参与其中。由于ANG II慢递质模型概括了原发性高血压的一些特征(32)，我们的数据支持在高血压前期也应实施预防性治疗的观点(31)，MAP升高低于高血压阈值的情况(5). 事实上，饮食调整和运动可能有助于高血压前期患者的认知效应(36)证明了脑功能障碍的可逆性。

总之，我们已经证明，缓慢升压的ANG II输注诱导MAP的延迟升高和脑循环的关键调节机制的改变。在高血压发病之前，也可以观察到脑血管功能障碍，这种情况在服用不升高MAP的ANG II剂量时也会出现，并且会持续到MAP恢复到基线水平之后，但不是永久性的。相反，动脉压升高伴PE不能改变脑血管调节。慢升压因子ANG II诱导的脑血管功能障碍由氧化应激介导，氧化应激不仅涉及脑微血管，还涉及神经元，可能还涉及星形胶质细胞。研究结果表明，在诱发高血压之前，缓慢加压的ANG II输注以脑血管功能为靶点，突出了脑血管对ANG II损伤作用的脆弱性。尽管这些实验数据与人类高血压的相关性仍不确定，但数据支持对高血压前期患者，尤其是具有其他心血管危险因素的高危人群进行早期预防干预。

赠款

这项研究得到了国家心脏、肺和血液研究所HL-96571的支持。

披露

作者未声明任何利益冲突，无论是财务还是其他方面。

补充材料

参考文献