谷氨酰胺酶：调节癌细胞代谢的热点？

摘要

RHO GT酶与恶性转化中的细胞代谢

我们最初的努力是针对Rho家族GTPase信号通路来识别阻止恶性转化的新型小分子抑制剂。这有很多原因，也许最重要的是我们的实验室多年来一直在研究小GTPase Cdc42，以及密切相关的蛋白质Rac和RhoA及其信号伴侣。来自GTPase家族成员的信号对从肌动蛋白细胞骨架重排到细胞极性、迁移和细胞周期进展的广泛细胞过程都很重要[1]. 然而，这些GTPase也与多种疾病和发育障碍有关，许多证据表明Rho家族成员与癌症有关[2]. 例如，它们通过突变或上游激活物的去调节而发生的超激活，即鸟嘌呤核苷酸交换因子，它催化这些GTPase（例如癌蛋白Dbl家族的成员）上的GDP与GTP的交换，从而导致细胞转化[三,4]. 已经证明，表达组成活性形式Rho GTPase的细胞能够在无血清剥夺和基质（即锚定物非依赖性生长）的条件下生长，并且当注射到免疫受损小鼠体内时能够诱导肿瘤形成[5-7]. 据报道，Rho GTPases在结肠癌、肺癌、晚期乳腺癌、睾丸生殖细胞和泌尿道肿瘤以及胰腺癌中过度表达[8-14]. 该家族的两个成员RhoA和RhoC与转移有关[15-18]Rho-GTP酶激活蛋白（Rho-GAP）DLC1（用于肝癌1中的缺失）在肝癌组织和许多其他癌症中的表达受到抑制[19,20]. 因此，总的来说，这些发现使Rho GTPases及其调节蛋白成为人类癌症干预靶点的候选靶点。

RHO GTPASE诱导的细胞转化与细胞代谢活性之间的惊人联系

我们最近发现Rho GTPases通过以前未被认可的与细胞代谢的联系在癌症进展中发挥新作用[21]. 特别是，我们发现Cdc42和相关Rho-GTPase（例如Rac1、RhoA和RhoC）的过度激活标志着线粒体酶谷氨酰胺酶的激活，谷氨酰胺酶通过将谷氨酰胺水解为谷氨酸和氨在谷氨酰胺代谢中起关键作用。细胞代谢在癌症发展中的重要性来源于Warburg的早期观察，即肿瘤细胞表现出更强的糖酵解活性（即“Warburge效应”）[22]. 这一现象得到了重新的关注[23-26].

癌细胞在代谢活动中发生显著变化，以维持其恶性表型（图​（图1）。1). 其中一组变化是糖酵解途径中酶的表达上调，从而加速了该途径中的许多反应。然而，重要的是，糖酵解的倒数第二步，即磷酸烯醇式丙酮酸转化为丙酮酸，在丙酮酸激酶的催化下，在癌细胞中被减弱（而不是加速）[24,25]. 这是丙酮酸激酶（M2）的一种特殊亚型的酪氨酸磷酸化的结果，该亚型优先在癌细胞和胚胎细胞中表达，但在分化细胞中不表达[24,25,27]. 这种衰减的净结果是丙酮酸是通过一种独特的酶机制生成的，该酶机制与ATP生成分离，并涉及磷酸烯醇丙酮酸对磷酸甘油酯变位酶的磷酸化[26]. 当通过这种“替代糖酵解途径”生产丙酮酸时，丙酮酸主要转化为乳酸，而不是乙酰辅酶A用于柠檬酸合成，而柠檬酸则通常进入柠檬酸循环。由于糖酵解途径的这些变化，癌细胞产生的乳酸增加，是近80年前Warburg的一项开创性观察，反映了经常伴随细胞转化的代谢重塑的一个方面。

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图1：

癌细胞的代谢重塑示意图强调了许多癌细胞与正常组织的关键差异

正常细胞在线粒体（黄色）呼吸之前进行糖酵解，并通过三羧酸（TCA）循环（绿色）完全分解葡萄糖。在癌细胞中，糖酵解成为葡萄糖代谢的主要方式，导致乳酸及其分泌。丙酮酸激酶（PKM2）的M2亚型被酪氨酸磷酸化并减弱丙酮酸乙酰-CoA转化，而谷氨酰胺水解为癌细胞提供生物合成前体的替代来源，用谷氨酰胺衍生的α-酮-谷氨酸为TCA循环提供燃料。抗肿瘤药物968通过抑制谷氨酰胺酶（GLS）来抑制谷氨酰胺代谢。

癌症代谢的第二组主要变化有助于调节糖酵解途径的变化，导致谷氨酰胺代谢速率的增加。这是通过线粒体谷氨酰胺酶活性催化的谷氨酰胺加速水解为谷氨酸，以及随后谷氨酸脱氢酶催化的谷氨酸转化为α-酮戊二酸来实现的。谷氨酰胺代谢升高导致的α-酮戊二酸的生成增加有助于维持癌细胞中的柠檬酸循环，特别是在正常（非癌）细胞糖酵解产生的丙酮酸输入损失的情况下。代谢通量实验使用¹³C-NMR已经证明，虽然增殖的癌细胞表现出明显的Warburg效应，但其柠檬酸循环保持完整，并补充脂肪酸合成NADPH所需的代谢中间产物，为核苷酸合成以及天冬酰胺和精氨酸的生产提供碳源，并作为草酰乙酸的主要补充来源[23,28]. 因此，癌细胞通常被称为“谷氨酰胺成瘾”，因为它们通常对谷氨酰胺缺乏极其敏感，因此没有谷氨酰胺就无法在细胞培养中增殖。

我们最近的研究表明，肿瘤细胞的谷氨酰胺成瘾是通过谷氨酰胺酶的激活实现的，谷氨酰胺酶催化谷氨酰胺代谢的关键步骤之一，是翻译后修饰的结果。这一发现源于对小分子抑制剂的筛选，这些小分子抑制剂阻断了不同组成活性Rho-GTPase以及致癌Dbl转化成纤维细胞的能力。这些努力导致我们发现了一种Rho GTPase依赖性细胞转化的小分子抑制剂，命名为968，它是苯并菲咯烷酮家族的成员。如图所示​图2，2，968在阻止Dbl诱导的焦点形成方面非常有效，而分子中非常细微的变化，例如从苯环（即图中的分子335）中去除溴​图2），2)导致其在抑制转化方面无效。我们继续证明968的靶点是谷氨酰胺酶C（GAC），这是一种特殊的羧基末端剪接变体形式的肾型谷氨酰胺酶（GLS1），是两种已知哺乳动物谷氨酰胺酶之一（另一种是“肝型”或GLS2），发现于肾脏和包括多种癌症细胞在内的多种其他组织中[29]. 然后我们证明，通过使用小分子抑制剂968或通过RNAi靶向GAC，可以阻止各种人类乳腺癌细胞以及各种其他类型的人类癌症细胞系的生长和侵袭活性。

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图2：

谷氨酰胺酶抑制阻止Rho-GTPase驱动的转化

用pZIPneoDbl转染10 cm板中的NIH-3T3小鼠成纤维细胞，使其在仅存在二甲基亚砜（对照）、5 M非活性968类似物335（CAS注册号22949-42-4）或5 M 968（CAS登记号311795-38-7）的情况下生长10天，然后固定板并用结晶紫染色。非活性和活性化合物的结构如下所示。

现在，我们将讨论一些有关癌症细胞中谷氨酰胺酶活性调节的悬而未决的问题，以及如何在这种酶和谷氨酰胺代谢水平上进行干预，从而为癌症的治疗干预提供新的途径。

谷氨酰胺酶对转化细胞和癌细胞的调节

有两种明显的机制可以增加癌细胞中的酶活性；一种是通过上调酶的表达，使其在癌细胞中的蛋白水平大大超过非转化分化细胞中的水平，另一种是直接调节酶的活性。事实上，Gao等人报告称，谷氨酰胺酶（GAC）在人类B淋巴瘤和前列腺癌细胞中的表达以c-Myc依赖性方式上调[30]. 同样，我们发现与正常乳腺上皮细胞相比，MDA-MB231细胞（一种高度侵袭性乳腺癌细胞系）中GAC的表达水平显著增加[21]. 然而，至少在MDA-MB231细胞中，GAC的上调不能完全解释我们观察到的其酶活性的变化。具体来说，虽然GAC重组制剂的基本活性水平通常小于50-100 mM无机磷酸盐（作为酶的变构激活剂）存在时测得的活性的5%，这些乳腺癌细胞线粒体组分的基础活性通常是无机磷存在时测定的最大活性的30-50%。因此，与纯化重组蛋白的基本活性相比，MDA-MB231细胞中的基本谷氨酰胺酶活性增加不成比例。此外，与非转化细胞相比，不同转化的成纤维细胞和其他癌细胞中的谷氨酰胺酶活性显著增加，而酶的表达水平没有任何明显变化。一个很好的例子来自我们对Dbl-转化NIH-3T3细胞的研究，其中基础谷氨酰胺酶活性比对照（非转化）成纤维细胞中测量的相应活性高5-10倍，而当在100mM无机磷酸盐存在下测定时，这两组细胞的酶活性基本相同。因此，与对照组成纤维细胞相比，Dbl转化细胞中谷氨酰胺酶的总水平基本相同；然而，转化细胞中的基础酶活性明显更高。在人类乳腺癌SKBR3细胞系中也发现了同样的情况。

一个更令人信服的迹象表明，转化/癌细胞中的基本谷氨酰胺酶活性增加，与该酶表达水平的变化无关，这来自于我们在Dbl-转化细胞和正常成纤维细胞中体外表达GAC的实验。我们发现，当从转化细胞中免疫沉淀时，表位标记的表位外表达GAC与从正常细胞中免疫析出的同等数量的表位标记酶相比，显示出显著更高的基础酶活性。这些发现为我们提供了第一条线索，即谷氨酰胺酶可能在转化/癌细胞中被翻译后修饰，这种修饰可以解释其（基础）酶活性的激活，从而为这些细胞表现出的谷氨酰胺代谢升高提供了分子联系。

谷氨酰胺酶在转化细胞/癌细胞中是如何激活的？

关于转化细胞/癌细胞中GAC是如何激活的一个重要线索来自我们的发现，当来自Dbl-转化细胞的免疫沉淀酶在检测其酶活性之前首先用碱性磷酸酶处理时，几乎所有的基础活性（但不是无机磷酸盐模拟活性）被淘汰。这表明GAC在转化细胞/癌细胞中磷酸化，这是其基础活性显著增加的原因。经968处理的转化细胞和癌细胞未表现出基础谷氨酰胺酶活性升高。使用纯化的重组GAC进行的动力学研究表明，968既不与底物（谷氨酰胺）的结合竞争，也不与无机磷酸盐竞争（21）。显然，968以变构方式作用，通过阻断负责激活酶的翻译后修饰来阻止细胞中GAC的激活。这将解释968的抑制作用是如何通过分离线粒体部分的洗涤液分离转化细胞和癌细胞来维持的。此外，通过阻断主要发生在转化细胞/癌细胞而非正常（非癌）细胞中的翻译后修饰，更容易理解为什么这种小分子抑制剂在抑制作用方面对转化细胞/癌症细胞表现出如此特异性。

NFκB的作用

剩下的一个重要问题是，Rho-GTPase信号事件的过度激活如何导致线粒体代谢酶的激活，从而导致各种人类癌症细胞的细胞转化和恶性表型的诱导。由于基础谷氨酰胺酶活性的增加发生在由不同的Rho-GTP酶（即Cdc42、Rac和RhoC）转化的细胞中，并且考虑到这些GTP酶中的每一种都通过不同的靶/效应蛋白组发出信号，我们检测了NFκB是否可能参与，据报道，许多Rho GTPase能够激活该转录因子[31,32]. 此外，NFκB被证明对Dbl诱导的转化至关重要，并且与多种人类癌症，尤其是乳腺癌有关[33,34]鉴于许多不同的乳腺癌细胞系对968高度敏感，这使得它成为一个特别有吸引力的候选细胞。事实上，我们发现，用一种小分子阻断NFκB的活化，这种小分子抑制其负调控因子IKBα的降解，并通过RNAi敲低大NFκ）B亚基p65/RelA的表达，显著抑制了Dbl-转化细胞和乳腺癌细胞中谷氨酰胺酶的活化。然而，这为未来提出了一个紧迫的问题，即NFκB如何激活转化细胞/癌细胞中的基本谷氨酰胺酶活性？

未来的问题

NFκB是一种众所周知的转录因子，与广泛的细胞和生物活性有关，包括癌细胞的生存和迁移。在缺乏生长因子或细胞因子信号活性的情况下，NFκB仍留在与负调控蛋白IκBα相关的胞浆中。然而，当生长因子/细胞因子信号通路被激活时，IκBα被磷酸化和降解，从而释放NFκB转移到细胞核并促进许多基因的表达。虽然转化细胞/癌细胞中基础谷氨酰胺酶活性的增加依赖于NFκB活性，但我们知道这不是该转录因子对谷氨酰胺酶表达直接影响的结果。事实上，即使是体外表达的GAC的酶活性在Dbl转化细胞中也显著增加，这种激活依赖于NFκB。这意味着NFκB上调了GAC活化所必需的生长因子（或细胞因子）、蛋白激酶和/或调节蛋白的表达。最近的2D-gel电泳实验与以下观点一致：转化细胞/癌细胞特有的外源表达GAC的翻译后修饰负责酶的激活，968的结合阻断了这些激活修饰（J.Wang，未发表的观察结果）。我们未来研究的一个重要目标是确定导致转化细胞/癌细胞中谷氨酰胺酶激活的翻译后修饰位点，因为这有望为理解NFκB调节酶活性的机制提供线索。

当然，还需要解决一些其他重要问题。特别是，我们希望获得一些结构信息，以阐明谷氨酰胺酶在转化细胞/癌细胞中是如何激活的。研究表明，GLS1在无机磷酸盐的结合作用下，经历了从非活性二聚体到活性四聚体的低聚物转变[35]. 磷酸化和/或其他类型的GAC翻译后修饰是否有助于促进癌细胞中二聚体到四聚体的转变？如果是这样，这种转变是由酶的翻译后修饰和无机磷酸盐或另一种可能作为细胞激活剂的代谢物的结合所驱动的吗？小分子968的结合是如何阻断这种激活事件的？到目前为止，我们还没有发现968能够抑制高浓度无机磷酸盐（即100 mM）诱导GAC中二聚体到四聚体转变的能力。然而，968仍可能阻止酶对较低水平的无机磷酸盐或特定代谢物作出反应而发生这种转变，否则可能发生在未经这种小分子抑制剂治疗的癌细胞中。这些是我们实验室目前正在积极研究的问题。

对未来治疗策略的启示

事实上，用小分子968抑制转化细胞/癌细胞中谷氨酰胺酶的激活对这些细胞的生长、迁移和侵袭活性有特定影响，而不影响其非转化细胞对应物的生长或形态，为治疗干预提供了令人兴奋的新可能性。传统观点认为，生长因子受体及其信号通路的过度表达会导致过度的信号传导事件，从而导致恶性转化和癌症进展[36-38]. 因此，许多治疗策略都是通过使用酪氨酸激酶抑制剂和单克隆抗体来抑制受体的激活和功能[39-43]. 其中一些策略显示出了一些希望，尽管其中许多癌症对此类治疗产生了耐药性，但仍需要确定额外的药物靶点，以允许对一些人类恶性肿瘤进行多方面的治疗干预策略。小分子968能够改变癌细胞满足其生物合成和能量需求所必需的独特代谢通量，这为干预恶性状态的新方法打开了大门。在这方面，特别值得注意的是，968阻断了在癌症中选择性激活的代谢酶的激活。迄今为止，对小鼠异种移植模型的早期研究表明，腹腔注射小分子968可缩小这些动物的肿瘤，且无明显不良反应（21）。因此，靶向谷氨酰胺酶以及负责癌细胞代谢重新编程的其他酶可以为干预表现出谷氨酰胺成瘾的恶性肿瘤提供一些激动人心且高度特异的策略。

致谢

脚注

参考文献