分泌途径蛋白质的合成始于它们移位到内质网（ER）。一旦进入内质网，这些蛋白质被折叠、修饰并组装成复合物，以便它们能够在分泌途径中的靶区发挥作用。蛋白质可以在退出核糖体时以共翻译的方式转移到内质网，或者在多肽合成完成后以翻译后的方式转移(50). 在共翻译易位过程中，信号识别颗粒（SRP）结合新生多肽上的信号序列，并通过与SRP受体（SR）相互作用将多肽/核糖体复合物靶向内质网易位孔(37). 易位孔本身由异三聚体Sec61复合体（Sec61、Sbh1和Sss1）组成，易位还需要Sec63和BiP的活性(13,14,16,17,41,44). 相反，翻译后易位与SRP无关。在这种情况下，Hsp40和Hsp70型伴侣将完全合成的肽维持在可溶性状态，能够进行易位(2,6). 这些多肽通过与Sec63/Sec62复合物（由Sec63、Sec62、Sec71和Sec72组成）的相互作用传递到转运孔(18——20,23). 有趣的是，酿酒酵母缺乏Sec71和Sec72的细胞是可以存活的，这表明它们在蛋白质移位中的功能不是必需的。新生多肽主要基于其新兴信号序列的疏水性，以共翻译或翻译后易位机制为靶点。具有高疏水性信号序列的蛋白质结合SRP并进行共翻译易位；含有较少疏水性信号序列的多肽与SRP的相互作用效率较低，并且靶向翻译后易位途径(34). 在酵母中，这两种途径似乎同等重要，一些蛋白质利用这两种机制进行移位。然而，在哺乳动物中，大多数蛋白质是共翻译易位的(50). 尽管易位机制的核心成分已经明确，但其他调节剂可能仍有待确定。例如，Yet1、Yet3和Ylr301w与酵母中的Sec63/Sec62复合物相互作用，尽管它们在蛋白质移位中的功能尚不清楚(47,48). 此外，Sec63的磷酸化增强了其与Sec62的结合，表明该复合物的活性受到调节体内(46). 在本研究中，我们表明，Hph1和Hph2这两个具有未知分子功能的完整ER膜蛋白是Sec63/Sec62复合物的新的相互作用伙伴，可能在易位中发挥作用。
Hph1和Hph2是环境胁迫下细胞生存所需的同源蛋白(三,5,8,24,38). 它们具有重叠的功能，缺乏这两种功能的细胞都可以存活，但在碱性、盐碱和细胞壁应激时会出现生长缺陷(24). Hph1（而非Hph2）与钙调神经磷酸酶（Ca）相互作用并作为其底物2+/激活特定应激反应的钙调素依赖性丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(10,24). 钙调神经磷酸酶正向调节Hph1。Hph1突变体（Hph1ΔPVIAVN)既不与钙调神经磷酸酶相互作用，也不被钙调神经蛋白去磷酸化，不能完全修复马力1Δ马力2碱性pH或高盐条件下的Δ电池(24). 因此，Hph1和Hph2是应激生存所必需的；然而，它们的分子功能仍然未知。在这里，我们报告了对马力1Δ马力2Δ细胞，其表型与空泡质子ATP酶（V-ATP酶）活性缺陷突变体相似。
酵母V-ATPase是一种多亚单位复合物，其功能、结构和组装已被很好地表征。V-ATP酶活性受损的细胞（Vma−)液泡不能酸化，不能在碱性pH下生长，对高浓度细胞外钙敏感。此外，Vma−突变体不能使用非发酵碳源，对高浓度重金属、氧化应激和细胞壁损伤剂敏感(29,32). 酵母V-ATP酶由外围相关的V组成1复合体与积分膜V0复杂(29). V型0复合物由蛋白脂质c环（Vma3、Vma11和Vma16）、Vma6、Vma9和a亚基（Vph1或Stv1）组成。含有Vph1的ATP酶使液泡酸化，而含有Stv1的V-ATP酶定位于内体和囊泡(30,31). 一组专用蛋白因子组装V0在内质网内，任何这些（Vma12、Vma21、Vma22、Voa1或Pkr1）的缺失都会严重损害V-ATP酶的功能(11,22,27,28,40). V之后0组装好后，Vma21和Voa1将其从内质网中以COPII囊泡的形式输出到高尔基体(40). V区细胞缺陷的标志之一0组装是指通过ER相关降解（ERAD）途径快速降解未组装的Vph1(26). 未组装Vph1的不稳定性在缺乏组装因子或V亚单位的细胞中很明显0复杂。在这项研究中，我们发现Sec63/Sec62复合物中的缺陷会导致Vph1不稳定，这表明这种易位复合物的底物有助于V0生产。我们进一步证明，Hph1和Hph2在该过程中与Sec63/Sec62复合物一起作用。
材料和方法
生长介质和一般方法。
酵母培养基和培养条件基本上与前面描述的相同，只是在合成完全培养基中使用的氨基酸和核苷酸水平是前者的两倍(43). 酵母的转化是通过醋酸锂法进行的(1). 酵母菌株列于; 从Open Biosystems（亚利桑那州亨茨维尔）购买酵母缺失收集的菌株。
表1。
| 应变 | 基因型 | 参考 |
|---|
| BY4741（YSC1048） | 材料一吕2Δ尿酸3Δ他的3Δ符合15Δ | 酵母缺失收集（Open Biosystems） |
| BY4742（YSC1049） | 材料α吕2Δ尿酸3Δ他的3Δ溶血素2Δ | 酵母缺失收集（Open Biosystems） |
| VHY70型 | 材料一吕2Δ尿酸3Δ他的3Δ | 24 |
| VHY60型 | 材料一吕2Δ尿酸3Δ他的3Δ符合15Δ马力1Δ::KanMX4马力2Δ::KanMX4公司 | 24 |
| 马力1Δ（编号1621） | 与BY4741同基因 | 酵母缺失收集（Open Biosystems） |
| 马力2Δ（编号380） | 与BY4741同基因 | 酵母缺失收集（Open Biosystems） |
| pkr1型Δ（编号6564） | 与BY4741同基因 | 酵母缺失收集（Open Biosystems） |
| 秒71Δ（编号3311） | 与BY4741同基因 | 酵母缺失收集（Open Biosystems） |
| 高功率1Δ马力2Δ秒71Δ | 材料一吕2Δ尿酸3Δ他的3Δ马力1Δ::KanMX4马力2Δ::KanMX4第71秒Δ::KanMX4公司 | 本研究 |
| 马力1Δ马力2Δpkr1号机组Δ | 材料一吕2Δ尿酸3Δ他的3Δ马力1Δ::KanMX4马力2Δ::KanMX4包装1Δ::KanMX4公司 | 本研究 |
| vma21型Δ（编号4735） | 与BY4741同基因 | 酵母缺失收集（Open Biosystems） |
| BY4743公司-第71节——TAP | 材料一/α吕2Δ/亮氨酸2Δ尿酸3Δ/尿酸3Δ符合15Δ/MET15赖氨酸2Δ/LYS2第71节::TAP接头::HIS3MX6/第71节 | 本研究 |
| BY4743公司-第72节——TAP | 材料一/α吕2Δ/吕2Δ尿酸3Δ/ura3型Δ符合15Δ/MET15 lys2Δ/LYS2第72节::TAP接头::HIS3MX6/第72节 | 本研究 |
| BY4743公司-第61节——AP | 材料一/α吕2Δ/吕2Δ尿酸3Δ/尿酸3Δ符合15Δ/MET15 lys2Δ/LYS2第61节::TAP接头::HIS3MX6/第61节 | 本研究 |
| BY4743公司-第62节——TAP | 材料一/α吕2Δ/吕2Δ尿酸3Δ/尿酸3Δ符合15Δ/MET15赖氨酸Δ2/LYS2第62节::TAP接头::HIS3MX6/第62节 | 本研究 |
| BY4743公司-第63节-塔普 | 材料一/α吕2Δ/吕2Δ尿酸3Δ/ura3型Δ符合15Δ/MET15赖氨酸Δ2/LYS2第63节::TAP接头::HIS3MX6/第63节 | 本研究 |
本研究中使用的质粒描述如下.所有基因最初通过扩增克隆Taq公司具有指定限制位点的高效聚合酶（Invitrogen，Beverly，MA）。谷胱甘肽S公司-用正向引物5′-CTAGTCTAGTCTAGAATGTCCCCTATACTAGGTTGG-3′和反向引物5’-CTAGTTCTAGACAGATCCCGATTTGGGATGGTG-3′从质粒pES298-9中扩增出转移酶（GST）编码序列，两侧有XbaI限制性位点，并克隆到pUG34或pUG36中(CEN URA3 pMET25-yEGFP或欧洲标准化委员会HIS3 pMET25-yEGFP; U.Güldener和J.H.Hegemann的礼物），用XbaI消化并纯化凝胶以去除绿色荧光蛋白（GFP）编码序列，从而分别生成pFJP10和pFJP13。高致病性H1作为BamHI/HindIII片段从pVH1亚克隆到pFJP10或pFJP13，以生成pFJP11和pFJP14。马力11ΔPVIAVN公司作为BamHI/XhoI片段从pVH12亚克隆到pFJP10以生成pFJP12。GST-HPH2由生成体内VHY70酵母细胞中的重组。GST编码序列被扩增，两侧是MET25型5′端启动子序列与HPH2型3′端的序列，用于pVH2（用XbaI消化并纯化凝胶）与政府间贸易VHY70中的PCR产物生成pFJP20（正向引物，CATCTACTATTCTCTCGTGTGTATAGAGGTCAGATATAGATATTAT TACCCCACTACTAGATGTCCCCTATACTAGGTTG；反向引物，CCATCTTGCTATTGTGTACTGTACCATCTCTGCTGCCTTTAGAGCTCTTTATTGAGCTATTGCATTTGCTAGTGTGCTAGTGCTATTGTGTGTGTGCATGCGCATGTGCATGTGTGCGCATGCATGTGGATCGACTGCTACTAGT TCCACTAGT TACTAG TCCAGCTAGCTACTGTGT TCGAGTGTGTG）。或者，HPH2型是从pVH2中扩增的PCR，两侧是政府间贸易5′端编码序列和CYC公司3′端的终止序列，用于pFJP10（用BamHI消化并纯化凝胶）与HPH2型VHY70中的PCR产物（正向引物GCATGGCTTTGCAGGGCTGTGGGCTGCAAGCAGCCACGTGGTGGCGACATCCAAAATCGGATCTGTCTAGAACTACTAGTGGAT CCATGCAAAAAAAGCGC；反向引物CGGTTAGAGCGGATATGGGGGAGGCGCTGAATGTAAGTGGACATAACTAATTA CATGACTGAGCTCGTCTAGTATTGCGATACTAGAGTATGC）生成pFJP21。所有构建体均通过序列分析和互补得到证实。
表2。
| 质粒 | 矢量 | 插入 | 参考 |
|---|
| 第FJP10页 | 缺少改良pUG34GFP公司 | 政府间贸易 | 本研究 |
| 第11页FJP11 | 第FJP10页 | 高致病性H1 | 本研究 |
| 第12页FJP12 | 第FJP10页 | 马力1ΔPVIAVN公司 | 本研究 |
| pFJP13型 | pUG36无GFP公司 | 政府间贸易 | 本研究 |
| 第14页FJP | 第13页FJP | 高致病性H1 | 本研究 |
| 第20页FJP20 | 第13页FJP | GST-HPH2 | 本研究 |
| 第21页FJP | 第FJP10页 | GST-HPH2 | 本研究 |
| pVH1型 | 第36页 | 高致病性H1 | 24 |
| pVH2型 | 第36页 | HPH2型 | 24 |
| 第36页 | | | 24 |
这个马力1Δ::KanMX4马力2Δ::KanMX4包装1Δ::KanMX4公司突变体是通过交配产生的材料一 马力1Δ：KanMX4公司到材料αpkr1号机组Δ：KanMX4公司和材料一 马力2Δ::KanMX4公司到材料αpkr1号机组Δ::KanMX4公司突变体。产生的二倍体产生孢子材料α马力1Δ::KanMX4包装1Δ::KanMX4公司（孢子3D）和材料一 马力2Δ::KanMX4包装1Δ::KanMX4公司（孢子5C）突变体。这个马力1Δ::KanMX4包装1Δ::KanMX4公司（3D）突变体与马力2Δ::KanMX4包装1Δ::KanMX4公司（5C）突变体，产生的二倍体被孢子化以产生马力1Δ::堪萨斯MX4马力2Δ::KanMX4包装1Δ：KanMX4公司（孢子3D）突变体。三个独立的马力1Δ::KanMX4马力2Δ::堪萨斯MX4 pkr1Δ::KanMX4公司产生了突变体（孢子1C、2D和3D），所有突变体在生长分析中的表现都相似。
这个马力1Δ::KanMX4马力2Δ::KanMX4第71秒Δ::KanMX4公司突变体是通过与材料一 马力1Δ::KanMX4公司突变体材料α秒71Δ::KanMX4公司突变体和材料一 马力2Δ::KanMX4公司突变体材料α秒71Δ::KanMX4公司突变体。二倍体形成孢子，产生材料一 马力1Δ::KanMX4秒71Δ::KanMX4公司（孢子18C）突变体和材料α马力2Δ::KanMX4第71秒Δ::堪萨斯州MX4（孢子17D）突变体。这个材料一 马力1Δ::KanMX4第71秒Δ::KanMX4公司（18C）突变体与材料α马力2Δ::KanMX4第71秒Δ::KanMX4公司（17D）突变产生材料一 马力1Δ::KanMX4马力2Δ::KanMX4第71秒Δ::KanMX4公司（孢子4D）突变体。三个独立的马力1Δ::KanMX4马力2Δ::KanMX4秒71Δ::KanMX4公司产生了突变体（孢子4D、19A和22D），并且所有突变体在生长测定中表现相似。
监测四个独立标记位点的适当分离，以验证产生的所有突变体的四分体。通过PCR验证了双突变体和三突变体。
为了确认Hph1和Hph2与Sec63/Sec62复合物之间的相互作用，将来自酵母TAP标签集合（目录号YSC1178；Open Biosystems，Huntsville，AL）的菌株与BY4742交配，生成一个SEC-TAP/SEC公司杂合二倍体菌株(). 用pFJP13、pFJP14或pFJP20转化杂合菌株。
喹吖啶染色。
酵母细胞在用50mM吗啉乙磺酸（MES）和50mM吗啉丙磺酸（MOPS）缓冲至pH 5.5的酵母蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基中生长至中对数相。通过离心法收集细胞；用水冲洗一次；在pH 7.6的YPD中用100 mM HEPES-KOH培养2小时；收集；用100 mM HEPES-KOH和200μM奎那克林在pH 7.6的新鲜YPD中重新悬浮（西格玛-阿尔德里奇，密苏里州圣路易斯）；并在30°C下摇晃培养5分钟。收集细胞并用含2%葡萄糖的100 mM HEPES（pH 7.6）冷缓冲液清洗三次。第三次清洗后，将细胞浓缩10倍，并将2μl置于显微镜载玻片上。通过微分干涉对比度（DIC）或异硫氰酸荧光素（FITC）滤光片对细胞进行成像，以使用蔡司Axio成像仪M1显微镜（德国耶拿卡尔蔡司）和哈马松Orca-R数码相机结合Openlab Software 5.0.1（马萨诸塞州沃尔瑟姆珀金埃尔默）检测奎那克林荧光。为了量化喹吖啶荧光，如上所述处理细胞。第三次清洗后，将200μl转移到96 well微孔板（Greiner PS；F-bottom）中进行分析（TECAN Safire；激发，470 nm；发射，507 nm）。图表上的值（见图4A和5A）表示三种独立生长、染色和分析培养物的平均值。在所有情况下，数值均归一化为野生型（WT）菌株（BY4741）的平均值。误差条表示平均值的标准偏差（SDM）。
生长分析。
通过将在YPD（50 mM MES，50 mM MOPS，pH 5.5）中生长的稳定相酵母培养物系列稀释液在YPD、含有100 mM Tris-HCl（pH 7.6）、YP-2%乙醇或含有NaCl、LiCl、H2O（运行）2，氯化钙2，氯化锌2，氯化钴2，氯化镉2，或CsCl2以指示的浓度。第一次培养稀释为2.5×106细胞/ml，随后的每个斑点是7倍的连续稀释。将平板在室温下培养指定天数（或在30°C下培养2天[见图5]）。
酵母提取物的GST下拉分析。
通过用pFJP10、pFJP11或pFJP12转化BY4742进行铜提纯研究(); 具有pUG36、pVH1或pVH2和pFJP10或pFJP11的VHY70细胞(); 或具有pFJP13、pFJP14或pFJP20(). 细胞在不含尿嘧啶和蛋氨酸（3 g/L）的合成完全培养基（SC）中培养过夜，并稀释至2×106在不含尿嘧啶或甲硫氨酸的SC中诱导GST、GST-Hph1或GST-Hph2的表达MET25型发起人。细胞生长至中对数期，用8 mM二硫苏糖醇（DTT）处理2 h（DTT处理增加了GST-Hph1和GST-Hph 2的稳定性，并在GST下拉中产生更多蛋白质[数据未显示]），并通过离心收集（1000×克持续5分钟）。用水清洗细胞一次，在液氮中快速冷冻，并在−80°C下保存。在4°C下，通过在破胶缓冲液（20 mM HEPES-KOH[pH 6.8]、250 mM山梨醇、250 mM-NaCl、70 mM醋酸钾、1 mM醋酸镁、1 mM-DTT）和蛋白酶抑制剂中的玻璃珠裂解产生细胞蛋白提取物。细胞以1000倍离心克在4°C下保持5分钟，以去除未破碎的细胞和玻璃珠。n个-将十二烷基麦芽糖苷以0.8%的终浓度加入上清液中，在室温下进行端对端旋转孵育20分钟，然后以13000×克在4°C下保持15分钟。上清液（S13）以100000×克在4°C下培养10分钟，将1 ml破碎缓冲液中的5 mg蛋白提取物（S100）与20μl谷胱甘肽-脑葡萄糖珠（英国白金汉郡GE Healthcare）在4°C下培养2小时，并进行端对端旋转。用含有300 mM NaCl和0.1%的800μl破胶缓冲液清洗珠子3次n个-十二烷基麦芽糖苷经抽吸干燥后，重新悬浮在SDS-PAGE缓冲液中，并在37°C下加热15分钟。使用标准程序，通过SDS-PACE和Western blotting对样品进行分析。免疫印迹用小鼠单克隆抗GST（加利福尼亚州埃默里维尔市科文斯）、小鼠单克隆抗体抗GFP（加利福尼亚州埃默里维尔市科万斯）、兔多克隆抗TAP（阿尔巴马州亨茨维尔市Open Biosystems）或兔抗Cna2多克隆抗血清进行探测(39). 使用结合辣根过氧化物酶（HRP）的抗鼠和抗兔二级抗体（英国白金汉郡GE Healthcare）和SuperSignal West Dura Extended Dura底物试剂盒（伊利诺伊州罗克福德的Thermo Scientific）检测柯达Biomax XAR胶片上的免疫反应带（柯达，罗切斯特，纽约）。
Hph1与钙调神经磷酸酶本身和Hph2相互作用。Hph1和Hph2还与翻译后易位机制的组成部分相互作用，即Sec63/Sec62复合物。（A） 钙调磷酸酶与GST-Hph1铜化，但与GST-Hph1铜不铜化ΔPVIAVN或GST-Hph2。从表达GST-Hph1、GST-Hph2或GST-Hph 1的野生型细胞（BY4742）提取物中纯化GST融合蛋白ΔPVIAVN用抗GST和抗Cna2抗血清进行SDS-PAGE和免疫印迹分析。（B） GST-Hph1或GST从马力1Δ马力2Δ细胞（VHY70）共表达GFP、GFP-Hph1或GFP-Hph 2，并用SDS-PAGE和抗GST抗GFP抗血清进行免疫印迹分析。（C） 从含有Sec71、Sec72、Sec62、Sec63或Sec61基因的基因组整合TAP标记等位基因的细胞提取物中纯化GST、GST-Hph1或GST-Hph 2(21); SDS-PAGE分析；用抗GST和抗TAP抗体进行免疫印迹。
Vph1的脉冲相位分析。
如前所述，通过脉冲相位分析量化Vph1稳定性(36). 用单克隆Vph1抗体（10D7；分子探针）或Randy Schekman（加利福尼亚大学伯克利分校）提供的多克隆Vphl抗体免疫沉淀Vph1。
结果
Hph1和Hph2与翻译后易位机制的组成部分相互作用。
Hph1和Hph2是细胞应激反应的重要介质；然而，它们的分子功能尚未确定(24). 为了更好地了解其功能，我们进行了基于膜的酵母双杂交筛选（MbY2H），检测Hph1和Hph2与完整膜蛋白库的相互作用(33). 该屏幕识别出24个与Hph1和Hph2交互的候选者。其中16个候选者在二次筛选中通过MbY2H与Hph1和Hph2相互作用，其中12个候选人进一步检查是否与Hph2和Hph1进行了铜提纯（见补充材料中的表S1）。Hph1、Hph1的N端GST融合ΔPVIAVN（一种缺乏钙调神经磷酸酶结合域的Hph1突变体）和Hph2，均在MET25型启动子用于这些研究。Hph1和Hph2 GST融合蛋白具有功能，并修复了高功率1Δ马力2Δ单元格（数据未显示）。由于Hph1和Hph2是完整的膜蛋白，我们确定了在保持蛋白-蛋白质相互作用的同时溶解Hph1与Hph2的提取条件。我们首先检测了Hph1与钙调神经磷酸酶的相互作用，这是之前使用酵母双杂交技术鉴定的(24). 钙调磷酸酶与GST-Hph1铜化，但不与GST-Hph1铜化ΔPVIAVN或GST-Hph2()，验证我们的纯化方法。此外，我们检测了Hph1和Hph2之间的相互作用，它们在ER膜上共定位，并在酵母双杂交分析中相互作用。为了进行这个实验，我们将GST-Hph1与Hph1或Hph2的N端GFP融合物共表达(24). GFP-Hph1和GFP-Hph2均与GST-Hph1铜化()这与之前的发现一致(24)并确定Hph1和Hph2相互以及可能与其他蛋白质形成高阶复合物。
使用相同的方法测试GST-Hph1与MbY2H筛查中确定的候选药物的相互作用（见补充材料中的表S1）。只有Sec71（Sec63/Sec62复合物的一个非必需亚单位）与GST-Hph1和GST-Hph 2可重复相互作用(和数据未显示）(18,20). 我们询问Hph1和Hph2是否与翻译后易位复合体的其他成分相互作用。具体而言，我们检测了GST-Hph1和GST-Hph 2与Sec72、Sec62、Sec63和Sec61的基因组表达的TAP标记等位基因的相互作用(21). 这些TAP标记的等位基因是有功能的，因为未翻译的CPY（前羧肽酶Y）在标记的单倍体菌株中没有积累（数据未显示）。GST-Hph1和GST-Hph 2，但不是GST，与Sec71-TAP、Sec72-TAP、Sec62-TAP和Sec63-TAP共净化(). 转位孔亚单位之一的Sec61的TAP标记版本未检测到相互作用。Hph1和Hph2与Sec63/Sec62复合物的关联表明它们可能在内质网翻译后蛋白质易位中发挥作用，马力1Δ马力2Δ细胞在处理Sec63/Sec62复合物的CPY和前α-因子、特征良好的底物时没有缺陷（数据未显示）。因此，Hph1和Hph2与Sec63/Sec62复合物相互作用，虽然对Sec63/Sec六十二功能不是必需的，但可能选择性地促进特定蛋白质的移位。
高功率1Δ马力2Δ细胞对各种应力条件都很敏感。
为了深入了解功能可能依赖于Hph1和Hph2的蛋白质，我们检测了马力1Δ马力2Δ单元。以前的研究证实，细胞缺乏这两种高致病性H1和HPH2型(马力1Δ马力2Δ）在碱性pH、高NaCl条件下或在细胞壁损伤剂（刚果红和钙荧光白）存在下生长不良，这与马力1Δ或马力2Δ单个突变体，在这些条件下没有生长缺陷()(24). 除了这些表型外，我们还发现马力1Δ马力2Δ细胞对各种环境应激条件敏感(). 具体而言，马力1Δ马力2Δ细胞对高浓度的二价重金属离子锌、镉、钴和铯敏感。此外，马力1Δ马力2Δ细胞对氧化应激（过氧化氢）敏感，在含有非发酵碳源（乙醇）的培养基上生长不良(). 他们对氯化钙也表现出轻微的敏感性(). 在大多数情况下马力1Δ和马力2Δ单个突变体与野生型细胞无明显区别，表明这些基因的功能重叠。相反，马力1Δ细胞在含有大量氯化锌的培养基上生长不良()，尽管马力1Δ马力2Δ表示在这些条件下，Hph1和Hph2也存在部分冗余。广泛的高功率1Δ马力2Δ表型以及Hph1和Hph2蛋白与翻译后易位机制的相互作用表明，Hph1与Hph2促进一种或多种蛋白的易位，使细胞能够应对各种类型的环境应激。高功率1Δ马力2Δ表型与空泡酸化缺陷细胞的表型惊人相似，例如vma21型Δ ()(29). 然而，在每种情况下马力1Δ马力2Δ生长缺陷的严重程度低于vma21型Δ电池，其中无法组装和输出V0内质网的V-ATP酶复合物导致V-ATP酶活性严重中断(27,40)。
马力1Δ马力2Δ细胞对高浓度重金属（ZnCl）条件下的生长敏感2，氯化镉2，氯化钴2和CsCl2)，氯化钙2、氧化应激（H2O（运行）2)以及一种不可发酵的碳源（乙醇）。马力1Δ细胞对ZnCl上的生长敏感2.野生型（BY4741），马力1Δ（编号1621），马力2Δ（编号380），以及马力1Δ马力2Δ（VHY60）菌株在YPD中生长到固定相。将培养物稀释至2.5×106将细胞/ml和7倍系列稀释液涂布在含有所示添加剂的YPD板上。将平板在室温下培养2天（YPD，pH 7.6，CaCl2和YP-乙醇），4天（氯化锌2，氯化镉2，氯化钴2、CsCl2、和H2O（运行）2)和5天（NaCl和LiCl）。
马力1Δ马力2Δ细胞的生长缺陷谱与vma21型Δ细胞，液泡酸化部分缺陷，Vph1周转增加。（A） 野生型（BY4741），马力1Δ马力2Δ（VHY60），以及vma21型Δ（4735个）细胞生长到固定相。培养物稀释至2.5×106在含有YPD（pH 5.5）的平板上发现每毫升细胞数和7倍系列稀释液，并指示添加量。（B） 酵母菌株（与面板A相同）用奎那克林染色，染色后立即成像。（C） 喹吖啶染色细胞的荧光按文中所述进行量化，并归一化为野生型细胞的平均荧光。用SDM表示三个重复样品的平均荧光强度，并将其归一化为WT。（D） 通过脉冲相分析测定了指示菌株中Vph1的半衰期。
马力1Δ马力2Δ细胞显示出减少的液泡酸化和增加的Vph1周转。
我们检测了马力1Δ马力2Δ细胞使用奎那克林，一种荧光染料，其在液泡中的积累取决于细胞器的酸化。当用荧光显微镜观察时，WT细胞中的液泡具有强烈的荧光，而vma21型Δ细胞几乎不可见()。马力1Δ马力2Δ细胞显示空泡荧光()与野生型细胞相比减少了25%±2.0%()表明液泡酸化存在一个微小但显著的缺陷(42). 两者都不是高功率1Δ或马力2Δ单个突变体显示奎纳克林积累减少，与观察到的高致病性H1和HPH2型基因(). 为了研究酸化减少的原因，我们检测了Vph1的稳定性，Vph1是V的亚基之一0V-ATPase复合物，在细胞中通过ERAD途径降解，V0合成或组装(26). 如前所述，Vph1营业额在vma21型Δ与野生型细胞相比。Vph1半衰期在马力1Δ马力2Δ比野生型细胞()这表明V-ATP酶稳定性降低会破坏液泡酸化，并导致这些细胞中观察到的生长缺陷。
真空酸化缺陷马力1Δ马力2Δ和秒71Δ单元不可加性。
由于Hph1和Hph2与Sec63/Sec62复合物相互作用，我们检查了该复合物的非必需成分Sec71是否是Vph1稳定性所必需的。秒71Δ细胞缺乏翻译后易位(18,20). 类似马力1Δ马力2Δ单元，秒71Δ细胞奎那克林荧光降低20%±2.3%()Vph1半衰期比野生型细胞短(). 这些观察结果表明，V-ATP酶的最佳生物发生需要后移位机制。为了测试Hph1/Hph2和Sec63/Sec62复合物是否通过相同或独立的机制改变V-ATP酶功能，我们检测了马力1Δ马力2Δ秒71Δ单元。喹吖啶积累所观察到的液泡酸化在马力1Δ高功率2Δ,秒71Δ和马力1Δ高功率2Δ秒71Δ电池(). 此外，Vph1的半衰期马力1Δ马力2Δ秒71Δ细胞略短于第71页Δ，但相当于马力1Δ马力2Δ单元。因此，在马力1Δ马力2Δ细胞未因Sec63/Sec62复合物的破坏而加重。这些结果与Hph1和Hph2与Sec63/Sec62复合物协同作用以转运一个或多个促进V0生物成因。
秒71Δ细胞表现出减少的液泡酸化和Vph1稳定性，这与马力1Δ马力2Δ. （A） 野生型（BY4741），马力1Δ马力2Δ（VHY60），秒71Δ（编号3311），以及马力1Δ马力2Δ秒71Δ细胞用奎那克林染色，空泡荧光定量。标准化为WT的三个重复的平均荧光强度用SDM表示。（B） Vph1的半衰期在野生型（BY4741）中测定，马力1Δ高功率2Δ（VHY60），秒71Δ（编号3311），以及马力1Δ马力2Δ秒71脉冲相位分析Δ电池。
液泡酸化缺陷由马力1Δ马力2Δ和pkr1号机组Δ是相加的。
在转位到内质网后，Vph1与V的其余部分组装在一起0复杂的因素包括Pkr1(11,29); V的中断0组装导致Vph1通过ERAD降解(26). 为了研究Hph1和Hph2在Vph1组装和输出中的潜在作用，我们检测了马力1Δ马力2Δpkr1号机组Δ单元。缺少细胞PKR1系列与野生型细胞相比，奎那克林的积累减少了87%±4.5%(). 这些细胞在碱性介质和高浓度氯化钙和氯化锌（参考文献11和数据未显示）。三重突变体的检测(马力1Δ马力2Δpkr1号机组Δ）显示删除PKR1系列加剧了马力1Δ马力2Δ单元。喹吖啶的积累在高功率1Δ马力2Δpkr1号机组Δ与野生型细胞相比，而马力1Δ马力2Δ仅显示25%±2.0%的降低。此外，马力1Δ马力2Δpkr1号机组Δ细胞在条件（1 mM ZnCl）下显示出明显的生长缺陷2，150 mM氯化钙2pH7.6），对两者都没有影响马力1Δ马力2Δ或pkr1号机组Δ电池(). 因此马力1Δ马力2Δ和pkr1号机组Δ是相加的。这些发现表明，Hph1和Hph2独立于Pkr1起作用，并与Hph1、Hph2以及Sec63/Sec62复合物作用于Pkr1介导的V0组装以促进V的高效生物生成0复杂。
pkr1号机组Δ加剧生长缺陷和液泡酸化缺陷马力1Δ马力2Δ单元。（A） 野生型荧光（BY4741），马力1Δ马力2Δ（VHY60），pkr1号机组Δ（编号6564），以及马力1Δ马力2Δpkr1型用奎那克林孵育后测定Δ细胞，并将其归一化为野生型细胞的平均荧光。误差条代表传感和诊断模块SDM。（B） 野生型（BY4741），马力1Δ马力2Δ（VHY60），pkr1号机组Δ（编号6564），以及马力1Δ马力2Δpkr1型Δ电池按照所述进行电镀并在30°C下生长2天。
讨论
Hph1和Hph2与Sec63/Sec62复合物相互作用。
先前的特征表明，Hph1和Hph2在盐、碱和细胞壁应激期间冗余地促进酵母细胞生长，尽管它们的分子功能尚未确定(24). 我们发现Hph1和Hph2与酵母提取物中的Sec71、Sec72、Sec62和Sec63共纯化，这表明这些蛋白质在翻译后ER易位中起作用。然而，前羧型肽酶Y和前α因子（这两种底物的易位依赖于Sec63/Sec62）的易位在马力1Δ马力2Δ细胞，表明Hph1和Hph2在选择性底物易位中具有更特殊的作用。虽然翻译后易位所需的核心机制已被阐明，但推测的辅助蛋白，如Yet1、Yet3和Ylr301w，已被确定与Sec63/Sec62复合物相互作用，但其在易位中的作用尚不清楚(47,48). 这些因素很可能促进特定底物的移位和/或调节转座子的活性。然而，对这种调节活动知之甚少。
Hph1和Hph2是低丰度蛋白质，估计为250个分子/细胞，而Sec63/Sec62复合物其余亚单位的分子/细胞大于7000(21). 化学计量比的差异也表明Hph1和Hph2耦合到Sec63/Sec62络合物的一个子集。Hph1和Hph2各自包含一个C末端跨膜结构域，并通过GET复合物插入内质网(7); 因此，每个蛋白质的大部分是细胞溶质的，可以与Sec63/Sec62复合组分的细胞溶质域相互作用。Hph1、Hph2和Sec71都包含预测的线圈基序，提供了一种合理的相互作用机制。然而，需要进一步研究来阐明Hph1和Hph2以及Sec63/Sec62复合物成员之间的直接物理接触。有趣的是，未观察到Hph1或Hph2与转位孔亚单位之一Sec61之间的关联。虽然在所用的实验条件下这种相互作用可能根本没有被保留，但更有趣的可能性是Hph1和Hph2作为易位底物的受体，作用于易位的上游就其本身而言赋予底物特异性，但很少或根本不与移位孔接触。
Hph1和Hph2是有助于V-ATP酶生物发生的新因子。
生长缺陷调查马力1Δ马力2Δ细胞显示出与Vma显示的细胞惊人的相似性−破坏V-ATP酶的突变体。V-ATP酶酸化液泡、高尔基体和内体，对细胞pH值和离子内稳态至关重要(29). 当V-ATP酶活性缺乏时，细胞无法在中性pH下生长，并对CaCl表现出敏感性2和各种金属离子(29). While期间马力1Δ马力2Δ细胞具有许多这些特性，它们的生长缺陷始终没有Vma严重−突变体。通过奎那克林累积量直接检测液泡酸化，发现马力1Δ马力2Δ细胞使我们研究了Hph1和Hph2在V-ATP酶生物发生中的可能功能。V-ATPase V的合成和组装0这个综合体受到高度监管。V需要Vma12、Vma21和Vma220组件，Vma21在V的输出中起到额外的作用0来自ER(11,22,27,28,40). 在缺乏任何一种组装因子的细胞中，没有V0产生，导致V-ATP酶活性完全丧失，并通过ERAD途径增加ER中Vph1的周转(26). Pkr1提高V的效率0装配和功能V的数量0正确靶向液泡膜的细胞在pkr1号机组Δ单元。V早期的Voa1功能0组件。美国之音Δ细胞显示V-ATP酶活性适度下降，无Vma−生长表型；然而结合了一个突变的等位基因vma21型，V-ATP酶组件严重受损(26). 因此，有助于V-ATP酶合成和组装但并非严格要求的蛋白质可能难以识别。我们观察到Vph1在马力1Δ马力2Δ细胞，这一发现，再加上这些细胞的液泡酸化和生长缺陷减少，表明Hph1和Hph2有助于V-ATP酶的生物发生。此外，我们发现马力1Δ马力2当与pkr1型Δ;马力1Δ高功率2Δpkr1号机组Δ突变体的液泡酸化程度降低幅度更大，生长缺陷也更严重马力1Δ马力2Δ或pkr1号机组Δ细胞，表明Hph1/Hph2独立于Pkr1介导的V0组装，并可能影响V-ATP酶生物发生的一个独特步骤。
在研究Hph1和Hph2时，我们重点研究了V-ATP酶产生的早期步骤，即ER易位，这是以前从未研究过的。我们发现，真空酸化和Vph1稳定性在秒71Δ细胞，翻译后易位缺陷。令人惊讶的是，秒72Δ细胞显示正常水平的奎那克林积累（数据未显示）。然而，Sec72在秒71Δ电池(20)因此，我们在这些细胞中观察到的缺陷可能是由于Sec71和Sec72中的缺陷造成的。值得注意的是，第71秒的损失马力1Δ马力2Δ细胞不会进一步减少液泡酸化或加剧Vph1不稳定性；因此，我们认为Hph1和Hph2与Sec63/Sec62复合物一起发挥作用，促进一个或多个蛋白质的翻译后易位，这些蛋白质是V高效生物生成所必需的0目前，这些蛋白质的身份尚不清楚；他们可能是V型0组件或先前确定的或新的V0组装因子及其易位可能完全或部分依赖于Hph1/2和Sec63/62。我们没有检测到Vph1与GST-Hph1或GST-Hph2的铜净化作用（数据未显示）。然而，Vph1本身不太可能是Sec63/Sec62复合物的直接底物，因为在易位之前，很难在翻译后将这种大的多面体膜蛋白保持在可溶性状态。除了Vma22之外，已知的V0组装因子虽然较小，但也是完整的膜蛋白。有趣的是，MbY2H实验确定了Sec72和Vma12之间的假定相互作用(33). 因此，我们分离了Sec72-TAP和Sec71-TAP，但没有观察到与Vma12或Vph1的铜提纯（数据未显示）。未来的研究将旨在阐明Hph1和Hph2在易位过程中的特定分子功能，并确定其靶点。
Hph1和Hph2的生理功能和调节。
Hph1和Hph2是细胞在许多应激条件下生存所必需的，而Hph1受Ca的正向调节2+/钙调素调节蛋白磷酸酶钙调神经磷酸酶(24). 钙调神经磷酸酶在环境胁迫条件下被激活，并使几种蛋白质脱磷，包括Hph1、Slm1、Slm2和Crz1转录因子，以促进细胞存活(4,10,24,35). 许多被Crz1/钙调神经磷酸酶转录激活的基因编码膜蛋白(49)通过激活Hph1，钙调神经磷酸酶也可能促进这些蛋白质的移位。令人惊讶的是，我们观察到Hph1和Hph1的相互作用完全相同ΔPVIAVN由于钙调神经磷酸酶无法对其进行去磷酸化，导致其过度磷酸化，含有Sec63/Sec62成分（数据未显示）。这表明Hph1功能的其他方面，如与转运底物的拟议相互作用，受其磷酸化状态调节。需要进一步研究来检验这种可能性。
高功率1和HPH2型当细胞暴露于DTT或衣霉素时，其表达增加，这通过内质网中未折叠蛋白的积累引起内质网应激(45). 然而，根据UPRE-LacZ报告基因（pJC005）的表达，Hph1和Hph2在这些条件下不是必需的，未折叠蛋白反应也不是必需的[9])，构成诱导于马力1Δ马力2Δ单元格（数据未显示）。然而，在内质网应激期间，Hph1调节因子钙调神经磷酸酶对细胞存活是必需的(15)在这些条件下，Hph1和Hph2的上调可能通过增强蛋白质的易位来帮助细胞应对内质网应激，从而有助于细胞存活。或者，在这些条件下，未折叠蛋白的增加可能会降低细胞溶质伴侣的可用性，并增加未翻译前体的积累(12); Hph1和Hph2可以补偿这种应激诱导的易位缺陷。
Hph1、钙调神经磷酸酶和Hsp90提供了酵母菌对唑类抗真菌药物产生耐药性的一种机制(8,38). 我们的研究为Hph1介导的唑类耐药提供了可能的解释。的过度表达HIS3型消除了能量3Δ马力1Δ马力2Δ菌株，这一发现促使人们提出Hph1和Hph2促进氨基酸的感应或输入，以应对唑胁迫(38). 鉴于Hph1和Hph2与Sec63/Sec62复合物的相互作用，研究它们是否促进氨基酸转运体的易位或有助于这些转运体生物发生的因素将很有意义。
对调节蛋白质移位的机制进行了深入研究；然而，我们对蛋白质生物生成中这一关键和潜在的速率限制步骤是如何调节的知之甚少体内(25). Hph1和Hph2有望为调节蛋白质通过内质网膜的能力的机制和生理条件提供新的见解。
