整合素α5β1通过增强收缩力促进癌细胞侵袭

α5β1整合素高表达导致细胞侵袭增强

为了研究α5β1表达对侵袭的影响，我们从母代乳腺癌细胞系MDA-MB-231中分离出两个亚细胞系，它们的细胞表面表达高或低数量的α5β1integrins(图3A). 在下文中，这些亚细胞系被称为α5β1^低的和α5β1^高的细胞。在这些亚细胞系之间，α5整合素的表达差异是28.4倍(图3B)β1整合素的表达差异为2.8倍(图3D). 使用细胞荧光测定法，我们确认α5β1整合素表达水平在培养100多代期间是稳定的（补充材料图S1）。本研究中的所有实验都是在通过细胞分选获得的关于α5整合素亚基表达的单个分离物中获得的细胞上进行的。在独立实验中，我们在3年的过程中总共重复了5次亲本细胞的分类，每次都能建立稳定的α5β1^低的和α5β1^高的在入侵行为上具有类似高度差异的表型（数据未显示）。这一发现证实了α5β1^低的和α5β1^高的表型可以重复获得。

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图3。

α5β1整合素表达对3D ECM细胞侵袭的影响。(一个)亲代MDA-MB-231细胞的α5整合素亚基表达。(B类)α5和(D类)α5β1的β1整合素亚基表达^低的和α5β1^高的细胞。在每个直方图中，左曲线是同型控制，填充的灰色曲线显示整合素的表达。显示了五个代表性实验中的一个。相应的条形图显示MFI值（平均值+s.e.m。，n个=5）。(C类)α5β1的百分比较高^高的与α5β1相比，细胞侵入3D ECM^低的3天后，细胞数增加。(E类)侵入剖面显示α5β1^高的细胞比α5β1更深入地迁移到三维胶原基质中^低的细胞。(F类)侵入α5β1的纵横比^高的和α5β1^低的3天后，细胞数增加。α5β1的亮场图像^高的（下部图像，深度180μm）和α5β1^低的胶原凝胶内的细胞（上图，深度68μm）。(克)α5β1的MSD^高的细胞明显多于α5β1^低的细胞。插图：α5β1的侵入速度^高的和α5β1^低的3D ECM中的单元格。图中显示了幂律指数β=1和β=2的计算斜率。(H（H）)α5β1的表观扩散系数增加^高的细胞，表明迁移速度更快。(我)α5β1的三维运动^高的细胞比α5β1细胞更持久^低的细胞，如较高的β所示*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001.

对于α5β1，能够侵入三维胶原基质的细胞百分比高出15倍^高的与α5β1相比^低的单元格(图3C). 此外，侵袭细胞的侵袭情况（累积概率）表明α5β1^高的细胞深入ECM(图3E). 侵入α5β1的纵横比^高的细胞比α5β1高4倍^低的单元格(图3F). 为了研究α5β1表达对侵袭性的影响是否是癌细胞类型特异性的，我们分离了α5β^高的, α5β1^中等的和α5β1^低的来自786-O人肾癌细胞的细胞（α5β1的9.4倍差异^高的和α5β1^低的)以及α5β1^高的和α5β1^低的来自T24膀胱癌细胞的细胞（六倍差异）（补充材料图S2）。我们发现α5β1的细胞侵袭性^高的来自786-O和T24细胞的细胞高于来自α5β1的细胞^中等的或α5β1^低的细胞，证实细胞侵袭性随着整合素α5β1在几种癌症细胞类型中的表达水平而增加。

α5β1增强了3D细胞迁移的速度和持久性^高的细胞

表征MDA-MB-231α5β1的三维迁移行为^高的和α5β1^低的细胞，我们使用延时视频分析从单个细胞的均方位移（MSD）确定迁移的速度和持续性(图3G–I). 根据细胞迁移2小时内记录的细胞轨迹计算MSD(图3G). 根据幂律关系，MSD随时间增加(Dieterich等人，2008年)、MSD=D类(t吨/t吨₀)^β，其中t吨₀是两次测量之间的时间间隔（1分钟），表观扩散率D类是衡量迁移速度的指标(图3H)指数β是持久性的度量(图3I) (Raupach等人，2007年). 表观扩散率D类α5β1增加了八倍^高的单元格(图3H)与α5β1相比，迁移速度提高了2.8倍^低的单元格(图3G，插图）。此外，α5β1^高的较高的β值反映了细胞迁移更持久(图3I). 这些结果表明，侵袭速度和持续性的增加对α5β1整合素介导的细胞侵袭性增加有显著贡献。

其他整合素在α5β1上的表面表达^高的和α5β1^低的细胞

研究是否在α5β1中观察到侵袭性增加^高的胶原蛋白结合整合素或其他ECM结合整合蛋白表达增加导致的细胞，我们测量了它们在α5β1上的细胞表面表达^高的和α5β1^低的细胞。胶原结合整合素亚基α1和α2在α5β1上的表达^高的细胞被上调（分别是2.1倍和3.5倍）(图4A)而层粘连蛋白结合整合素亚单位α6的表达没有改变(图4A)α5β1整合素亚基β4的表达降低了1.7倍^高的电池（补充材料图S3）。整合素亚基α4（数据未显示）和结合整合素的整合素αvβ3（补充材料图S3）在两个亚细胞系中的表达均较低。这些数据表明，胶原蛋白结合整合素亚单位α1和α2可能在α5β1侵袭性增加中起作用^高的细胞。因此，研究了两种整合素亚基对细胞侵袭的影响。

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图4。

亚细胞系整合素的表达和抑制α5β1整合素介导的细胞侵袭。(一个)流式细胞术分析两个亚克隆显示不同的α1、α2和α6整合素表达。展示了六个实验中的一个代表性实验。相应的条形图显示MFI值（平均值+s.e.m。，n个=6). (B类)α5β1整合素表达的流式细胞术分析^高的添加靶向整合素α5（左）、α1（中）和α2（右）的非特异性控制siRNA（顶行）或特异性siRNA（底行）后的细胞。显示了至少三个代表性实验中的一个。(C类)α2β1的流式细胞术分析^低的和α2β1^高的子克隆。显示了至少五个代表性实验中的一个。条形图显示MFI值（平均值+s.e.m。，n个=5). (D类)侵袭细胞百分比和(E类)α5β1的侵袭谱^高的添加100μM的对照抗体（黑色）或阻断整合素α5（灰色）、β1（橙色）、α1（红色）和α2（蓝色）抗体后的细胞。(F类)侵袭细胞百分比和(克)α5β1的侵袭谱^高的用对照siRNA（黑色）或靶向整合素α5（灰色）、α1（红色）和α2（蓝色）的siRNA转染的细胞。(H（H）)侵袭细胞百分比和(我)α2β1的侵袭谱^低的和α2β1^高的子克隆*P（P）<0.05, **P（P）<0.01.

抑制α5β1整合素促进的细胞侵袭

测试哪种整合素是α5β1侵袭性增加的主要原因^高的细胞，我们测量了整合素阻断抗体影响下的细胞侵袭。添加100μM抗α5阻断抗体或100μM抗β1阻断抗体后，侵袭细胞的百分比降低到用同种匹配（IgG）处理的细胞的10%₁)对照抗体。添加100μM的抗α1和抗α2阻断抗体后，侵袭细胞的百分比分别仅降至88%和65%(图4D). 加入抗α5或抗β1阻断抗体后，侵袭深度大大降低，而抗α2和抗α1抗体则降低到较小程度(图4E). 这些发现表明，α5β1整合素主要是α5βl侵袭性增加的原因^高的细胞。

使用特异性siRNA敲低α5β1中α1、α2和α5整合素亚基的表达，进一步证实了这一结果^高的细胞。3天后通过流式细胞术测定siRNA介导的敲除百分比(图4B). 与对照siRNA相比，α5整合素敲除79.3%降低了3D胶原基质中侵袭细胞的百分比，而α1亚基（86.8%）或α2亚基（66.4%）的敲除有轻微影响(图4F). α5整合素敲除也降低了侵袭深度，而α1或α2敲除的影响较小(图4G). 我们证实，α1或α2亚基的敲除不会导致其他α-整合素亚基的细胞表面表达发生变化（补充材料图S4）。使用其他四种α5特异性siRNA也获得了类似的结果（敲除66.0-79.4%，数据未显示）。我们证实，胶原结合α1和α2整合素亚基的细胞表面表达没有因α5亚基的敲低而改变（补充材料图S5）。

为了解释α2β1整合素的功能作用，我们对筛选出的α2β1MDA-MB-231亚克隆进行了实验^低的和α2β1^高的表达式。α2β1上α2整合素的表达^高的细胞比α2β1高14倍^低的单元格(图4C). α2β1中α5整合素的表达水平同样高^低的和α2β1^高的细胞系。α2β1的侵袭性^高的与α2β1相比，细胞数量增加^低的单元格(图4H，I)从而证实了我们的siRNA敲除结果。然而，α2β1^低的细胞仍然能够入侵3D ECM，这表明细胞入侵对α2整合素的依赖性不如对α5整合素的依赖性明显。

基质降解在α5β1整合素介导的细胞侵袭中的作用

据报道，细胞侵袭与膜型1基质金属蛋白酶（MT1-MMP）分泌增加有关，MT1-MMP是一种主要的胶原蛋白降解蛋白酶(Wolf等人，2003年). 在这里，我们分析了MT1-MMP细胞表面的差异表达与α5β1之间细胞侵袭性的差异有关^高的和α5β1^低的细胞。与非侵袭性癌细胞系相比，MT1-MMP的表达在选定的浸润性癌细胞株中上调（补充材料图S6）；然而，MT1-MMP的表达在α5β1之间没有差异^高的和α5β1^低的电池（补充材料图S6）。由于纤维连接蛋白是α5β1整合素的主要配体，我们还考虑了纤维连连接蛋白降解酶基质蛋白酶（MMP-7）的表达。MMP-7在α5β1上的表达增加了两倍^高的细胞与α5β1的比较^低的电池（补充材料图S6）。

通过在α5β1中加入蛋白酶抑制剂混合物（PI）来研究蛋白水解酶的整体活性^高的和α5β1^低的在侵袭试验开始之前。我们发现侵袭性α5β1的百分比^高的PI处理后的细胞数量减少，并且这些细胞没有迁移到210μm以上3D胶原蛋白基质(图5A). 侵袭性α5β1的百分比^低的PI处理后细胞增多(图5A)，但他们的入侵情况只受到了轻微影响(图5B). 尽管如此，α5β1之间的细胞侵袭性差异^高的和α5β1^低的总的来说，这些数据表明，酶消化三维胶原基质并不是侵袭这些细胞的先决条件，蛋白酶活性的差异只能在轻微程度上解释α5β1整合素促进细胞侵袭。

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图5。

酶促ECM降解和ERK1/2抑制对细胞侵袭的影响。(一个)侵袭性α5β1的百分比^高的添加蛋白酶抑制剂混合物（PI）后，细胞（红色）减少，而α5β1中侵袭细胞的数量增加^低的单元格（橙色）。(B类)侵袭曲线显示，PI-处理的α5β1^高的细胞的侵袭深度没有对照细胞（DMSO处理）深，而PI处理的α5β1的侵袭模式没有改变^低的细胞。(C–E类)侵袭性α5β1的百分比^高的加入抑制剂328005（30μM；Erk-1）、PD98059（100μM）或U0126（100μM）后，细胞（C）及其侵袭深度（D）均降低，而侵袭性α5β1的百分比^低的细胞（C）略有减少，其侵袭深度（E）仅略有改变*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001.

生长因子信号在α5β1整合素介导的细胞侵袭中的作用

生长因子受体和相关信号通路先前已被证明有助于粘附依赖性生长和细胞迁移(Festuccia等人，2005年;Gilcrese等人，2009年;Lund-Johansen等人，1990年). 为了验证生长因子信号参与α5β1整合素介导的细胞侵袭性的假设，我们抑制了细胞外信号调节激酶1和2（ERK1/2），这是EGF受体介导信号的中心蛋白。在三维胶原基质中细胞侵袭的3天内，我们向细胞中添加了30μM ERK1/2抑制剂328005、100μM MAP-激酶抑制剂PD98059或100μM MEK抑制剂U0126(图5C-E). MEK抑制剂PD98059和U0126降低了α5β1的侵袭性^高的正如侵袭细胞数量减少和侵袭深度降低所表明的那样(图5C-E). 综上所述，这些数据揭示了α5β1整合素促进细胞侵袭的可能性是由生长因子受体和ERK1/2信号介导的。

α5β1整合素对细胞形态、粘连灶和铺展面积的影响

α5β1^高的和α5β1^低的细胞在涂有I型胶原、纤维连接蛋白、RGD肽和卵磷脂的玻璃盖玻片上培养24小时。α5β1的细胞扩散区^高的胶原上的细胞比α5β1增加了两倍^低的单元格(图6A、B;P（P）<0.0001). α5β1^高的细胞显示出清晰的应力纤维和显著的局灶性粘连(图6C，右图），而α5β1^低的细胞主要表现为皮质肌动蛋白，无细胞跨膜应力纤维和弱染色的局灶性粘连(图6C，左侧图像）。然而，α5β1之间的总β-肌动蛋白含量没有差异^高的细胞与α5β1^低的电池（补充材料图S7）。

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图6。

α5β1的粘附性^高的和α5β1^低的细胞。(一个)α5β1的扩散面积^高的和α5β1^低的细胞与胶原涂层玻璃基质粘附24小时后。(B类)α5β1的代表性荧光图像^高的（右）和α5β1^低的（左）用Alexa-Fluro-546结合的卵磷脂染色的细胞肌动蛋白。这些图像用于确定扩散区域。(C类)α5β1的荧光图像^高的（右）和α5β1^低的（左）细胞肌动蛋白染色，Alexa-Fluro-546结合的卵磷脂（红色）和Hoechst 33342染色，DNA（蓝色）。局部粘连用抗长春花蛋白抗体（底部）或帕罗西汀抗体（顶部）（绿色）染色。(D类)在α5β1中，每个细胞的粘附接触数（vinculin染色）显著增加^高的与α5β1相比^低的细胞粘附在ECM蛋白上24小时后。(E类,F类)整合素α5β1的键稳定性增加（珠脱落）^高的与α5β1相比，细胞朝向抗α5抗体涂层（10μg/ml抗体）珠（E）和100μg/ml RGD肽涂层珠（F）^低的细胞。(克,H（H）)两种亚细胞系对涂有100μg/ml或50μg/ml纤维连接蛋白（g）和100μg/ml胶原蛋白（H）的珠的结合稳定性。(我)与α5β1孵育30分钟后内化RGD肽包衣珠的百分比^高的和α5β1^低的细胞。(J型,K)α5β1的典型SEM图像^低的（J） 和α5β1^高的（K） 结合或内化RGD肽珠的细胞*P（P）<0.05, ***P（P）<0.001.

α5β1^高的细胞显示成纤维细胞样的拉长表型，而α5β1^低的细胞更圆，呈上皮样(图6C). α5β1中每个细胞的局灶性粘连数量显著增加^高的细胞，独立于培养细胞的ECM蛋白(图6D). 此外，在α5β1中，黏附蛋白vinculin的表达水平较高^高的α5β1中的细胞^低的电池（补充材料图S7）。这些发现表明，显著的F-actin细胞骨架和相关的α5β1的局部粘附位点^高的细胞可能促进收缩力的产生和传递，我们随后进行了测试。

对胶原蛋白或纤维连接蛋白的粘附强度

测试α5β1之间侵袭性的差异^高的和α5β1^低的细胞与基质粘附强度的差异有关，我们使用磁镊对整合素受体结合珠施加逐步增加的力。然后我们记录了珠子从细胞上脱落的最小力。在α5β1中，α5整合素抗体和RGD肽涂层珠的分离力降低^低的细胞与α5β1的比较^高的单元格(图6E、F)而100μg/ml纤维连接蛋白涂层珠(图6G)和胶原蛋白涂层珠(图6H)在高达10nN的力下，亚细胞系之间没有差异。α5β1的粘附强度降低^低的然而，通过将包衣浓度从100μg/ml降低到50μg/ml，使珠上的纤维连接蛋白密度降低后，出现了朝向纤维连连接蛋白的细胞(图6G). 扫描电子显微镜（SEM）显示α5β1^高的和α5β1^低的细胞都能结合并内化RGD肽包衣的珠子(图6I–K)表明α5β1整合素在两个亚细胞系上都有功能。

细胞刚度在α5β1中增加^高的细胞

α5β1之间应力纤维形成的差异^高的和α5β1^低的细胞表明这两种细胞系的细胞硬度可能不同。使用磁镊微流变学测量细胞刚度(图7A). 向涂有纤维粘连蛋白的超顺磁性微球施加高达10nN的力。逐步增加力（蠕变测量）期间的胎圈位移遵循其他地方描述的幂律(Mierke等人，2008年a). α5β1^高的细胞硬度明显高于α5β1^低的单元格(图7B;P（P）<0.001). 细胞硬度随着力的增加而增加，增加量相似（α5β1为5.4倍^低的细胞和α5β1的四倍^高的细胞，图7A). 如后文所示，细胞硬度的这些差异主要归因于肌动蛋白收缩力的差异(Wang等人，2001年).

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图7。

α5β1的机械性能^高的和α5β1^低的细胞。(一个)α5β1的刚度^高的和α5β1^低的在向纤维连接蛋白包衣珠增加施力期间测量的细胞。(B类)幂律指数b条α5β1的（细胞流动性）^高的和α5β1^低的细胞与施加在纤维连接蛋白涂层珠上的力。数值表示为平均值±标准误差(C–E类)自发珠子运动的MSD（C）在α5β1中表现出较高的表观扩散率（D）和较高的持久性（幂律指数β）（E）^高的α5β1中的细胞^低的单元格*P（P）<0.05, ***P（P）<0.001.

α5β1增加了细胞骨架重塑动力学^高的细胞

采用两种方法测量细胞骨架重塑动力学。首先，我们比较了幂律指数b条用磁性镊子微流变学测量的蠕变模量。幂律指数b条表征细胞的粘弹性响应，并可以假设弹性固体的值为0，粘性流体的值为1。指数b条α5β1增加^高的细胞受到高达4nN的外力，表明这些细胞更像流体(图7B). 其次，我们分析了纤维连接蛋白涂层珠在5分钟内的自发运动，并测量了它们的MSD(图7C). 如上所述，MSD也适用于全细胞运动的幂律。表观扩散率D类(图7D)α5β1显著增加^高的表明这些细胞的细胞骨架重塑动力学增强。α5β1中MSD的幂律指数β也增加^高的与α5β1相比，与acto-myosin细胞骨架结合的珠子的运动更为定向^低的单元格(图7E). 这些数据与上述全细胞迁移数据一致(图3G–I)并表明α5β1的迁移速度增加^高的三维胶原基质中的细胞通过增加细胞骨架重塑动力学而得到促进。

收缩力在α5β1中增加^高的细胞

为了分析两种亚细胞系侵袭力的差异是否可以用其产生收缩力的能力改变来解释，α5β1的牵引^高的和α5β1^低的RGD肽包被聚丙烯酰胺凝胶上的细胞(E类=5.4 kPa）。荧光激活细胞分选（FACS）分析表明，两个亚细胞系上αvβ3整合素的表达低于检测限（补充材料图S3）。这一结果排除了αvβ3整合素影响RGD肽包被丙烯酰胺凝胶上牵引力测量的可能性。

为了表征每个细胞的收缩力，聚丙烯酰胺凝胶中因细胞牵引而储存的弹性应变能被计算为局部牵引和变形的乘积，并与细胞的伸展面积积分(Butler等人，2002年). α5β1的应变能^高的细胞比α5β1高7倍^低的单元格(图8A、B). 即使在对扩展区域的差异进行归一化后，α5β1的应变能^高的细胞仍比α5β1高3.5倍^低的细胞。

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图8。

α5β1收缩力生成增加^高的细胞和抑制收缩力介导的细胞侵袭。(一个)α5β1的代表性牵引场^低的细胞（左）和α5β1^高的单元格（右侧）。灰线表示单元边界。插图显示了被测单元格的亮场图像。(B类)α5β1每个细胞的应变能（平均值+s.e.m.）^高的单元格(n个=80）比α5β1增加7倍^低的单元格(n个=84). (C类)胶原凝胶顶部（顶行）或凝胶侵入3天后（底行）粘附细胞的调制对比度图像显示，在使用肌球蛋白收缩抑制剂ML-7或Y27632治疗后，没有形态学变化。(D类)侵袭性α5β1的百分比（平均值+标准偏差）^高的细胞或α5β1^低的以100μM Y27632、15μM ML-7或DMSO作为对照，在3天后测定细胞。(E类,F类)α5β1的侵入剖面^高的（E） 和α5β1^低的（F） 以Y26732、ML-7或DMSO处理的细胞作为对照。(克)α5β1的侵袭细胞百分比（平均值±s.e.m.）^高的或α5β1^低的在肌动蛋白聚合抑制剂（2μM latrunculin B）、肌球蛋白磷酸酶抑制剂（1 nM calyculin A）或二甲基亚砜（DMSO）存在的情况下，3天后测定细胞。(H（H）,我)α5β1的侵袭谱^高的（H） 和α5β1^低的（一） 以latrunculin B、calyculin A或DMSO处理的细胞为对照。(J型)使用无血清培养基（SF）不会改变侵袭细胞的百分比。(K)无血清条件降低侵袭性α5β1的侵袭深度^高的细胞而非α5β1^低的单元格*P（P）<0.05, ***P（P）<0.001. 比例尺：20μm。

将肌球蛋白轻链激酶（MLCK）抑制剂ML-7或ROCK抑制剂Y27632添加到α5β1^高的细胞显著减少(P（P）<0.001）侵袭细胞进入三维胶原基质的百分比(图8D). 在α5β1中^低的细胞，只有ML-7而不是Y27632导致侵袭性细胞的百分比略有下降(图8D). ROCK和MLCK抑制剂没有改变α5β1的侵袭分布^低的细胞，而这两种抑制剂都能减少α5β1的侵袭^高的细胞进入三维胶原基质的深层区域(图8E、F). 这些影响不是由细胞粘附受损引起的，因为在添加抑制剂后，两种亚细胞系仍然能够附着并扩散到三维胶原基质的表面(图8C，顶部图像）。此外，抑制剂没有引起侵袭细胞的细胞形态改变(图8C，底部图像）。肌动蛋白聚合抑制剂latrunculin B（2μM）的添加降低了侵袭性α5β1的百分比^高的细胞并降低其侵袭深度，而侵袭性α5β1的百分比^低的细胞及其侵入深度未受影响(图8G–I). 这些结果表明α5β1^高的细胞对MLCK介导的MLC磷酸化和去磷酸化以及肌动蛋白收缩的变化敏感。

通过添加丝氨酸/苏氨酸磷酸酶抑制剂calyculin A（1nM），进一步研究了细胞侵袭对MLC磷酸化的亚细胞特异性依赖性减少MLC的去磷酸化，从而增加收缩性(Inutsuka等人，2009年). Calyculin A治疗增加侵袭性α5β1的百分比^低的细胞，也增加了其侵袭深度，但对α5β1几乎没有影响^高的单元格(图8G–I). 这表明α5β1的收缩性增加^低的细胞增强其侵袭性，而α5β1的收缩性^高的这些数据表明，α5β1整合素介导的侵袭性增加是由于收缩力的增加。

纤维连接蛋白在α5β1整合素介导的细胞侵袭中的作用

α5β1整合素通过ECM蛋白纤连蛋白附着在3D胶原纤维上。本研究中使用的细胞培养基补充了10%胎牛血清，并含有大量纤维连接蛋白。使用无血清培养基时，侵袭细胞的百分比没有改变(图8J); 然而，α5β1的侵入深度^高的细胞而非α5β1^低的细胞减少(图8K). 这表明纤维连接蛋白的存在对α5β1整合素介导的细胞侵袭很重要，并导致了α5β^高的细胞分泌大量纤维连接蛋白。

α5β1筛选的MDA-MB-231、T24和786-O癌细胞上清液中的纤连蛋白浓度^高的, α5β1^中等的和α5β1^低的细胞侵入三维胶原基质后3天，用ELISA法进行检测。细胞最初在无血清培养基中培养，但培养3天后，所有亚细胞系都分泌大量纤维连接蛋白，α5β1之间没有显著差异^高的和α5β1^低的单元格(图9A). 在MDA-MB-231细胞中也获得了类似的结果，其中α5整合素亚基被五种不同的siRNA结构敲除(图9B). 这些结果表明，α5β1亚细胞系侵袭力的差异不是由纤维连接蛋白分泌的差异引起的。

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图9。

ECM蛋白和胶原密度对α5β1整合素促进细胞侵袭的影响。(一个)侵袭3D胶原基质3天后，T24、MDA-MB-231和786-O癌细胞分泌的介质中纤维连接蛋白的浓度，α5β1整合素表达低、中、高。(B类)siRNA介导的α5整合素敲除3天后，培养基中分泌的纤连蛋白浓度。非特异性siRNA作为对照，使用五种不同的siRNA进行特异性α5敲除（α5 si1–si5）。(C类)在含有100μg/ml纤维连接蛋白（嵌入）或RGD肽（嵌入）的3D基质中，侵袭细胞的百分比显著增加，而在含有100微克/毫升卵磷脂（嵌入）3D基质中则略有增加。(D类)对0.6、1.2、2.4、3.7和5.8 mg/ml的五种不同胶原蛋白浓度进行细胞侵袭测试。3天后，α5β1^高的细胞能够侵入1.2–5.8 mg/ml胶原凝胶，而α5β1^低的细胞能够迁移到0.6-3.7mg/ml的胶原凝胶中。(E类–H（H）)α5β1的侵袭谱^高的（E） 和α5β1^低的（G） 添加纤维连接蛋白、RGD肽或卵磷脂不会改变细胞。α5β1的侵入剖面^高的（F） 和α5β1^低的（H） 如图所示，3D ECM中的细胞胶原浓度增加。(我)3D纤维连接蛋白-胶原基质的共焦图像。左：反射模式显示胶原纤维。右：同一基质的抗纤维连接蛋白染色的荧光图像(J型)具有侵袭性α5β1的3D胶原基质的共焦图像^高的单元格。左：反射模式显示基体纤维和单元。中间：同一基质和细胞的纤维连接蛋白染色。右：同一视野的亮场图像。(K）左图：侵袭性α5β1的百分比^高的和α5β1^低的在含有100μg/ml可溶性纤维连接蛋白或100μg/ml可溶性RGD肽的3D基质中，细胞数量显著减少。α5β1的侵袭谱^高的（中间）和α5β1^低的细胞（右）在添加可溶性纤连蛋白和RGD肽后显示出侵袭性降低。条形图显示平均值+s.e.m**P（P）<0.01, ***P（P）<0.001.

为了测试大浓度纤维连接蛋白的效果，我们在胶原蛋白聚合步骤之前添加0.1 mg/ml纤维连连接蛋白、RGD肽或玻璃体凝集素（与α3β1整合素结合）。未结合的基质蛋白或肽在α5β1之前被洗掉^低的或α5β1^高的细胞接种到基质上。纤维连接蛋白或RGD肽的存在显著增加了侵袭性α5β1的百分比^低的和α5β1^高的细胞转化为三维胶原基质的2.4至3.8倍。我们用共焦显微镜和免疫荧光染色证实，纤维连接蛋白确实并入胶原基质中(图9I). 此外，我们发现在无血清条件下，细胞周围三维胶原基质的纤维连接蛋白染色增强(图9J，中间和右边的图像），表明侵袭细胞分泌纤连蛋白，并且这种纤连蛋白与3D基质结合。然而，玻璃体凝集素的存在并没有进一步的侵袭增强作用(图9C、E、G). 总之，这些数据证实了基质中α5β1整合素配体纤维连接蛋白或RGD肽的存在对细胞侵袭起着关键作用。相比之下，在侵袭试验开始时添加可溶性纤维连接蛋白或RGD肽可降低α5β1的侵袭性^高的和α5β1^低的单元格(图9K).

细胞侵袭试验

为了制备5.8 mg/ml 3D胶原蛋白基质，将0.775 ml胶原蛋白-R（2 mg/ml大鼠I型胶原蛋白；德国海德堡Serva）、1.95 ml胶原蛋白R-（10.68 mg/ml大鼠I型胶原；德国海德堡Becton Dickinson）和0.775胶原蛋白-G（4 mg/ml牛I型胶原，Biochrom）混合。添加0.4 ml NaHCO后_三缓冲液（26.5 mM）和0.4 ml 10×DMEM，使用130μl 1N NaOH中和混合物，用移液管移到3.5 cm培养皿中，并在37°C、5%CO下聚合₂95%湿度下放置2小时。将3D胶原基质与2ml DMEM孵育过夜(Mierke等人，2008c). 其他胶原蛋白浓度较低的基质（0.6、1.2、2.4和3.7 mg/ml）通过用PBS缓冲液和10×DMEM稀释5.8 mg/ml的非聚合胶原蛋白混合物获得。将100000个癌细胞接种在3D胶原基质上，并在37°C、5%CO下培养72小时₂含10%FCS的DMEM中湿度为95%。在这个时期，细胞侵袭力的差异是显而易见的。非侵袭性细胞可以很容易地通过细胞核进行识别，细胞核位于一层，与最顶层胶原纤维的位置一致。当细胞核位于非侵入性细胞形成的层下方时，细胞被视为侵入性细胞。由于40×0.6 NA物镜的景深，该方法的不确定度约为5μm。这些3D ECM基质还含有从培养基中胎牛血清中分离的纤维连接蛋白和从癌细胞中分泌的纤维连蛋白（另见共聚焦图像，图9I). 由于纤维连接蛋白是α5β1整合素的主要配体，因此矩阵适合分析α5β1-依赖性细胞行为。为了更详细地分析整合素配体的功能，在存在100μg/ml纤维连接蛋白、RGD肽或玻璃体凝集素的情况下，也聚合3D胶原基质。对于无血清细胞侵袭，细胞在侵袭试验前24小时和期间在EX-cell293培养基（SAFCBiosciences，Lenexa，Kansas）中用100 U/ml青霉素-链霉素培养。在PBS缓冲液中用2.5%戊二醛溶液固定后，在12个随机选择的视野中测定侵袭细胞的百分比及其侵袭深度。为了确定侵袭细胞的百分比，还对三维胶原基质顶部的粘附细胞进行了计数。侵入剖面图仅包含侵入细胞。条形图中给出了未侵入细胞的百分比。

在图2侵袭性和非侵袭性细胞系的分离基于侵袭性评分，侵袭性评分定义为侵袭深度乘以每1mm的细胞数密度²(Mierke等人，2008c).

细胞侵入2.4 mg/ml三维胶原基质3天后，测定细胞的纵横比。我们首先通过一个侵袭性细胞确定光学切片，该细胞在x–年平面。根据该图像，我们将纵横比计算为最大间距（长轴）的单元轮廓上两点之间的距离除以垂直于长轴的最大单元尺寸。

偏移速度和均方位移

约10000α5β1^低的或α5β1^高的聚合前将细胞接种到胶原蛋白凝胶中。按上述方法处理含有嵌入细胞的基质。细胞运动是使用基于傅里叶差分-内插算法从10倍放大率记录的相控图像中计算出来的(Raupach等人，2007年). 细胞随时间运动的MSDt吨用幂律关系MSD描述=D类(t吨/t吨₀)^β(Dieterich等人，2008年;Oakes等人，2009年;Potdar等人，2010年)，其中t吨₀是图像录制的时间间隔（1分钟），D类是表观扩散系数，幂律指数β是持久性的度量，其中β~1表示随机迁移，β~2表示弹道迁移细胞(Raupach等人，2007年). 可以从MSD的平方根获得任何时间段上的平均迁移速度。肿瘤细胞的MSD显示，迁移过程不是布朗随机游走，而是超扩散的，这是由于迁移速度的方向持续性和时间波动。

酶联免疫吸附试验

细胞侵袭3天后，从每个亚细胞系的100000个细胞中收集上清液。根据制造商的说明（研发系统），使用纤维结合蛋白Elisa试剂盒测定纤维结合蛋白浓度。

流式细胞术

收集80%的融合细胞，并将其重新悬浮在HEPES缓冲液中（20 mM HEPES、125 mM NaCl、45 mM葡萄糖、5 mM KCl、0.1%白蛋白、pH 7.4）。用鼠抗人整合素α1（FB12）、α2（P1E6）、α3（17C6；Biozol）、α4（P1H4）、α5（Biozole）、α6（MP4F10；R&D）、β1（Biozol）、αvβ3（LM609）、β4（R＆D）和αvβ5（P1F6。使用同种匹配抗体作为对照（Caltag、Burlingame、CA）。在4°C下30分钟后，用R-藻红蛋白标记的山羊抗鼠IgG[F（ab）对细胞进行清洗和染色₂-碎片；Dianova]。使用FACSCalibur系统（BectonDickinson，Heidelberg，德国）进行流式细胞术。

肿瘤细胞变体的分离

使用细胞分选仪从亲代MDA-MB-231（乳腺）、786-O（肾脏）和T24（膀胱）癌细胞中分离出α5β1整合素表达高、中、低的肿瘤细胞变体，并将单个细胞镀入96个平板。扩增细胞，流式细胞仪检测α5整合素的表达。对α5β1整合素的细胞表面表达的重复测量证实，亚细胞系的α5βl表达表型在至少100代内保持稳定（补充材料图S1）。

siRNA转染

约200000 80%汇合α5β1^高的将细胞接种到3.5-cm培养皿中，并在2ml DMEM完全培养基中培养。5μl含有20μMα5整合素的溶液（靶序列为：nr.1，5′-CCCATTGAATTTGACAGCAAA-3′；nr.2，5′-TGGCACAAAAGAACTAA-3′；nr.3，5′-CAGCCCAGACATACTTGAA-3′，nr.4，5′-AATCCTTATGGCTCACACAT-3′；和nr.5，5′-cAGGTTACCTACCTGCA-3′），α1-整合素（5′-TTGACTTAATCACGAT-3′），将α2-整合素（nr.1，5′-TCGCTAGTATTCCAACAAAA-3′和nr.2，5′-CCCGAGCACATCATATA-3′）或Allstar对照RNAi溶液（对照siRNA）、12μl HiPerFect-Reagent（Qiagen）和100μl DMEM混合(Mierke等人，2008c). 使用抗α5整合素、抗α1整合素或抗α2整合素和Cy的流式细胞术证实RNAi介导的α5、α1和α2整整素敲除₂-标记的抗鼠IgG抗体（Dianova）。使用20μM Alexa-Fluro-546标记的siRNA，流式细胞术测定转染效率>99%。

细胞侵袭的调节

为了抑制或调节细胞侵袭，我们在细胞接种前向胶原蛋白侵袭试验中添加了15μM ML-7（钙生物化学）、100μM Y27632（西格玛）、2μM latrunculin B（西格马）、1 nM calyculin A（钙生物化）或10-20μM ERK抑制剂328005（钙生物化工）。在存在或不存在100μl整合素α5（MAB1956Z克隆P1D6，Millipore）、β1（MAB2253Z克隆6S6，Millipore）、α1（MAB1973Z克隆FB12，Milliopre）和α2（MAB1950Z克隆P1E6，Milliepore）阻断（抑制）抗体的情况下，分析整合素对细胞侵袭的影响。同型匹配抗体作为对照（Millipore）。

抑制酶降解

为了抑制3D胶原蛋白基质的酶降解，我们在入侵检测开始之前添加了蛋白酶抑制剂鸡尾酒（PI）。PI鸡尾酒含有50μM GM6001（广谱基质金属蛋白酶抑制剂）、250μM E-64、2μM亮肽、100μM PepstatinA和2.2μM抑肽酶（均来自Calbiochem）(Bloom等人，2008年;McNulty等人，2009年;Wolf等人，2003年).

免疫荧光

将约20000个细胞接种到涂有50 mg/ml I型胶原、50μg/ml纤维连接蛋白（罗氏）、50μg/ml RGD肽（Ac-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Ala-Ser-Ser-Lys-（Gly）4-Ser-D-Arg-（Leu）6-D-Arg-NH的玻璃盖片上₂; 肽国际，路易斯维尔，肯塔基州）或5 mg/ml维生素C，37°C下2小时。24小时后，用3%PFA固定细胞（20°C下15分钟），用0.1%Triton X-100渗透5分钟，20°C用抗长春花碱或paxillin（Chemicon）抗体（1:200）染色30分钟，然后用Cy2标记抗体和66 nM Alexa-Fluro-546–phalloidin染色（MolecularProbes，俄勒冈州尤金市）。Hoechst-33342染色后（20°C下5分钟），细胞嵌入Mowiol中。随机记录10-20个视野（20倍或40倍放大）。使用MATLAB编写的自定义图像分析软件计算展开面积。使用自定义图像分析程序从帕罗西林染色的细胞中确定每个细胞的局灶性粘附数。当连接像素的荧光强度超过至少0.5μm的区域时，对图像进行高通量过滤，并检测和计算焦点粘连²高于固定阈值。

对于共焦显微镜，细胞和3D基质在20°C下用纤维连接蛋白抗人抗体（1:200；Sigma）染色60分钟，然后用R-藻红蛋白标记的山羊抗鼠IgG抗体（F（ab））染色₂-碎片，1:200；Dianova）在20°C下保持60分钟。共聚焦图像由配备20×1.00NA水浸物镜的共聚焦显微镜（Leica TCS SP5 II）拍摄。

磁性镊子

使用磁镊，将0.5至10nN的步长施加到超顺磁性环氧树脂化4.5μm珠上，该珠涂有胶原蛋白（100μg/ml）、RGD肽（50μg/ml(Kollmannsberger和Fabry，2007年;Mierke等人，2008年a;Mierke等人，2008c). 2×10⁵对珠子进行超声波处理，添加到10个⁵细胞，并在37°C和5%CO下培养30分钟₂。使用倒置显微镜（DMI-Leica）在37°C下进行测量。蠕变响应J型(t吨)在施力过程中，细胞的数量在时间上遵循幂律，J型(t吨)=一(t吨/t吨₀)^b条，其中前置因子一幂律指数b条与力相关，参考时间t吨₀设置为1秒。珠子对阶梯状力的位移遵循幂律的叠加(希尔德布兰特，1969年)从中可以看出一和b条由最小二乘拟合确定(Mierke等人，2008年a). 参数一（单位为微米/纳米牛顿）表征了弹性电池的特性，并对应柔度（刚度的倒数）(Mierke等人，2008年a).

力-距离关系（单位为纳米牛顿/微米）通过几何因素与单元刚度（单位为帕斯卡）相关，该几何因素取决于珠子与单元之间的接触面积（或珠子内部化程度）和单元高度。如果这些参数已知，例如通过扫描电子显微照片(图6J、K)，可以通过有限元分析估计几何因子(Mijalovich等人，2002年). 在不了解单元高度和珠子内部化的情况下，仍然可以将典型应变ε估计为珠子位移d日除以胎圈半径第页，典型应力σ作为作用力F类除以胎圈横截面积π第页²使电池刚度克=σ/ε=第页/d日×·F类/(π第页²) (Kasza等人，2009年). 对于我们研究中使用的4.5μm珠子，几何因子为0.14μm⁻¹表观刚度为1 nN/μm的电池的“适当”刚度为140 Pa(图7A).

幂律指数b条反映了与珠子相连的受力细胞结构的稳定性。的值b条=1和b条=0分别表示牛顿-粘性和弹性行为(Fabry等人，2001年). 非零幂律指数意味着在施加磁力期间，部分变形能量并没有弹性地存储在细胞骨架中，而是由于珠子连接的细胞骨架结构的重塑而以热的形式耗散(Kollmannsberger和Fabry，2009年). 因此，耗散与细胞骨架中的弹性键断裂和翻转的速度直接相关。acto-myosin键的转换也有助于耗散特性(Fredberg等人，1996年)而且，尽管这不被认为是一种重塑事件，但它能使细胞骨架中收缩性驱动的形状改变。

粘附强度

大约50000到100000个细胞接种在3.5厘米的培养皿中。1天后，在37°C、5%CO下用涂有ECM蛋白或抗体的珠培养细胞30分钟₂和95%湿度。在施加0.5至10nN的力的过程中，测量包被纤连蛋白、RGD肽、I型胶原或抗α5-抗体的珠子从细胞上的脱离。然后我们记录了珠子从细胞上脱落的最小力。分离的珠子相对于分离力的百分比用于量化珠子与细胞的结合强度。

我们验证了该方法通过在添加纤维连接蛋白珠之前使用阻断抗体（10μg/ml，MAB2253Z克隆6S6；Millipore）阻断β1整合素受体来特异性测量整合素介导的粘附力的能力，并发现破裂力显著降低。此外，我们在添加涂有纤维连接蛋白、RGD肽或抗α5抗体的珠之前添加可溶性纤维连接到蛋白，或者我们在添加I型胶原蛋白珠之前添加I型可溶性胶原蛋白。在所有情况下，分离力都显著降低（补充材料表S2）。

自发微珠扩散

将约300000个细胞接种到含有CO的3.5厘米培养皿中₂-独立培养基，在37°C，5%CO下培养过夜₂湿度为95%。与纤维连接蛋白或RGD肽涂层珠在37°C、5%CO下孵育30分钟后₂在95%湿度下，跟踪珠子的位置超过5分钟。珠子自发移动，MSD也遵循时间幂律=D类(t吨/t吨₀)^β+c（c）MSD随时间的演变，t吨可以用表观扩散率来描述，D类运动的持续性可以用幂律指数β来描述。加法项c（c）反射来自热源和非热源（例如单个肌球蛋白马达）的随机噪声，以及t吨₀被任意设置为1秒。拟合参数由最小二乘拟合确定(Raupach等人，2007年). 在珠子结合至少30分钟后，测量珠子的自发运动，这足以将珠子连接到细胞骨架。一旦珠子牢固地连接到细胞骨架上，连接的细节几乎无关紧要，不会影响珠子的运动(Metzner等人，2010年).

牵引显微镜

丙烯酰胺（4.7%）–双丙烯酰胺（0.24%）凝胶浇注在非静电硅烷涂层玻璃载玻片上(Pelham和Wang，1997年). 凝胶的杨氏模量为5.4 kPa。将黄色绿色荧光0.5μm羧基化珠（Invitrogen）嵌入凝胶中并离心（300克)在4°C聚合期间朝向凝胶表面(Mierke等人，2008年a;Mierke等人，2008c). 这些珠子是凝胶变形的标志。凝胶表面用磺化SANPAH（德国波恩皮尔斯）活化，并涂上50μg/ml RGD肽。

FACS分析表明，αvβ3整合素在两个亚细胞系上的表达低于检测限。这排除了αvβ3整合素影响RGD涂层丙烯酰胺凝胶上牵引力测量的可能性（补充材料图S4）。

细胞粘附到凝胶上后，根据在胰蛋白酶/EDTA中用8μM细胞松弛素-D和15μM ML-7对细胞进行力松弛和分离前后测得的凝胶表面位移计算细胞牵引力(Butler等人，2002年). 使用基于Fourier的差分-互插图像分析测量凝胶变形(Raupach等人，2007年). 实验在37°C，5%CO下进行₂含10%FCS的DMEM在显微镜级培养箱中的湿度为95%。

透射电子显微镜

细胞固定在4%PFA和0.1%戊二醛中，后固定在2%缓冲四氧化锇中，通过梯度乙醇系列脱水并嵌入环氧树脂中。为了定向，1.0μm切片用甲苯胺蓝染色。用乙酸铀酰和柠檬酸铅对70 nm的超薄切片进行染色，并通过透射电子显微镜（TEM）进行检查（EM906E；蔡司，德国奥伯科钦）。

扫描电子显微镜和珠子内化

用乙醇系列对三维胶原基质中2.5%戊二醛固定细胞进行脱水，用六甲基硅氮烷试剂（宾夕法尼亚州哈特菲尔德市电子显微镜科学公司）清洗，并用空气干燥(Mierke等人，2008c). 溅射镀金后，使用扫描电子显微镜（SEM）（ISI-SX-40，加利福尼亚州米尔皮塔斯国际科学仪器公司）对细胞进行分析。用涂有50μg/ml RGD肽的珠培养细胞30分钟，并测定内化珠的百分比。

我们感谢Ursula Schlötzer-Schrehardt对TEM的帮助，Philip Kollmannsberger对磁镊实验的帮助，Robert Schmiedl对SEM的帮助，Wolfgang H.Goldmann的有益讨论，Ulrike Scholz的秘书协助，Barbara Reischl、Christine Albert和Werner Schneider的技术协助。这项工作得到了Deutsche Forschungsgemeinschaft的支持(FA336/2-2型;,SFB643系列以及“卓越集群”拨款“先进材料工程”）(107384; 和109432)，欧盟委员会(TPA4 FP6型)，国立卫生研究院拨款NIH-HL65960托马斯·维尔迪研究所e.V.、埃朗根-纽伦堡大学ELAN拨款和IZKF内部拨款。存放在PMC中，12个月后发布。