简介
氨酰转移RNA（tRNA）合成酶（aaRS）催化同源氨基酸的活化并将其转移到适当的tRNA分子(1). 根据结构特征，aaRS可分为两类，I类和II类(2). Leucyl-tRNA合成酶（LeuRS）属于第一类，其特征是HIGH和KMSK基序。在结构上，所有LeuRS都包含一个二部分Rossmann折叠催化结构域(三)，催化结构域内一个称为连接肽1（CP1）的大插入结构域(4)和靠近C末端的tRNA反密码子结合域(5). 此外，在高等真核细胞的胞浆中，人类细胞质亮氨酸合酶（hcLeuRS）作为多胺酰-tRNA合成酶复合物（MSC）的一种成分存在，该复合物由八个aaRS和三个额外的非合成酶辅助蛋白组成(6). 与其他真核aaRS相似(7)，LeuRS与人类疾病有关。HcLeuRS可能与肺肿瘤的发生有关(8)线粒体LeuRS可能与糖尿病有关(9).
aaRS的保真度有时会受到数量有限的非同源标准氨基酸的威胁。例如，异亮氨酸-tRNA合成酶（IleRS）必须区分异亮氨酸和缬氨酸，两者的区别在于缺少一个甲基(10,11). 缬氨酸-tRNA合成酶（ValRS）也激活苏氨酸，苏氨酸具有与缬氨酸中甲基部分等位的羟基(12). 与IleRS和ValRS同源的Leucyl-tRNA合成酶（LeuRS）使大量氨基酸失活在体外(13,14)以及一些非标准氨基酸(13). 消除这些错误并保持蛋白质合成的准确性(15)，一些aaRS已经进化出编辑机制来水解失活的氨基酸（转译前编辑）或失酰化的tRNA（转译后编辑）。此外，非同源氨酰基腺苷酸的消除可能通过其优先释放和随后在溶液中的水解发生（动力学校对）(16). 例如，IleRS执行转移前和转移后的编辑反应，但偏爱转移前途径约80–90%(17). ValRS主要通过转移后途径抑制苏氨酸(12)；然而，ValRS是否通过翻译前编辑进行催化尚不清楚。最近的研究表明，LeuRS执行转移前和转移后的编辑，并且大肠杆菌LeuRS支持传输后编辑，而超嗜热菌酶有利于翻译前编辑(18,19). II类aaRS，如脯氨酰tRNA合成酶（ProRS）(20)，丙氨酸-tRNA合成酶（AlaRS）(21)和苯丙氨酸-tRNA合成酶（PheRS）(22)所有这些都显示了转移前和转移后编辑，而苏氨酸-tRNA合成酶（ThrRS）仅依赖于转移后编辑(23)，而seryl-tRNA合成酶（SerRS）仅执行翻译前编辑(24).
LeuRS、IleRS和ValRS形成了一个具有高序列和结构同源性的相关合成酶亚群(5). 对于转移后编辑，假设了一个模型，其中错酰化tRNA的柔性3′端从氨酰化活性位点转移到水解编辑位点(25,26). 非同源氨酰腺苷酸可通过tRNA依赖性水解(10,21,27)或LeuRS和其他aaRS的tRNA依赖途径(24,28). 针对IleRS和ValRS，提出了一种可能的tRNA-依赖性翻译前编辑模型，其中初始的翻译后编辑步骤用于触发对编辑活动构象的构象变化，然后可以在CP1域中执行翻译前编辑(29). 该模型要求腺苷酸从合成位点迁移到编辑位点，编辑位点之间的距离为～30°。然而，这两个位点之间没有明显的通道，这可能有助于防止腺苷酸在移位期间从酶表面分离。另一方面，最近的几项研究表明，tRNA依赖的翻译前编辑可能发生在合成活性位点。II类ProRS和SerRS以tRNA-independent方式编辑其合成活性位点中的非同源氨酰腺苷酸(24,30). 对于I类LeuRS，建议在合成场地内进行tRNA相关的预转换编辑活动(18). 还表明，缺乏编辑域和任何已知编辑活动的I类GlnRS能够在其合成活性位点催化类似编辑的反应(31).
人类细胞质LeuRS（hcLeuRS）已被鉴定为多氨基酰-tRNA合成酶复合物（MSC）的一种成分(32). 研究表明，hcLeuRS的C末端附加结构域对其与MSC其他成分的相互作用至关重要(33). 最近，报道了hcLeuRS的编辑特性(34). CP1编辑结构域中关键苏氨酸残基的取代并没有对非同源氨基酸产生通常的识别作用，这表明编辑位点的结构与其他特征LeuRS的结构不同(34). 在本研究中，重组人细胞质tRNA卢（hctRNA卢)和hcLeuRS过表达并从其大肠杆菌转化者。用纯化的hctRNA卢作为底物，hcLeuRS显示出比以前用tRNA转录物测量的更高的氨酰化和编辑活性。我们发现hcLeuRS可以使几种Leu类似物失活，包括去甲缬氨酸（Nva）、α-氨基丁酸（ABA）、Met和Ile。我们还表明hcLeuRS可以给hctRNA充电卢并通过多种编辑途径排除不正确的产品。这些结果表明，人类酶基本上通过CP1结构域中发生的转移后编辑途径编辑Nva。相反，失活ABA的编辑主要发生在翻译前阶段，这表明编辑路径之间的机械差异为有效校对提供了优势。
材料和方法
材料
L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-去甲缬氨酸、α-氨基丁酸（ABA）、5′-GMP、ATP、GTP、CTP、UTP、焦磷酸四钠和无机焦磷酸酶购自Sigma（美国密苏里州圣路易斯）。L（左）-[三H] 亮氨酸和L-[三H] 蛋氨酸（1 mCi/ml）从Perkin Elmer Life Sciences（美国马萨诸塞州波士顿）获得。T4多核苷酸激酶、T4 DNA连接酶、RNasin（核糖核酸酶抑制剂）、异丙基β-d日-硫代半乳糖苷（IPTG）和所有限制性内切酶均来自Sangon Co.（中国上海）。AN2690来自Milestone Pharmtech USA Inc.。GF/C和DE-81过滤器来自Whatman Co.（德国达塞尔），大肠杆菌罗塞塔菌株TM（TM）2（DE3）购自Novagen，EMD Biosciences Inc.（德国达姆施塔特）。质粒pTrc99B，编码tRNA核苷酸转移酶和大肠杆菌菌株MT102来自法国斯特拉斯堡生物研究所（Institute de Biologie Moléculaire et Cellulaire du CNRS）。用前面描述的方法纯化tRNA核苷酸转移酶(35).
酶和tRNA制剂
从pFastBac1H中扩增出编码hcLeuRS的基因-赫克莱斯(33)并在pET22b（+）的NdeI和SalI位点之间克隆。对于过度表达，大肠杆菌拉罗塞塔TM（TM）使用2（DE3）。通常，接种500 ml添加60µg/ml氯霉素和100µg/ml氨苄西林的2×YT培养基，并在37°C下培养，直到添加IPTG（200µM）。在20°C下进行6小时的诱导。在镍上纯化hcLeuRS2+–如前所述执行NTA Superflow色谱柱（德国Qiagen Inc.）(33).
hctRNA卢（本研究中指hctRNA卢CAG公司异受体）从细胞中提取或由在体外转录。过表达的hctRNA卢纯化自大肠杆菌含有编码hctRNA基因的细胞（菌株MT102）卢如前所述(36,37). 在37°C下与IPTG孵育15 h后，用苯酚提取收集的细胞，收集核酸部分，然后加载到DEAE-Sepharose CL-6B柱（2×20 cm）上。柱用线性NaCl梯度洗脱，而最高峰含有tRNA卢收集并用乙醇沉淀。将来自DEAE-Sepharose的tRNA样品进一步应用于25 ml C4反相高效液相色谱柱（1×15 cm）中，之前用缓冲液a（10 mM NaH）平衡2人事军官4，100万氯化钠2，8 mM氯化镁2pH 5.5）。用缓冲液A和B（10 mM NaH）的程序梯度洗脱残留物质2人事军官4，10%乙醇，pH 5.5），并通过乙醇沉淀回收。体外hctRNA的转录卢如前所述，随后进行tRNA的重折叠(33). tRNA浓度通过260 nm处的紫外吸收测定，消光系数根据每个tRNA的序列计算(38).
氨基酸活化
对于hcLeuRS，ATP-PPi交换反应在37°C下在含有2 mM的反应混合物中进行[32P] 焦磷酸盐（PPi）15 cpm/pmol，100 mM HEPES-KOH（pH 7.6），6 mM MgCl22 mM KF、2 mM ATP、各种浓度的亮氨酸（或Nva、或ABA、或Ile或Met）和80 nM hcLeuRS(37).
AMP形成
对于hcLeuRS，在含有1 mM精胺、50 mM HEPES-KOH（pH 7.6）、25 mM KCl、6 mM MgCl的反应混合物中测量AMP的形成2，5 mM DTT，5 U/ml PPase，3 mM ATP，20 nM[α-32P] ATP（3000 Ci/mmol，Perkin Elmer）和2 mM Leu，或10 mM Nva或15 mM ABA，含或不含5µM过量生成的tRNA卢反应在37°C下培养，并由1µM hcLeuRS或在氨基酸存在下的相应突变体启动。将等分试样（1.5µl）在6µl 200 mM醋酸钠（pH 5.0）中淬火。在预先用水清洗的聚乙烯亚胺纤维素板（默克）上发现两份淬火小份（每份1.0µl）。AA的分离-[32P] 放大器[32P] AMP和[32P] ATP通过在0.1 M醋酸铵和5%醋酸中展开TLC板进行(39). 通过荧光成像对平板进行可视化，并使用ImageQuant 5.2软件（GE Healthcare）对数据进行分析。[32P] AMP和AA-[32P] AMP斑点与已知的[32P] ATP浓度。
氨酰化和脱酰化
氨酰化试验在含有1 mM精胺、50 mM HEPES-KOH（pH 7.6）、25 mM KCl、6 mM MgCl的缓冲液中进行2，20微米[三H] 亮氨酸或75µM[三H] Met，4 mM ATP，10µM tRNA卢和25 nM hcLeuRS或1.5µM hcLeu RS-D399A突变株，37°C。除氨基酸和tRNA被1µM取代外，脱乙酰分析在37°C下以与氨酰化条件相同的反应进行[三H] Met-tRNA卢.
为了确定hcLeuRS突变体对非同源氨基酸的错酰化，如前所述进行反应(40,41). HctRNA卢使用tRNA核苷酸转移酶催化的交换反应在3′末端核苷酸间连接处标记。反应包含50 mM Tris–HCl缓冲液（pH 8.0）和12 mM MgCl2，5 mM DTT，3µM hctRNA卢，0.5µM[α-32P] ATP（3000 Ci/mmol，Perkin Elmer）和3µM tRNA核苷酸转移酶。在37°C下孵育5分钟后，将酵母焦磷酸酶（PPase，Roche）添加到最终浓度为10U/ml，并将反应混合物再孵育2分钟，然后通过苯酚提取进行猝灭。
将未标记的Leu、Nva或ABA氨基酸并入3′-32P标记的tRNA卢除使用5 mM Leu、10 mM Nva或15 mM ABA外，采用与上述相同的氨酰化分析测定。氨酰化后，通过将1µl反应混合物置于含有200µM醋酸钠（pH 5.0）和0.2 U/µl P1核酸酶（Fluka）的缓冲液中，并在25°C下培养10分钟，停止所有反应并消化产物。通过TLC分离来自氨酰化tRNA的3′-氨酰化A76和来自不带电tRNA的AMP，并通过如上所述的磷光成像分析进行量化(41).
结果
hcLeuRS和hctRNA的过度表达卢在里面大肠杆菌改善氨基酰化作用
在我们早期的研究中，编码hcLeuRS的基因在昆虫细胞中表达(33). 在这里，我们将人类基因克隆到质粒pET22b中，以便在大肠杆菌带着阿拉三-他的6在C端子处贴上标签。从1.5 g湿电池中获得约2 mg hcLeuRS。该酶被纯化到90%的均一性，分子量为135 kDa，与从杆状病毒系统中纯化的酶相似(33). HcLeuRS在大肠杆菌展示了同样的k个猫值在昆虫细胞中过度表达，达到约0.3秒−1用hctRNA的转录本卢().
表1。
不同tRNA的hcLeuRS动力学常数卢秒在氨酰化反应中
| 常量 | 小牛肝脏tRNA卢（50 pmol）/A类260)一 | 体外转录的hctRNA卢（680 pmol）/A类260) | 过度表达Ec公司tRNA卢（1400 pmol/A类260) | hctRNA过度表达卢（1600 pmol）/A类260) |
|---|
| K（K）M（M）（µM） | 1.9 ± 0.2 | 1.02 ± 0.04 | 0.58 ± 0.02 | 0.74 ± 0.05 |
| k个猫（个）−1) | 0.28 ± 0.02 | 0.33 ± 0.01 | 0.45 ± 0.04 | 2.56±0.20 |
| k个猫/K（K）M（M）（个）−1百万分之一） | 147.4 | 323.5 | 775.9 | 3459.5 |
为了改进k个猫氨酰化反应值卢在细菌表达载体pTrc99B中克隆(36,37)为了产生含有碱基修饰的tRNA，碱基修饰通常对tRNA的结构和稳定性至关重要。之后大肠杆菌转化和IPTG诱导，通过标准苯酚提取程序从6 g湿细胞中分离出34 mg粗tRNA。该tRNA具有864 pmol的亮氨酸接受活性/A类260含hcLeuRS但只有103 pmol/A类260具有大肠杆菌LeuRS公司(Ec公司LeuRS）（数据未显示）。通过DEAE-Sepharose色谱分离总tRNA后，tRNA的白细胞化活性提高到1450 pmol/A类260,然后达到1600 pmol/A类260在C4反相HPLC柱上进一步分馏。最后，约4.5 mg近100%纯hctRNA卢从6g湿电池开始获得。分离的hctRNA卢作为hctRNA的熔点具有更高的热稳定性卢比其转录物的温度高15°C（数据未显示）。
在hcLeuRS催化的氨酰化反应中，重组hctRNA卢在大肠杆菌是最有效的底物。这个k个猫值（2.56 s−1)对于hctRNA卢与…隔离大肠杆菌与粗小牛肝tRNA（0.28 s）相比，其分别高出9.1、7.8和5.7倍−1)，hctRNA卢成绩单（0.33秒−1)、和Ec公司tRNA卢（0.45秒−1)分别是。这个K（K）米四种tRNA的值最低卢s和当前hcLeuRS对hctRNA的催化效率卢比tRNA以上的高23、10和4倍卢s、 分别(). 因此，人类LeuRS和tRNA的表达卢在里面大肠杆菌导致系统的效率与Ec公司LeuRS用于Ec公司tRNA卢(14). 总的来说，这些结果表明hctRNA的过度表达卢是用于氨酰化和编辑研究的hcLeuRS的合格底物。
我们还分析了hcLeuRS在大肠杆菌氨基酰化反应中的亮氨酸和ATP，并与杆状病毒中表达的酶进行比较(33). 虽然k个猫值几乎相同K（K）M（M）亮氨酸和ATP的值都降低了，表明酶与这些底物的结合更紧密。这导致了催化效率的提高(k个猫/K（K）M（M）)ATP的氨酰化反应为60.4倍，亮氨酸的氨酰反应为22.6倍()证实该酶在大肠杆菌具有强大的活性，是后续研究的理想选择。
表2。
hcLeuRS的动力学常数由大肠杆菌氨酰化反应中的杆状病毒
| 基板 | 常量 | hcLeuRS（来自大肠杆菌) | hcLeuRS公司一（来自杆状病毒） |
|---|
| 亮氨酸 | K（K）M（M）（µM） | 2.97 ± 0.07 | 7.5±0.2 |
| k个猫（个）−1) | 2.69 ± 0.03 | 0.30 ± 0.04 |
| k个猫/K（K）M（M）（个）−1百万分之一） | 905.7 | 40 |
| 列车自动防护系统 | K（K）M（M）（µM） | 112.1 ± 2.1 | 773 ± 70 |
| k个猫（个）−1) | 2.37 ± 0.03 | 0.27±0.01 |
| k个猫/K（K）M（M）（个）−1百万分之一） | 21.14 | 0.35 |
HcLeuRS使几种非同源氨基酸失活
先前已经表明，Ile和Met以及非标准氨基酸去甲缬氨酸（Nva）和α-氨基丁酸（ABA）被LeuRS误激活(5,14,42,43). 其中，ABA是最小的分子，Nva是与Leu最相似的类似物。在活化反应中测定了这些氨基酸的hcLeuRS动力学参数；然而，镁2+/ATP比率从0.5提高到优化(33)进行分析之前。因此，这导致了k个猫从0.8秒到25.8秒−1，该值远高于最近公布的2.1秒的值−1（用Mg测量2+/ATP比率为10）(34). 非同源氨基酸激活试验表明，Ile和Met被人酶激活较差(). 在本研究中，Ile的失活频率低于蛋白质生物合成中的误译频率（1/3300）(44)这表明hcLeuRS不需要编辑机制来防止这种氨基酸的误充电。另一方面，hcLeuRS更有效地使Met失活，这表明氨基酸应该被编辑体内防止误入新生蛋白质().
表3。
hcLeuRS野生型和D399A突变体在氨基酸活化反应中的动力学常数
| hcLeuRS公司 | 氨基酸 | K（K）M（M）（µM） | k个猫（个）−1) | k个猫/K（K）M（M）（个）−1百万分之一−1) | 歧视因素一 |
|---|
| 重量 | 卢 | 45.6 ± 9.5 | 25.8 ± 1.5 | 565 | 1 |
| 伊利 | 1248 ± 254 | 0.162 ± 0.028 | 0.13 | 4346 |
| 遇见 | 1547 ± 334 | 0.474 ± 0.130 | 0.31 | 1823 |
| Nva公司 | 2195 ± 68 | 12.4 ± 0.5 | 5.65 | 100 |
| 美国律师协会 | 36 200 ± 2600 | 3.91 ± 0.15 | 0.108 | 5231 |
| D399A型 | 卢 | 50.0±8.8 | 26.2 ± 0.9 | 524 | 1 |
| Nva公司 | 5135 ± 553 | 13.7 ± 1.9 | 2.67 | 196 |
| 美国律师协会 | 49 440 ± 7350 | 4.1 ± 0.1 | 0.083 | 6313 |
在非标准氨基酸中，Nva是最有效的失活化合物。与亮氨酸相比，HcLeuRS对Nva的识别因子约为100。这个k个猫Nva的激活率仅为Leu的一半左右，主要影响是Nva激活率增加了48倍K（K）M（M）与Leu相比。这个k个猫ABA失活值远高于Ile和Met，仅比Leu低6.6倍。然而，由于催化效率非常低K（K）M（M）ABA的hcLeuRS值约为Leu的800倍(). 总之，这些数据表明hcLeuRS的合成位点可以容纳各种非同源氨基酸。这也表明，这种酶可能进化出了校对途径，以消除失活的化合物，从而防止遗传密码的模糊。
Nva主要由tRNA-依赖机制编辑
每次非同源氨基酸被LeuRS激活并水解时，一分子ATP转化为AMP。连续几轮激活/编辑导致AMP分子积累，可通过薄层色谱（TLC）进行追踪。TLC也可用于监测氨酰腺苷酸的形成(41). 为了进行编辑分析，酶与α-[32P] ATP、非同源氨基酸和tRNA卢将编辑混合物的等分样品淬火，并应用于PEI TLC板和[32P] 计算hcLeuRS和突变衍生物的AMP生成率(,). 在检测中，同源Leu诱导了极低水平的AMP，这与Leu被激活但未被LeuRS编辑的事实一致(补充图S1).
形成[32P] AMP和AA-[32P] AMP由hcLeuRS催化。反应用(A类)Nva或(B类)缺乏ABA（-tRNA卢)或存在（+tRNA卢)tRNA的卢图中显示了tRNA存在时AMP形成的量化卢（开放圆）和不存在（闭合圆）。
表4。
hcLeuRS及其D399A突变体在AMP和aa-AMP合成反应中的稳态常数观察
| hcLeuRS公司 | 氨基酸 | tRNA卢 | AN2690型 | AMP形成k个光突发事件（个）−1) | AA-AMP形成k个光突发事件（个）−1) |
|---|
| 重量 | Nva公司 | − | − | (1.19 ± 0.12) × 10−1 | (1.21 ± 0.12) × 10−2 |
| Nva公司 | + | − | 1.57 ± 0.08 | 第 |
| Nva公司 | − | + | (1.16 ± 0.09) × 10−1 | (1.29 ± 0.19) × 10−2 |
| Nva公司 | + | + | (2.52 ± 0.31) × 10−1 | （0.46±0.08）×10−2 |
| 卢 | − | − | (5.27 ± 0.68) × 10−3 | 第 |
| 卢 | + | − | (9.85 ± 1.31) × 10−3 | 第 |
| 美国律师协会 | − | − | (3.19 ± 0.28) × 10−2 | (3.27 ± 0.41) × 10−3 |
| 美国律师协会 | + | − | (8.69 ± 1.11) × 10−2 | 第 |
| 美国律师协会 | − | + | (3.47 ± 0.24) × 10−2 | (3.77 ± 0.83) × 10−3 |
| 美国律师协会 | + | + | (7.82 ± 1.72) × 10−2 | 第 |
| D399A型 | Nva公司 | − | − | （9.91±2.10）×10−2 | (0.71 ± 0.13) × 10−2 |
| Nva公司 | + | − | (1.03 ± 0.25) × 10−1 | (0.72 ± 0.09) × 10−2 |
| 美国律师协会 | − | − | (1.31 ± 0.33) × 10−2 | (5.46 ± 1.09) × 10−4 |
| 美国律师协会 | + | − | （3.11±0.87）×10−2 | (2.09 ± 0.28) × 10−3 |
由于与Ile和Met相比，Nva的失活率相对较高，因此首次对其编辑进行了分析。在没有tRNA的情况下，Nva的AMP生成速率达到0.119秒−1理论上，这种AMP的形成主要对应于tRNA依赖的前转换编辑活性，这增加了释放的腺苷酸分子（1.63×10−4 秒−1,补充图S2). tRNA的存在卢在活化反应中，混合物将AMP的形成刺激了约13倍（1.57 s−1). 这表明hcLeuRS具有较强的tRNA依赖性编辑活性，占总编辑活性的92%以上。结果与通过超嗜热菌相同条件下的LeuRS和Nva(28,45).
TLC板也显示了在缺乏tRNA的情况下Nva-AMP的积累卢当酶只表现出tRNA-依赖性的翻译前编辑(A、，). Nva-AMP的浓度超过了酶的浓度，这表明它是由多次翻转和溶液释放造成的。然而，当tRNA卢出现时，Nva-AMP不再累积，这表明它在转移到tRNA后被更有效地编辑，或者通过tRNA依赖的预转移编辑。
Nva编辑路径的分离
为了更彻底地研究Nva的编辑途径，并分离由转移后编辑和tRNA-依赖性转移前编辑产生的AMP形成，进行了另外两项分析。
首先，在最近鉴定的苯并恶硼类抗真菌化合物AN2690存在下进行AMP形成测定。该分子通过与tRNA的3′-腺苷形成共价加合物来特异靶向LeuRS卢在转移后编辑网站(46,47). 在该复合物中，tRNA被锁定在非活性构象中，用于氨酰化和转移后编辑(46,47)而tRNA-依赖或独立的翻译前编辑路径保持不变。在本研究中，对AN2690进行了抗人类LeuRS的测试，结果表明AN2690能够抑制Leu-tRNA卢如之前所观察到的真菌LeuRS的形成(46)和大肠杆菌LeuRS公司(19). 使用100µM的AN2690，hcLeuRS的氨酰化活性显著降低，充电平台未达到20%(A） ●●●●。同样，错充Met-tRNA的水解能力卢在AN2690的存在下大幅减少(B） ●●●●。这些效应与之前的结果一致，并证实了将tRNA受体末端锁定到编辑位点对氨酰化和转移后编辑活动都有害。相反，当在Nva和AN2690存在的编辑条件下测量AMP形成时，tRNA（0.252 s）观察到AMP形成的刺激−1)与没有tRNA的反应相比（0.116 s−1) (,C和D）。这表明，在AN2690存在下，tRNA依赖的编辑通路仍然活跃，并且该通路应该是一条前转换通路，因为tRNA的受体末端被锁定在一个不活跃的构象中。这也表明，tRNA依赖性转移前编辑需要编辑位点的tRNA结合，这是先前对大肠杆菌LeuRS公司(19).
AN2690对hcLeuRS氨基酰化和编辑特性的影响(A类)10µM tRNA的氨酰化卢在有或无AN2690（100µM）的情况下，通过25 nM hcLeuRS。(B类)1µM Met-tRNA的水解卢在5µM tRNA存在下，通过25 nM hcLeuRS（闭合圈）卢（开口三角形），或在存在5µM tRNA的情况下卢和100µM AN2690（方形闭合）。Met-tRNA的自发水解卢在100µM AN2690（开环）存在下也呈现。(C类)存在或不存在tRNA（5µM tRNA）时AMP的形成卢)使用100µM AN2690和10 mM Nva。(天)在存在（开环）或不存在（闭环）tRNA的情况下（C）中所示TLC数据的图形表示卢.
其次，使用CP1突变来消除转移后编辑路径。hcLeuRS中的残基D399是保守氨基酸残基，与hcLeuR中的D345同源大肠杆菌(48)，D419在酵母细胞质LeuRS（ycLeuRS）中(49)和D373英寸超嗜热菌LeuRS公司(澳大利亚LeuRS）(28). 在嗜热菌LeuRS，该天冬氨酸残基与转移前和转移后类似物中Nva部分的氨基形成盐桥相互作用(48). 在LeuRS中，这种不变的天冬氨酸残基的突变使转移后编辑失活(28,34,49). 我们将hcLeuRS的保守D399突变为A，以获得hcLeuRS-D399A，并测量D399A突变的氨基酸活化、tRNA充电和编辑活性。HcLeuRS-D399A对Leu的氨基酸活化具有完全活性(). hcLeuRS-D399A的转移后编辑活性也通过以下方法测定：[三H] -Met-tRNA卢在2分钟内，野生型hcLeuRS（25 nM）将60%的Met-tRNA脱乙酰卢; 然而，D399A未能水解Met-tRNA卢在相同条件下(A）(28,34,49). 与野生型hcLeuRS相比，hcLeuRS-D399A转移后编辑活性的明显丧失伴随着失基活性的增加(B） ●●●●。综上所述，这些结果表明，保守的天冬氨酸残基对hcLeuRS的转移后编辑和酶的保真度至关重要，因为其突变形成了大量的误充tRNA。这与之前报道的研究一致澳大利亚LeuRS、hcLeuRS，Ec公司LeuRS和ycLeuRS(28,34,48,49). 此外，在编辑条件下分析了野生型LeuRS和突变型hcLeuRS-D399A催化的AMP形成。hcLeuRS-D399A催化的AMP形成速率与野生型酶几乎相同(k个光突发事件0.0991秒−1与0.119秒相比−1)带有Nva并且没有tRNA(A、，). 因此，CP1突变并没有改变tRNA依赖性编辑过程。在存在tRNA和Nva的情况下，hcLeuRS-D399A的AMP形成仅比不存在tRNA的AMP生成略有增加(k个光突发事件0.103秒−1和0.0991秒−1表明tRNA依赖性编辑活动受到CP1结构域突变的影响，因为k个光突发事件野生型hcLeuRS携带tRNA的AMP生成量比不携带tRNA时增加了13倍。
D399A突变对hcLeuRS编辑特性的影响。（A）)Met-tRNA的水解卢25 nM hcLeuRS（闭合圆）和hcLeuRS-D399A（开放圆）。(B类)Met-tRNA的产生卢通过1.5µM hcLeuRS（闭合圈）和D399A突变体（开放圈）。
形成[32P] AMP和AA-[32P] 由hcLeuRS-D399A催化的AMP。[32P] ATP、[32P] AMP、AA-[32P] AMP通过TLC分离。反应是用(A类)Nva和(B类)在缺乏（-tRNA）的情况下，通过hcLeuRS-D399A进行ABA卢)或存在（+tRNA卢)tRNA的卢图中显示了tRNA存在时AMP形成的量化卢（开环）和不开环（闭环）。
结果表明，转移前途径约占总编辑的15%，并且在tRNA依赖性（占总编辑的9%）和tRNA非依赖性（7%）机制之间几乎相等。转移后的途径更为重要，占总编辑的84%(A） ●●●●。
hcLeuRS用于编辑Nva和ABA的不同编辑路径的相对贡献摘要。HcLeuRS编辑(A类)Nva主要通过转移后编辑进行编辑，而主要使用转移前编辑进行编辑(B类)美国律师协会。在tRNA存在的情况下，全局编辑活性被测量为AMP形成。在不存在tRNA的情况下，tRNA非依赖性预转移编辑的贡献被测量。tRNA依赖性预转移编辑的贡献由在AN2690化合物存在的情况下测量的AMP形成推导出。在全球编辑中，转移后编辑占了左侧。
ABA主要通过翻译前编辑路径进行编辑
为了检查hcLeuRS是否使用相同的编辑路径编辑其他非同源氨基酸，在存在ABA的情况下重复先前的分析。ABA对含有缺乏编辑活性的ValRS或LeuRS的细菌细胞产生毒性(42,50). 这一观察强烈表明ABA被激活体内然后在进入蛋白质合成之前转移到相应的tRNA上。我们分析了在ABA存在下hcLeuRS的编辑反应(B） ；然而，与Nva、Ile和Met相比，在ATP–PPi交换反应中测得的活化反应的催化效率非常低在体外(). 这主要是由于K（K）M（M）对于达到36 mM的ABA。为了绕过这个问题，在编辑分析中ABA的浓度增加到15 mM。在这些条件下，AMP的形成速度达到0.0319 s−1和0.0869秒−1分别在tRNA缺失和存在的情况下(). 与Nva编辑（7%）相比，ABA编辑通过tRNA-independent途径产生更多AMP，占总编辑途径的37%（3.19/8.69）。这一结果表明hcLeuRS可以根据氨基酸的同一性来调节其对编辑路径的偏好。
编辑试验也在AN2690的存在下进行测量，AN2690抑制tRNA转移后编辑。AMP形成率为0.0347 s−1和0.0782秒−1分别在tRNA缺失和存在的情况下(,补充图S1). 根据这些数据，tRNA-dependent pre-transfer editing pathway对总编辑活动的贡献率为50%[（7.82−3.47）/8.69]，而post-transfer edition pathways仅为10%[（8.69−7.82）/8.69]，表明hcLeuRS更喜欢pre-transper editings pathwayr而不是编辑ABA(B） ●●●●。
用hcLeuRS-D399A突变株检测ABA存在下AMP的形成(B） ●●●●。在没有tRNA的情况下，与野生型hcLeuRS相比，编辑活动减少（0.0131 s−1和0.0319秒−1）。D399A突变体AMP形成率的降低可能部分由以下因素引起K（K）M（M）ABA的激活率(). 在tRNA存在的情况下，k个光突发事件通过hcLeuRS-D399A编辑ABA的AMP形成的时间增加到0.0311s−1。D399A突变破坏了转移后的编辑。因为它对tRNA依赖性编辑的影响较小，所以翻译前编辑对ABA更为重要。
在没有tRNA的情况下，会形成大量的ABA-AMP，其形成速率为AMP形成速率的十分之一(B） ●●●●。在试验中，ABA-AMP浓度超过了酶浓度，这意味着它在溶液中释放，在溶液中发现它以4.63×10的速率自发水解−4 秒−1(补充图S2). 这大大低于tRNA-independent AMP的形成速率（0.0319 s−1). 同样，当tRNA卢添加到编辑溶液中，非同源腺苷酸没有积累，这表明它是通过tRNA依赖的过程编辑的().
Nva-/ABA-tRNA卢可由hcLeuRS-D399A突变体形成
Nva和ABA不是放射性标记化合物，因此tRNA是不可商业化的卢用Nva和ABA充电不能用常规方法测量。我们使用了一种高度敏感的分析方法来直接测定Nva-tRNA的形成卢和ABA-tRNA卢，它基于内部32tRNA最后一个磷酸键的P标记(40,41). 3′端氨酰化后32P-标记的tRNA，tRNA被核酸酶P1水解，含有带电tRNA的标记氨酰AMP和未带电tRNA中的标记AMP的混合物通过TLC分离。
HcLeuRS-D399A能催化tRNA的氨酰化卢与Nva或ABA形成Nva-tRNA或ABA-tRNA，在薄板上清晰可见(). 另一方面，野生型hcLeuRS只能形成Leu-tRNA卢基于TLC板上看到的是Leu-AMP带而不是ABA-AMP带这一事实。此外，ABA-AMP的缺失与来自表明天然LeuRS能与ABA-tRNA或失活的ABA有效水解。综上所述，这些数据表明Nva和ABA等非同源氨基酸可能被带到tRNA上卢当hcLeuRS的转移后编辑功能被破坏时，这与之前的一致体内中的个结果大肠杆菌(43,50,51). 对于ABA编辑来说，尽管前转换途径占主导地位，但后转换途径仍然是防止hcLeuRS误收费的必要途径。
hctRNA的氨酰化卢由hcLeuRS或hcLeuRS-D399A执行Leu、Nva和ABA。用5µM进行氨基酰化32P标记的hctRNA卢、5 mM Leu或10 mM Nva或15 mM ABA分别乘以1.5µM hcLeuRS-D399A或500 nM hcLeu RS。氨酰化反应的核酸酶P1消化后，用TLC分离AMP（来自未带电tRNA）和氨酰基-AMP（来自氨酰基-tRNA）。
讨论
hcLeuRS和hctRNA卢以表示大肠杆菌为研究hcLeuRS功能提供了一个有效的系统
在哺乳动物中，细胞质LeuRS是MSC的八个组成部分之一。hcLeuRS的性质以前只进行了部分研究。我们实验室已经报道了从昆虫细胞中表达和纯化重组hcLeuRS(33). 该hcLeuRS具有高比活性，其C末端延伸对与hcArgRS N末端延伸的相互作用至关重要(33). 为了进一步评估hcLeuRS的编辑特性，我们简化了其表达和纯化方法。本制剂得自大肠杆菌转化子并在镍上通过亲和层析纯化2+-NTA列。与以前的杆状病毒系统制备相比，其氨基酸活化和tRNA的氨酰化活性卢快速方案和最佳镁离子浓度显著提高了转录本2+/ATP比率。HcLeuRS对hctRNA具有极高的充电催化效率卢从…中提纯大肠杆菌高产菌株，比tRNA高8倍卢成绩单(). 转移RNA参与遗传密码的翻译以及基因表达调控(52,53). 众所周知，tRNA的修饰碱基对tRNA的结构和功能非常重要(54–57). 修饰碱基可能限制tRNA结构(55)并提供与酶相互作用的基团(58–60). 人细胞质tRNA卢与…隔离大肠杆菌转化子表现出较高的热稳定性和较高的接受能力，虽然我们没有直接研究tRNA结构，但这可能是由于在表达过程中一些核苷酸发生了修饰.因此，我们现在的hcLeuRS和hctRNA卢与隔离大肠杆菌转化子为研究hcLeuRS的功能和三级结构提供了一个有效的系统，这将有助于设计针对病原菌LeuRS合成和编辑活性位点的新型选择性抗生素。
HcLeuRS使Nva和ABA失活
LeuRS与IleRS和ValRS密切相关，属于Ia类合成酶的LIV-RS亚群(1). Leu、Ile和Val是疏水性氨基酸，略有不同。顺便提一下，当发生失活错误时，IleRS必须消除非同源氨基酸缬氨酸(10). ValRS编辑非同源的等位苏氨酸，其区别仅在于羟基(12)而LeuRS必须将亮氨酸与tRNA上错误充电的异亮氨酸和蛋氨酸区分开来卢(14). 除了这些氨基酸外，各种非蛋白氨基酸也被LeuRS激活(13). 本文研究了hcLeuRS对两种非蛋白氨基酸的活化特性。首先，选择Nva是因为这种化合物是天然存在的体内(61,62)，并且可以结合到蛋白质中(51). 与Leu相比，Nva因缺少单一甲基而不同，因此被hcLeuRS失活，与Leu相比较，其催化效率损失仅为100倍(). 这一损失主要是由于K（K）M（M）该效应对应的结合能变化仅为2.7 kcal/mol，这与甲基与疏水结合位点相互作用预期的范德瓦尔斯力损失一致。HcLeuRS和大肠杆菌或超嗜热菌LeuRS表现出几乎相同的结合能变化(19,28)这表明Nva以类似的方式与这三种酶结合并反应。
同时，分析了LeuRS对ABA的误激活。ABA已被证明在大肠杆菌显示ValRS和LeuRS的细胞缺乏编辑活动(42,50)这表明ABA在被tRNA充电之前被错误激活卢并随后并入蛋白质中。因此，研究了hcLeuRS对ABA的激活作用。由于ABA小于Leu和Nva，预测LeuRS的活性位点不应有空间位阻k个猫活化反应中ABA的hcLeuRS减少，但与k个猫对于Leu。另一方面K（K）M（M）亮氨酸的ABA增加了800倍，这表明在较小分子（5 kcal/mol）的结合过程中损失了部分结合能。总之，这些结果表明Nva和ABA可能被hcLeuRS激活体内尤其是当这些化合物的浓度很高时，因此可能需要编辑机制来清除失活或误充的产物。
Nva优先通过转移后编辑路径进行编辑
目前的研究表明，hcLeuRS使用了几种编辑途径来排除错误的产品。tRNA-依赖性编辑途径形成了最高数量的AMP（93%），而tRNA--依赖性编辑路径仅占根据动力学参数计算的AMP形成的7%基本上，tRNA依赖性编辑途径包括tRNA依赖的前转换和后转换编辑(19). tRNA-independent editing pathways组tRNA-independent pre-transfer pathway和非同源物在溶液中释放后的自发水解。由于最近开发的抗真菌药物AN2690，有可能特异性抑制转移后编辑反应并分离tRNA依赖的转移前编辑反应(46,47). 通过这种方式，发现tRNA依赖性前转换编辑反应占总AMP形成量的9%，该值接近在缺乏tRNA的情况下测量的tRNA依赖型前转换编辑（7%）。与转移后编辑相比，这两种反应相当低，转移后编辑约占编辑Nva的AMP形成的84%。最后一条途径，非酶水解或“动力学校对”(30,63)用ATP诱导追逐来测量。根据以往对白血病的研究(19,28)，该途径也是hcLeuRS的次要编辑途径(补充图S2)并导致AMP总生成率小于1%。编辑活动在三个主要途径中的划分可能不是静态的，而是随着生理条件的变化和适应而变化的。在此，通过不同的方法关闭其他通路（编辑位点的D399A突变、AN2690化合物和tRNA缺失），获得每条通路的定量。可能是为了响应一条编辑路径的抑制，另一条可能已被激活，如前所述(64). 总的来说，这些百分比不应被视为确定值，但它们突出了酶资源，以消除不正确的中间产物或产品。
ABA主要由翻译前编辑机制编辑
在ABA存在下进行的AMP形成测定仅受到tRNA的微弱刺激卢与Nva进行的类似分析相比。在存在靶向转移后编辑反应的tRNA和AN2690的情况下，与没有AN2690反应相比，AMP形成率略有下降（0.0782 vs.0.0869 s−1). 这表明，当hcLeuRS的转移后编辑通路被AN2690阻断时，tRNA-依赖的转移前编辑通路是ABA编辑的唯一贡献者。此外，我们可以估计，转移后途径只占编辑的10%。在这里，我们表明ABA可以被hcLeuRS激活以形成ABA-AMP(B） ●●●●。此外，我们使用了一种敏感的检测方法来确定错误充血的产物（Nva-或ABA-tRNA卢)基于tRNA的3′-最后一个磷酸盐的标记卢tRNA核苷酸转移酶。数据表明，Nva和ABA可以被编辑缺陷酶而非天然酶带到tRNA上()，因为hcLeuRS-D399A降低了编辑Nva和ABA的活性。虽然转移后编辑ABA的活动仅占天然hcLeuRS总编辑活动的10%，但这种活动足以使ABA脱乙酰。相反，hcLeuRS-D399A被剥夺了转移后编辑功能，并积累了ABA-tRNA。结果表明，转移后编辑是维持aaRS氨酰化保真度的最后一个但至关重要的检查点，即使它只占总编辑活动的一小部分。因此，转移后编辑是必要的，编辑活动的轻微减少可能会影响aaRS合成的氨酰化产物。研究表明，细胞内错误增压产物的积累会导致错误翻译，进而导致细胞死亡，从而导致神经变性等疾病(65,66).
酶编辑特性对不同失活产物的适应性
我们目前的研究表明，酶的编辑特性不会被冻结，但根据要编辑的化合物的不同，其编辑特性可能会有很大差异。对于Nva，hcLeuRS表现出明显的转移后编辑偏好。然而，对于ABA，酶主要用于翻译前编辑。编辑非同源化合物的这些不同偏好突出了aaRS编辑路径的模块化特征。
转移前和转移后的编辑反应通常分别被认为是氨基酸活化和氨酰化反应的清除机制。我们可以合理地假设，失活的化合物可以通过预转换机制进行编辑，也可以首先从酶中释放出来（动力学校对）。非同源激活的氨基酸也可以被带电产生二酰化的tRNA，并通过转移后途径在一个特殊的编辑域中脱乙酰。因此，酶对通路的偏好将直接取决于非同源氨基酸被激活和充电的能力，以及其在不同编辑检查点被消除的能力(19,28,30,67–69). 对I类Ile-和ValRS以及II类ThrRS进行的预稳态动力学最近证实，转移前和转移后编辑的贡献受到氨基酰转移速率的调节(70)导致了两条路径之间的动力学分割概念(71). 因此，使用不同非同源氨基酸的预稳态动力学可能有助于确定不同编辑途径中的哪一种是优选途径(70).
转移后的编辑机制相对来说是众所周知和被接受的，而不同的转移前编辑机制也在积极讨论之中。翻译前编辑位点的精确位置和tRNA的功能不确定，在CP1编辑域上的位点之间振荡(15,48,72–74)或在合成域上(24,31,75). 其中，在AN2690和tRNA存在下，天然hcLeuRS的AMP形成率表明，当tRNA以非活性构象被阻断到CP1编辑位点时，tRNA依赖的翻译前编辑反应仍然存在。这一结果表明，由于CP1编辑位点受AN2690的约束，tRNA依赖的翻译前编辑反应更有可能发生在合成位点。突变体D399A的编辑特性也支持这一结论。尽管突变株的转移后编辑丢失，但tRNA的存在刺激了ABA编辑，正如tRNA依赖的转移前编辑反应所预期的那样。总之，这些数据强烈表明，合成活性位点还包含tRNA依赖性转译前编辑催化发生的编辑位点。
总之，我们的数据表明，翻译前编辑优先针对一些非同源氨基酸，而翻译后编辑对其他结构相关的非同源氨基酸更有效。这种偏好可能是由于非同源氨基酸被带到tRNA上的能力。这可能解释了hcLeuRS倾向于用Nva进行转移后编辑和用ABA进行转移前编辑。我们目前正在研究各种非同源氨基酸的hcLeuRS编辑特性，以确认这一结果。
